Single Nucleotide Polymorfisme-gevoelige FISH-detectie van Locus-specifieke ribosomale RNA-transcriptie in Drosophila melanogaster

Ons onderzoek richt zich op het begrijpen hoe cellen de meerdere ribosomale DNA-loci in hun genoom voelen, monitoren en reguleren. Concreet willen we de mechanismen blootleggen die onderscheiden welke rDNA-loci actief worden getranscribeerd en hoe deze loci individueel worden gereguleerd. We hebben onlangs ontdekt dat de hoeveelheid rDNA in een cel in de loop van de tijd kan veranderen, en dat deze verandering verandert welke rDNA-loci worden getranscribeerd.

We begrijpen nu dat cellen hun rDNA-transcriptie zullen veranderen op basis van de hoeveelheid rDNA die ze hebben. Deze ontdekking brengt ons ertoe ons af te vragen hoe cellen weten hoeveel ADH ze hebben en hoe ze bepalen welke rDNA-locus ze het liefst tot expressie brengen. Ons laboratorium richt zich nu op het begrijpen van het mechanisme dat cellen gebruiken om onderscheid te maken tussen verschillende rDNA-loci en -zintuigen en hun activiteit te reguleren.

Ontleed Drosophila onder een stereomicroscoop om testikels te isoleren in RNase-vrije PBS. Pak om te beginnen het midden van de buik vast met een tang en het uiteinde van de buik met een ander paar om het dier voorzichtig uit elkaar te trekken. Breng met een tang de geïsoleerde teelballen van de snijschaal over in een microfugebuis van 1,5 milliliter die 0,5 milliliter RNase-vrije PBS bevat.

Zuig de PBS op en voeg een milliliter fixatieoplossing toe. Plaats het monster 30 minuten op een nutating shaker bij kamertemperatuur. Zuig na de incubatie de fixatieoplossing op.

Was het monster vervolgens twee keer met een milliliter PBS gedurende vijf minuten op een nutating shaker. Voeg na het opzuigen van de PBS een milliliter RNase-vrije 70% ethanol toe en incubeer het monster een nacht bij vier graden Celsius op een nutating shaker. Zuig vervolgens de ethanol op en voeg een milliliter wasbuffer toe aan het monster.

Incubeer het monster gedurende drie minuten bij kamertemperatuur op een nutating shaker. Laat de tube daarna twee minuten rechtop staan. Meng de sondes en maskers met de hybridisatiebuffer om een totaal volume van 100 microliter per monster te bereiden, zoals hier weergegeven.

Voeg vervolgens 100 microliter hybridisatieoplossing toe aan het monster na het opzuigen van de wasbuffer. Breng een transparante film aan om de randen van de tube af te dichten. Wikkel de buis in aluminiumfolie om deze tegen licht te beschermen en incubeer het monster in een waterbad van 37 graden Celsius gedurende minimaal 24 uur.

Zonder de hybridisatieoplossing op te zuigen, voegt u een milliliter wasbuffer toe aan het monster. Incubeer het monster in een waterbad van 37 graden Celsius gedurende 30 minuten in het donker. Zodra de wasbuffer is aangezogen, voegt u een milliliter verse wasbuffer toe aan het monster en incubeert u opnieuw.

Aan het einde van de incubatie zuigt u de wasbuffer op en voegt u 50 microliter montagemedia toe aan het monster. Gebruik onder een ontledende stereomicroscoop een pipet om het monster op een microscoopglaasje over te brengen. Plaats de teelballen met een tang in een lijn op het microscoopglaasje om de identificatie van het monster tijdens de beeldvorming te vergemakkelijken.

Bedek het monster met een dekglaasje en dep de randen van het dekglaasje af met een tissuedoekje om overtollig montagemateriaal te verwijderen. Sluit de randen van het dekglaasje af met nagellak en laat ze 10 minuten in het donker op kamertemperatuur staan om de nagellak te laten drogen. rRNA-signalen werden gedetecteerd in de nucleolus en verschenen als DAPI-poriegebieden in de kern, vooral in kiemcellen met grote kernen en nucleoli.

Zwakke, niet-specifieke signalen werden waargenomen in het cytoplasma in monsters zonder rRNA-loci. In de meeste cellen werden uitsluitend YrRNA-signalen gedetecteerd, wat wijst op rRNA-transcriptie van de YrDNA-locus. Co-expressie van X en YrRNA werd waargenomen in kiemcellen, waarbij signalen ofwel samensmelten tot een enkele kern of zich scheiden in twee nucleoli.