Enzymatische modificatie en beoordeling van flowcytometrie van door het gistoppervlak weergegeven eiwitten

Dit onderzoek richt zich op het bestuderen van de chemische modificaties aan eiwitten die bepalen hoe cellen zich gedragen. In dit geval is het doel om de voorkeuren en kinetiek te begrijpen van enzymen die een verscheidenheid aan substraten wijzigen.

Het vermogen om een substraatmolecuul dat op het oppervlak van gist wordt weergegeven, te defosforyleren, is voor het eerst aangetoond. Deze bevinding opent mogelijkheden voor generaliseerbare kinetische mapping van enzymatische modificaties die voorheen niet toegankelijk waren. Dit onderzoek richt zich op de uitdagingen die gepaard gaan met het begrijpen van enzymsubstraatinteracties. Meestal zijn cellysaten of aangepaste peptiden vereist voor dit type beoordeling. Hier wordt een FasL-alternatief geboden door het gebruik van met gist weergegeven substraten.

Dit protocol bevordert de traditionele weergave van het gistoppervlak in de richting van analyse van wat normaal gesproken intracellulaire enzymatische reacties in de extracellulaire ruimte zouden zijn, waardoor FasL-analyse van deze normaal moeilijk te beoordelen interacties mogelijk wordt.

Dit protocol maakt het mogelijk om substraatvoorkeuren van een verscheidenheid aan enzymen te ondervragen door middel van high-throughput-methoden en om kinetische studies uit te voeren met een eenvoudige uitlezing.

