In Ovo Xenotransplantatie van van patiënten afgeleide acute lymfoblastische leukemie (ALL)-cellen (PDX-ALL)

De reikwijdte van dit onderzoek is kankerbiologie, met een focus op het identificeren van therapeutische strategieën om kanker te behandelen. Het in ovo patiënt-afgeleide xenotransplantaat acute lymfoblastische leukemiemodel wordt beperkt door een relatief kort experimenteel venster van ongeveer 10 dagen, waardoor langetermijnstudies naar de progressie van acute lymfoblastische leukemie of geneesmiddelrespons na dit tijdsbestek worden beperkt. Dit protocol stelt een snelle, kosteneffectieve methode vast voor in ovo xenotransplantatie van van patiënten afgeleide acute lymfoblastische leukemiecellen, inclusief B-cel- en T-cellijnen.

Dit protocol is een veelbelovend hulpmiddel voor preklinische screening van geneesmiddelen, mechanistische studies en mogelijk gepersonaliseerde geneeskundebenaderingen in leukemieonderzoek. De haalbaarheid van het gebruik van het in ovo xenotransplantaatmodel gevestigde voor preklinische toepassingen zal worden onderzocht. Breng om te beginnen de verkregen eieren over in een bevochtigde rollende broedmachine die is ingesteld op ongeveer 50 tot 60% luchtvochtigheid en een temperatuur van 39 graden Celsius.

Broed de eieren uit in deze broedmachine gedurende 10 dagen na de bevruchting. Breng de bloedmonsters over in een steriele centrifugebuis van 50 milliliter en verdun elk monster drie keer met twee volumes PBS. Nadat het monster samen met een dichtheidsgradiëntmedium is gecentrifugeerd, verzamelt u de buffy-laaglaag van mononucleaire cellen van de interface en brengt u deze over naar een nieuwe steriele buis van 15 milliliter.

Voeg 10 milliliter PBS toe aan de buis en centrifugeer de buisjes gedurende vijf minuten bij 300 G om de resterende serumcomponenten te verwijderen. Resuspendeer de gepelleteerde cellen in RPMI 1640 medium aangevuld met 10%FBS. Gebruik een hemocytometer om het aantal cellen te tellen.

Resuspendeer de cellen in een vriesmedium bestaande uit 10% DMSO in FBS. Beoordeel de levensvatbaarheid van de cellen met behulp van de trypanblauwe uitsluitingstest en vries de cellen in bij min 80 graden Celsius en bewaar ze in vloeibare stikstof. Vervolgens co-transfecteren 1,5 miljoen HEK 293 T-cellen met de gewenste plasmidevector met behulp van Lipofectamine 3000 en incuberen de getransfecteerde cellen gedurende twee dagen.

Oogst het bovenstaande dat lentivirus bevat uit de putjes en filtreer het door een filter van 0,45 micrometer om vuil te verwijderen. Breng het gefilterde virale supernatans over in centrifugebuisjes en centrifugeer bij 20.000 G gedurende twee uur bij vier graden Celsius. Voor het labelen worden 1 miljoen cellen per milliliter B-celprecursor SEM en T-cel MOLT3-cellijnen en van de patiënt afgeleide B- of T-cellen voor acute lymfoblastische leukemie geplakt in platen met zes putjes die RPMI 1640 bevatten met 10% FBS.

Visualiseer mCherry-gelabelde cellen onder een fluorescentiemicroscoop. Onderzoek op dag 10 het vaatstelsel van de kuikenembryo's onder licht om de levensvatbaarheid van het embryo te beoordelen, was het oppervlak van elk ei voorzichtig met 70% ethanol. Boor met een handboor in de luchtcel van elk ei om een klein venster met een diameter van ongeveer twee centimeter te maken.

Sluit het gemaakte raam af met transparant plakband en plaats de eieren terug in een 5%-koolstofdioxide-broedmachine. Injecteer op dag 11 10 miljoen mCherry-gelabelde acute lymfoblastische leukemiecellen in de bloedvaten van de zich ontwikkelende embryo's met behulp van naalden van 34 kaliber. Nadat u het raam hebt afgesloten, plaatst u de eieren terug in een broedmachine met 5% koolstofdioxide en controleert u dagelijks de levensvatbaarheid van het embryo.

Ontleed op dag 15 de bloedvaten uit de embryo's. Plaats ze op glasplaatjes en fotografeer succesvolle xenotransplantaten met behulp van een ontleedmicroscoop die is uitgerust met fluorescentiemogelijkheden. Verzamel bloed uit het vaatstelsel van kippenembryo's met behulp van een steriele spuit met een naald van 32 gauge.

Breng het bloed over in een steriel buisje van 1,5 milliliter met heparine en centrifugeer het gedurende 10 minuten bij 226 G bij vier graden Celsius. Label B-cel acute lymfoblastische leukemiecellen met humane FITC CD10 en humane PE CD19-antilichamen en T-cel acute lymfoblastische leukemiecellen met humane FITC CD4 en humane PE CD8-antilichamen bij vier graden Celsius in het donker gedurende 30 minuten. Was de gelabelde cellen twee keer met PBS dat 1% BSA bevat en analyseer met behulp van flowcytometrie Vasculaire kolonisatie door SEM- en MOLT3-cellijnen was vier dagen na injectie duidelijk zichtbaar, wat een succesvolle implantatie in het zich ontwikkelende vaatstelsel van kippenembryo's bevestigt.

Van de patiënt afgeleide B-all- en T-all-cellen vertoonden vier dagen na de injectie sterke fluorescerende signalen in de bloedvaten, wat wijst op actieve kolonisatie en proliferatie in het vaatstelsel. Flowcytometrie toonde een significante toename van CD10/CD19-positieve cellen in embryo's die waren geïnjecteerd met SEM en van de patiënt afgeleide B-all-cellen vier dagen na injectie in vergelijking met controles die zes uur na injectie werden verzameld. Evenzo waren CD4/CD8-positieve cellen significant hoger in embryo's die waren geïnjecteerd met MOLT3 en van de patiënt afgeleide T-all-cellen vier dagen na de injectie.