Optimalisatie van de afgifte van extracellulaire blaasjes met behulp van een 3D-gebioprinte steiger met kernomhulsel voor chronische wondbehandeling

Het onderzoeksdoel is het ontwikkelen van een geavanceerd bioactief wondverbandontwerp voor effectieve chronische wondbehandeling. De steiger zorgt voor controle, degradatie en efficiënte lokale afgifte van extracellulaire blaasjes.

Het huidige protocol is bedoeld om de beperking van conventioneel wondverband bij de behandeling van chronische ontstekingen te overwinnen. In het bijzonder het gebrek aan controle, degradatie en tijdige afgifte van extracellulaire blaasjes.

Dit protocol biedt bij Tuneable de aanpak om therapeutische middelen, waaronder genen, tijdig af te leveren voor verschillende toepassingen.

Alle resultaten bieden nieuwe inzichten in het aanpassen van een steiger voor verschillende soorten wonden en het verbeteren van regeneratieve therapieën door extracellulaire blaasjes te laden met specifieke bioactieve moleculen.

Ons lab gaat een translationeel onderzoeksplatform opbouwen om diabetische wondgenezing aan te pakken.

[Verteller] Ontdooi om te beginnen snel een flesje mesenchymale stamcellen in een waterbad van 37 graden Celsius. Verwijder de injectieflacon als er een klein ijsfragment achterblijft. Breng de volledige inhoud van de injectieflacon met mesenchymale stamcellen over in een conische buis van 15 milliliter met volledig medium. Centrifugeer de cellen bij 200 G gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Zuig het bovenstaande op en resustrier de celpellet in één milliliter voorverwarmd compleet medium. Breng de cellen vervolgens over in een T25-kolf met vier milliliter volledig medium. Kantel de T25-kolf voorzichtig om ervoor te zorgen dat de cellen gelijkmatig verdeeld zijn. Incubeer de kolf bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide. Wanneer de cellen 70% tot 80% samenvloeiing hebben bereikt, zuigt u het verbruikte medium uit de T25-kolf op. Voeg drie milliliter verse PBS toe aan de kolf om eventuele resterende cellen te verwijderen. Voeg vervolgens een milliliter 0,25% trypsine-oplossing toe aan de kolf en incubeer. Bewaak de celloslating onder de microscoop met een vergroting van 4x. Voeg nu vier milliliter voorverwarmd, volledig medium toe aan de kolf en pipetteer op en neer over het oppervlak tot een loslating. Breng vervolgens de celsuspensie over in een centrifuge van 15 milliliter twee. Resuspendeer na het centrifugeren de celpellet in een vers, compleet medium en tel de cellen. Breng de cellen vervolgens over naar een T75-kolf met een zaaidichtheid van 5.000 cellen per vierkante centimeter. Incubeer de T75-kolf bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide. Verzamel na 72 uur het geconditioneerde medium uit de cellen voor extracellulaire isolatie van blaasjes. Om de extracellulaire blaasjes of EV's te isoleren, centrifugeert u de 13 milliliter verzamelde geconditioneerde media gedurende 15 minuten op 800 G om cellulair vuil te verwijderen. Gebruik een spuitfilter van 0,22 micrometer om het bovenstaande te filteren en grote deeltjes te verwijderen. Voeg nu vijf milliliter neerslagbuffer toe aan de gefilterde geconditioneerde media. Draai het mengsel grondig om ervoor te zorgen dat het homogeen is. Incubeer het mengsel een nacht bij vier graden Celsius om extracellulaire blaasjes te laten neerslaan. Centrifugeer het mengsel vervolgens 30 minuten bij 3.220 G bij 20 graden Celsius. Ervoor zorgen dat de buizen in balans zijn. Gooi het bovenstaande voorzichtig weg zonder de pellet te verstoren en centrifugeer