Kwantificering van driedimensionale celmigratie binnen en in granulaire hydrogel biomaterialen

Ons onderzoek richt zich op het gebruik van de unieke eigenschappen van granulaire hydrogels om celbeweging en functies voor weefselregeneratie te onderzoeken. Celrespons op de micro-omgeving is belangrijk om te modelleren om de implicaties voor translationele impact te begrijpen. Naarmate het gebruik van 3D-poortsteigers toeneemt, neemt ook de behoefte toe aan uitgebreide 3D-migratietests die het celgedrag beter repliceren in een wondgenezingsomgeving.

We hebben twee pijplijnen ontwikkeld die driedimensionaal zijn, van steigerontwikkeling tot beeldvorming en analyse, voor het onderzoeken van celbeweging en migratie in vitro. Met deze twee nieuwe testen hebben we de mogelijkheid gekregen om de responsieve cellen te volgen in twee verschillende stadia van wondgenezing: initiële scaffold-infiltratie van bulkweefsel en celbeweging zodra deze is omgeven door een complexe scaffold. Om te beginnen, plaat 120.000 menselijke dermale fibroblastcellen per vierkante centimeter in ten minste zes putjes van een plaat met 96 putjes.

Verwijder na een nacht incubatie de media uit de celputjes met behulp van een aspirator of pipet. Voeg de kleurstof in 20 microliter van elke gelconditie toe aan de putjes met behulp van een verdringingspipet. Gebruik een plaatcentrifuge-opzetstuk dat is ingesteld op 25 graden Celsius en draai de plaat gedurende 15 seconden op 100 g met versnelling en vertraging ingesteld op 8 om de gel plat te maken.

Draai de plaat 180 graden om en draai opnieuw om een gelijkmatige gelverdeling over de bodem van de put te garanderen. Om de gel aseptisch te verknopen, past u gedurende 365 seconden gericht licht toe op 30 nanometer om de steiger uit te gloeien. Nadat alle steigers zijn gevormd, voeg je 200 microliter media toe aan elk putje en incubeer je gedurende 37 minuten bij 30 graden Celsius.

Gebruik een confocale microscoop om de cellen in beeld te brengen en hun migratiegedrag vast te leggen. Open voor beeldanalyse de Imaris Image Conversion Software voor batchconversies. Sleep microscopie-afbeeldingen naar de conversiesoftware en selecteer een map in de software-arena om de bestanden te importeren.

Selecteer elk bestand afzonderlijk om de Voxel-grootte in te stellen. Druk op Alles starten om de conversie te starten. Selecteer vervolgens in de Imaris Arena-software een afbeelding uit de arena om te beginnen met verwerken.

Klik op het tabblad Image Pros in de hoofdwerkbalk. Klik nu op het vervolgkeuzemenu voor Kanaal 1 en selecteer Achtergrond Aftrekken. Druk op OK om terug te keren naar de 3D-weergave.

Klik op de kleine werkbalk op het pictogram met afgeronde blauwe vormen met het label Nieuwe oppervlakken toevoegen om een tabblad met bewerkbare objecten met de naam Oppervlakken 1 te maken. Genereer handmatig parameters voor alle replica's met behulp van de blauwe pijlknop. Stel de oppervlaktedetails in op 0,7 micrometer en selecteer Achtergrond Aftrekken, Lokaal contrast.

Voer de gemiddelde cellengte in de diameter van de grootste bol in, die in het objectvak past. Bepaal voor drempelwaarde het intensiteitshistogram om alleen de helderste cellen te segmenteren. Schakel Objecten splitsen aanraken, Regio groeien in en stel de diameter van de zaadpunten in op de eerder gebruikte diameter.

Als u de creatieparameters voor batchanalyse wilt opslaan, klikt u op het toverstokpictogram met het label Creatie. Klik op parameters opslaan voor batch, geef het bestand een naam en klik op OK. Voor het verzamelen van alle celhoogtes klikt u op het tabblad Detailmatig. Selecteer specifieke waarden en vervolgens Positie Z in de vervolgkeuzemenu's.

Klik op het pictogram Opslaan om alle Z-posities en classificaties naar een XLS-bestand te exporteren. Giet om te beginnen PBS in een petrischaal onder de laminaire kap en pipetteer 20 microliter druppels van de celmedia-oplossing op het omgekeerde deksel van de petrischaal. Plaats het deksel terug op de schaal en incubeer de plaat om hangende, druppelgekweekte 3D-sferoïden te verkrijgen.

