Microbiota van attine mierentuinen: visualisatie van een microbieel landschap door scanning elektronenmicroscopie

We onderzoeken de microbiota die in schimmeltuinen leven op schimmelgroeiende mieren. We willen weten wie ze zijn en hoe ze dit microbiële ecosysteem organiseren. In het bijzonder willen we weten hoe de microbiota fysiek interageert met de schimmel die de mieren kweken.

En deze interacties worden meestal gemedieerd door biofilm. De microbiële tuinen die door de mieren worden gecultiveerd, zijn een complex en heterogeen monster dat is samengesteld uit de gekweekte schimmel, het substraat dat is toegevoegd voor de teelt en de microbiota. Behalve dat het erg delicaat is, is het een uitdaging om methoden te vinden die alle tuincomponenten bewaren voor beeldvorming.

Onze bevindingen suggereren dat de microbiota de structuren van de schimmeltuin integreert, wat ook ondersteunt dat ze kunnen deelnemen aan de fysiologische reacties van deze omgeving. En we leveren ook het bewijs dat biofilms belangrijk zijn voor deze interacties. Ons protocol behoudt schimmelstructuren in biofilms en vereenvoudigt andere processen.

Toch behoudt het de delicate tuinstructuur, wordt de fysieke interactie van de microbiota verder gedetailleerd en wordt de ruimtelijke structuur van biofilm onthuld. Biofilms zijn cellulaire systemen waarin micro-organismen ingebed in een EPS-matrix sociale netwerken vormen. Scanning elektromicroscopie stelt ons in staat om in ongekend detail te observeren hoe de microbiota zich ruimtelijk organiseren in de schimmeltuin, de omliggende schimmeldraden en over het hele substraat.

Wij zijn van mening dat de voorbereidingsstappen die we hier voorstellen, op grote schaal zullen worden toegepast om studies in andere microbiële ecosystemen te verfijnen. Zoek en markeer om te beginnen de kolonie van de attinemierensoorten. Graaf een greppel rond het nestgebied totdat de tuinkamer bloot komt te liggen.

Open de tuinkamer zijdelings om te voorkomen dat de grond over het tuinoppervlak inzakt. Verzamel met een entomologische tang zorgvuldig tuinmonsters. Breng de tuinmonsters over in een schone plastic bak met een laag gips om de luchtvochtigheid in evenwicht te brengen.

Na het overbrengen van de tuin- en mierenwerkers, sluit u de container hermetisch af om uitdroging van het monster te voorkomen. Sluit de sleuf af met de eerder verwijderde grond. Bewaar de tuinmonsters bij 23 tot 25 graden Celsius, tot verdere verwerking.

Gebruik voor het fixeren van monsters een entomologische tang om werksters, eieren, poppen en larven uit de tuinmonsters te verwijderen. Zet tuinfragmenten die niet groter zijn dan vijf kubieke millimeter opzij en voeg ze toe aan een buis van twee milliliter. Voeg vervolgens met een pasteurglazen pipet ongeveer een milliliter Karnofsky-fixeeroplossing toe aan de buisjes om de monsters volledig onder te dompelen.

Schud de buis voorzichtig om de monsters te laten weken en incubeer de monsters gedurende ten minste 24 uur bij vier graden Celsius. Verkrijg om te beginnen attine mierensoorten koloniefragmenten in Karnofsky fixatieve oplossing. Verwijder na fixatie de fixeeroplossing van Karnofsky volledig met behulp van een glazen pipet zonder het monster te verstoren.

Incubeer het monster serieel met één milliliter toenemende concentraties ethanol, zodat het monster ongestoord blijft. Nadat de ethanol volledig is verwijderd, brengt u het monster met behulp van een tang en spatel voorzichtig over in een monstercontainer voor de droger met kritieke punten. Plaats het deksel op de container en dompel deze onder in een glazen bekerglas met schaalverdeling dat voldoende 100% ethanol bevat om de container onder te dompelen.

Breng de monstercontainer vervolgens over in een ander glazen bekerglas met schaalverdeling dat voldoende 100% ethanol bevat. Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Breng de container vervolgens over naar de droger met kritieke punten.

Verkrijg om te beginnen fragmenten van de kolonie van attinemierensoorten die zijn onderworpen aan kritische puntdroging. Om de monsterhouders voor te bereiden, wikkelt u de stompjes in een stuk aluminiumfolie en bedekt u alleen de bovenkant. Schrijf de voorbeeldcode of het nummer op de onderkant van elke stomp om ze te identificeren, voordat u het bovenste deel van de stompjes bedekt met dubbelzijdige carbontape.

Open vervolgens het deksel van de monstercontainer en breng het gedroogde monster voorzichtig met een tang en een spatel over in een glazen petrischaaltje. Plaats voorzichtig fragmenten van het tuinmonster op het plakkerige oppervlak van de met tape bedekte stomp. Na het sputteren met goud, plaatst u de stompjes in de monsterhouder voor scanning-elektronenmicroscopie.

Gebruik de opties op het scherm of de handmatige bediening om de vergroting en beeldpositie aan te passen. Verplaats de fase om een uitgebreid beeld van het monster te krijgen. Gebruik de RDC-functie om u op specifieke gebieden te concentreren.

Pas bij het observeren van een interessante structuur de vergroting, focus, helderheid, contrast en stigmatisering dienovereenkomstig aan. Voor de juiste stigmatisering verplaatst u met behulp van de handmatige gebruikersinterface het podium in de X- en Y-richting. Pas de rastersnelheid aan om de resolutie van de afbeelding te controleren.

Pas de vergroting aan op basis van het onderdeel dat wordt afgebeeld. Om de afbeelding op te slaan, gebruikt u de bevriezingsfunctie en klikt u op het fotopictogram. Stel het bestandspad in voor het opslaan van de afbeelding.

Analyseer ten slotte ten minste drie tuinfragmenten en maak beelden op alle genoemde vergrotingsbereiken. Schimmeldraden in attinetuinen werden waargenomen als intacte buisvormige structuren die het substraatoppervlak bedekten, wat wijst op een effectieve monstervoorbereiding. Verspreide biofilms bestonden uit microbiële cellen die een dunne laag van één tot drie cellen vormden die het substraatoppervlak bedekte.