opnieuw gedurende vijf seconden. suspendeert nu voorzichtig de EV-pellet in 200 microliter PBS om beschadiging van de blaasjes te voorkomen. Voer western blotting uit om extracellulaire blaasjesspecifieke markers te detecteren, waaronder CD63, CD81 en CD9. Bereid een verse 4,5% natriumalginaatoplossing in steriel ultrapuur water. Roer de oplossing een nacht bij 60 graden Celsius om een volledige oplossing te garanderen. Los vervolgens carboxymethylcellulose op in steriel ultrapuur water om een oplossing van 3,8% te verkrijgen. Centrifugeer de voorbereide bio-inkten gedurende 10 minuten bij 3.220 G bij 25 graden Celsius om luchtbellen te verwijderen die het printproces kunnen verstoren. Gebruik nu een spuitmixer en meng drie milliliter van de bereide natriumalginaatoplossing met geëtiketteerde EV's of de Dialymmi-controle. Meng voorzichtig goed om een gelijkmatige suspensie te garanderen. Gebruik een andere spuitmixer om een milliliter carboxymethylcellulose te combineren met vers bereide alginaatlyase-oplossing in steriel ultrapuur water om een eindconcentratie van 0,5 milli-eenheid per milliliter te bereiken. Laad tegelijkertijd de natriumalginaat EV bio-inkt in het kerngedeelte en de Carboxymethylcellulose-alginaat Lyase bio-inkt in het omhulselgedeelte van de spuitopstelling. Start de 3D bio printer software. Selecteer een cilindrische vorm met een diagonaal vulpatroon om de steigerstructuur te creëren. Stel de cilinderdiameter in op 20 millimeter en de hoogte op 1,1 millimeter. Configureer de poriegrootte tot op één millimeter. Stel de pompsnelheden van de kern en het hulsmondstuk in op één millimeter per seconde met een dikte van 0.25 millimeter per laag. Configureer de bewegingssnelheid op zes millimeter per seconde en print vier lagen bij kamertemperatuur. Gebruik een luchtbevochtiger met calciumchloride in spuitbus om de steiger tijdens het extrusieproces te verknopen. Begin met het afdrukken van de steiger op polyesterfolie. Plaats het mondstuk van de luchtbevochtiger op ongeveer 20 centimeter afstand van de extrusiekop om een effectieve verknoping te garanderen. Dompel de steiger gedurende 10 minuten onder in een calciumchlorideoplossing van 2,2% om de verknoping te voltooien. Spoel de steiger drie keer af met steriel ultrapuur water om overtollig calciumchloride en ongebonden bio-inkt te verwijderen. Scheer de dorsale huid van een verdoofde OCTA-diabetische muis met een elektrische tondeuse om huidirritatie of letsel te voorkomen. Maak nu een zes millimeter cirkelvormige huidwond van volledige dikte op het dorsale oppervlak van elke muis. Plaats voorzichtig de 3D bioprinted steiger met PKH-gelabelde extracellulaire blaasjes op het wondbed. Zorg ervoor dat de steiger het wondoppervlak volledig bedekt en druk lichtjes met een steriele tang om luchtbellen te minimaliseren. Breng verdoofde muizen twee uur, vier uur, acht uur en 24 uur na implantatie over naar het IVIS-beeldvormingssysteem. Selecteer in de beeldvormingswizard de optie voor fluorescentiebeeldvorming en activeer de excitatie- en emissiefilters voor de PKH-kleurstof. Pas de camera-instellingen aan, waaronder het gezichtsveld en de hoogte van het onderwerp, om de signaaldetectie te optimaliseren. Begin met het verkrijgen van afbeeldingen, sla de resulterende gegevens op. Laat vervolgens de fluorescerende signalen van de gelabelde EV's los. De alginaat EV's in Carboxymethylcellulose alginaat Lyase Scaffold vertoonden een sneller afgifteprofiel in vergelijking met alginaat EV's in alleen Carboxymethylcellulose, met name op de tijdstippen van twee en vier uur.