Om de PLOSMA in te stellen, gebruikt u een verdringingspipet om aseptisch 15 microliter van de gel toe te voegen aan de putjes van een doorzichtige plaat met 96 putjes. Gebruik een centrifuge-opzetstuk voor het draaien van de plaat en draai de plaat gedurende 10 seconden op 1.000 g om de gel plat te maken. Draai de plaat 180 graden om en draai opnieuw om een gelijkmatige gelverdeling te garanderen.

Breng vervolgens gedurende 365 seconden 30 nanometer gefocusseerd licht aan om de steiger uit te gloeien en de gel van bovenaf te verknopen. Verplaats de petrischaal met hangende druppels aseptisch in de weefselkweekkap en keer het deksel om. Zuig met een pipet van 20 microliter langzaam een druppel op totdat de sferoïde de pipetpunt binnendringt en werp de druppel op de steiger in het midden van de put.

Incubeer de putplaat gedurende twee uur bij 37 graden Celsius zodat de sferoïden zich aan de steiger kunnen hechten. Piket na de incubatie nog eens 15 microliter gel op elke sferoïde. Centrifugeer de plaat op 300 g gedurende 15 seconden in elke richting om een gelijkmatige gelverdeling te garanderen.

Gloei de bovenste laag gel voor het gebruik van ultraviolet licht, zoals eerder gedemonstreerd. Plaats de plaat onder een confocale microscoop en breng de sferoïden in beeld na het selecteren van het laagste en het hoogste Z-vlak. Nadat u de afbeeldingen hebt geïmporteerd in de Imaris Arena-software, klikt u op het vervolgkeuzemenu voor kanaal 1 en selecteert u Achtergrond aftrekken.

Druk op OK onder aan het paneel. Druk in de 3D-weergave op Automatisch alle kanalen aanpassen in het pop-upvenster Beeldschermaanpassing en breng indien nodig correcties aan. Klik op de kleinere werkbalk op het pictogram Nieuw referentiekader toevoegen om een tabblad met de naam Referentiekader 1 te maken.

Verplaats de oorsprong naar het midden van de sferoïde in alle drie de vlakken. Klik in dezelfde werkbalk op het pictogram met oranje bollen om nieuwe vlekken toe te voegen, maak een tabblad met de naam Vlekken 1 en druk op de blauwe pijlknop om verder te gaan. Pas voor drempelwaarden het intensiteitshistogram aan om alleen de helderste delen te segmenteren.

Gebruik de slicer om door de afbeeldingsstapel te navigeren voor nauwkeurigheid. Druk drie keer op de blauwe pijl Volgende. Schakel Renderen op Slicer uit of klik op het gele vierkante pictogram in het configuratiescherm.

Klik op het tabblad Statistieken. Selecteer in de vervolgkeuzemenu's specifieke waarden en afstand tot het referentiekader van herkomst. Klik op het pictogram Opslaan.

Als u alle wijzigingen en analyses wilt opslaan, klikt u op het pictogram Opslaan in de hoofdwerkbalk. Deze methode werd gebruikt om cellulaire infiltratie op een weefselinterface te evalueren. De mediane positie in de Z-as van migrerende cellen nam significant toe van nul tot 24 uur, wat wijst op een opmerkelijke verticale celbeweging.

De vouwverandering in celmigratie langs de Z-as verdubbelde na 24 uur. Cellen die met de PLOSMA-methode waren gezaaid, vertoonden na 24 uur een significante verspreiding en migratie uit de sferoïde kern. Driedimensionale weergaven toonden uitgebreide celspreiding in de PLOSM-steiger na 24 uur, met zichtbare projecties die zich naar buiten uitstrekten.

De bewerkte 3D-beelden met behulp van de Spots-functie onthulden verspreide celposities in de steiger, wat wijst op wijdverspreide migratie. Cellen legden een gemiddelde afstand van meer dan 200 micrometer af met consistente resultaten over monsters. De Z-hoogte vouwverandering van de cellen in de PLOSMA-steiger was ongeveer 4, wat wijst op een substantiële opwaartse beweging.