[Docent] Ontdooi om te beginnen een aliquot van de voorbereide gistcellen op ijs. Voeg 0,5 tot 1,5 microgram plasmide-DNA met de gistweergaveconstructie rechtstreeks aan de cellen toe. Voeg vervolgens 0,5 milliliter van de transformatieoplossing of een steriele 50% polyethyleenglycol en 0,1 molaire lithiumacetaatoplossing toe. Combineer het mengsel van cellen, plasmide-DNA en transformatieoplossing grondig door te pipetteren. Incubeer het transformatiemengsel statisch gedurende 30 tot 60 minuten bij 30 graden Celsius en vortex het mengsel met tussenpozen van 15 minuten. Oogst de cellen door te centrifugeren bij 1000G. Bereid een kweekbuis van 14 milliliter voor met 4,5 milliliter plasmide-bevattende gistcelgroei of SDCAA-media. Susmureer de cellen met het gewenste plasmide opnieuw in 500 microliter SDCAA en inoculeer de voorbereide 4,5 milliliter media. Verdeel 50 microliter van de vijf milliliter geënte cultuur voorzichtig over een SDCAA-plaat zonder de vijzel te doorboren. Incubeer statisch bij 30 graden Celsius gedurende 48 uur om de transformatie-efficiëntie te bepalen. Incubeer nu de vijf milliliter SDCAA-celcultuur in een schudbroedmachine bij 30 graden Celsius en 300 RPM gedurende ten minste 18 uur. Bewaak de optische dichtheid op 600 nanometer na 16 uur en herhaal opnieuw na 20 uur. Zodra het monster een optische dichtheid van niet meer dan zes heeft bereikt, centrifugeert u de cultuur gedurende drie minuten bij 2500 G en gooit u het bovenstaande weg zonder de gistpellet te verstoren. Resuspendeer de gistpellet bij de inductie van eiwitexpressie, of SRGCAA-media, tot een uiteindelijke optische dichtheid van 600 nanometer minder dan één. Incubeer de gistcultuur in een schudbroedmachine bij 30 graden Celsius en 300 RPM gedurende minimaal acht uur, maar niet langer dan 24 uur. Meet vervolgens de optische dichtheid op 600 nanometer om de celdichtheid te bepalen. Bereid de werkbuffer voor de monsters voor door de 2X werkende bufferoplossing in een verhouding van één op twee te verdunnen met gedeïoniseerd water in een injectieflacon van 1,7 milliliter. Voeg voor elk monster het juiste volume gistcultuur toe dat nodig is om twee miljoen gistcellen terug te winnen in de injectieflacon van 1,7 milliliter. Centrifugeer de injectieflacon gedurende één minuut bij 4500 G en verwijder met behulp van een micropipet het bovenstaande voorzichtig en gooi het weg als biologisch gevaarlijk afval. Resuspendeer de gepelleteerde cellen in één milliliter PBSA voordat u de centrifugatie en verwijdering van het bovenstaande herhaalt. Houd het opzij. Bereid de recombinante menselijke SHP-2-oplossing voor met een eindconcentratie van 1.000 nanomol in een totaal reactievolume van 20 microliter. Voeg vervolgens 7,7 milligram DTT toe aan 10 milliliter gedeïoniseerd water in een conische buis van 15 milliliter om een DTT-oplossing van vijf millimolair te maken. Neem nu de gepelleteerde cellen en suspendeer ze opnieuw in de werkbuffer zodat het uiteindelijke reactievolume 20 microliter per monster is. Voeg aan elk monster twee microliter van de DTT-oplossing van vijf millimolaire toe voor een uiteindelijke DTT-concentratie van 0,5 millimolair. Voeg het voorbereide volume SHP-2 toe aan elk monster om een eindvolume van 20 microliter te verkrijgen en meng voorzichtig met behulp van een micropipet. Wikkel de deksels van de monsterinjectieflacon in met parafilm om lekkage of kruisbesmetting te voorkomen. Incubeer de monsters twee uur lang bij 37 graden Celsius op een rotor met een constante snelheid. Nadat u de monsters uit de rotor hebt verwijderd, stopt u de reactie door een milliliter PBSA aan elk monster toe te voegen voordat u ze opnieuw gedurende één minuut centrifugeert. Gooi dan de supernatant weg. Resuspendeer de gepelleteerde monsters in een mengsel van 20 microliter van de overeenkomstige primaire reagentia en incubeer ze gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Centrifugeer na 20 minuten monsters bij 4500G gedurende één minuut en gooi het bovenstaande weg als biologisch gevaarlijk afval. Was de cellen één keer door ze opnieuw te suspenderen in een milliliter PBSA voordat u de cellen opnieuw centrifugeert. Susmureer de monsters nu opnieuw in een mix van 20 microliter van de bijbehorende secundaire reagentia en incubeer ze gedurende 15 minuten in het donker. Na het centrifugeren van de monsters en het weggooien van het supernatant, wast u de cellen nog een keer met PBSA voordat u ze opnieuw centrifugeert. suspendeer vervolgens de gewassen monsters opnieuw in 300 tot 500 microliter PBSA en breng ze over naar polystyreenbuizen van vijf milliliter voor flowcytometrie-analyse. Nadat u de cytometer hebt voorbereid, klikt u op Bestand, gevolgd door de knop Nieuw experiment, geeft u het experiment een naam en klikt u op Opslaan om ervoor te zorgen dat de verkregen gegevens worden opgeslagen in het gewenste bestandspad. Selecteer het pictogram voor de puntplot in de bovenste werkbalk om twee of meer puntplots voor elk voorbeeld te maken. Zorg er voor een van de puntdiagrammen voor dat de naam van de x-as het FSCA-kanaal weergeeft en dat de naam van de y-as het SSCA-kanaal weergeeft. Selecteer voor een andere grafiek de naam van de x-as om het kanaal weer te geven waarin het secundaire reagens dat gericht is op het primaire anti-epitoop-tag-antilichaam fluoresceert, en de naam van de y-as om het kanaal weer te geven waarin het secundaire reagens van streptavidine fluoresceert. Geef een beschrijvende naam op voor het monster door met de rechtermuisknop op de buis te klikken, Naam bewerken te selecteren en de voorbeeldnaam in te voeren. Plaats elk monsterbuisje in de houder van de cytometer en klik op Uitvoeren om te beginnen met het laden van het monster en het verzamelen van gegevens. Pas gebeurtenissen, tijd en debiet indien nodig aan. Definieer een poort rond de gezonde gistcellen in de SSCA versus FSCA-plot. Noteer vervolgens de fluorescentie van alle controlemonsters. Definieer een poortstrategie voor het gemaakte perceel voordat u de behandelde monsters analyseert. Registreer de fluorescentie van gedefosforyleerde monsters met behulp van de cytometer en de gating-strategie voordat u de gegevens analyseert met behulp van flowcytometriesoftware. Evalueer de fosforylering door de mediaan van de y-as te meten en te vergelijken van cellen die eiwit tot expressie brengen op hun oppervlak, en de basisfosforylering van niet-spelende cellen tussen monsters en controles. Bereken ten slotte het procentuele mediane fosforyleringsverschil met behulp van de meegeleverde formule. Het effect van variërende SHP-2-fosfataseconcentraties en incubatietijden op het mediane fosforyleringsverschil in substraten die aan het gistoppervlak worden weergegeven, wordt geïllustreerd in deze figuur. Het procentuele mediane fosforyleringsverschil nam in de loop van de tijd af in alle SHP-2-concentraties, waarbij de hoogste defosforylering werd waargenomen bij een SHP-2-concentratie van 1.000 nanomolair na vier uur'. Na twee uur incubatie resulteerde 1.000 nanomolair SHP-2 in een mediaan fosforyleringsverschil van ongeveer 48,8%, significant lager dan de 750 nanomolaire toestand op hetzelfde tijdstip. Er werd geen significant verschil in mediaan fosforyleringsverschil waargenomen wanneer de incubatie werd verlengd van twee uur tot drie uur bij SHP-2-concentraties van 500 nanomolair, 750 nanomolair en 1.000 nanomolair.