Een op GFP-complementatie gebaseerd systeem met dubbele expressie voor het beoordelen van cel-celcontact gemedieerd door cytonemen in levende imaginaire schijven van de Drosophila-vleugel

Ons onderzoek richt zich dus op het begrijpen hoe ver weg gelegen cellen in weefsels met elkaar communiceren. We gebruiken de imaginaire schijf van de Drosophila-vleugel als modelsysteem om te proberen te begrijpen hoe cytidine wordt gevormd, hoe ze functioneren en welke rol ze spelen bij het lokaal beheersen van weefselgroei. Studies suggereren dat groeifactoren vaak door gespecialiseerde cellulaire projecties reizen, zoals op actine gebaseerde signaleringsfilopodia, cytonemen genaamd, om aan de doelcellen te worden afgeleverd.

Cytonemen zijn zeer dunne en fragiele structuren die gemakkelijk kunnen worden verstoord door het fixatieprotocol. Om ze te observeren, moet u speciale live imaging-benaderingen gebruiken met tot expressie gebracht fluorescerend gelabeld eiwit. Dit beperkt de tool en benaderingen die we kunnen gebruiken om ze te onderzoeken aanzienlijk.

We hebben een proteïnekinase geïdentificeerd, Slik genaamd, dat betrokken is bij de biogenese van cytoneme. Expressie van Slik in een epidurale laag in de imaginaire schijf van de vleugel veroorzaakt de vorming van cytoneem dat het schijflumen passeert en stimuleert de proliferatie van cellen in de aangrenzende epitheellaag. In de toekomst willen we het eiwit identificeren dat stroomafwaarts van Slik werkt om de vorming van cytoneme te bevorderen, om de ligand te identificeren die via dit cytoneem wordt afgeleverd om perforatie te bevorderen, en om het fysiologische belang van dit mechanisme bij het beheersen van weefselgroei beter te begrijpen.

Knip om te beginnen met een schaar afzonderlijke putjes uit de strook met acht putjes en knip vervolgens elk putje doormidden. Verwijder de beschermende achterkant aan één kant van elke helft en plak de afstandhouders op het microscoopglaasje, waarbij u ze iets uit elkaar plaatst om een beschutte centrale ruimte te creëren voor het plaatsen van de schijf. Pluk zwervende larven van het derde stadium uit de kweekbuis na genetische kruising en incubatie bij 25 graden Celsius.

Breng de larven onder een ontleedmicroscoop over in een druppel levend beeldmedium op een met siliconen beklede petrischaal. Begin met twee ontleedtangen met dissectie door de larven op ongeveer 1/3 lichaamslengte van de voorste met één tang te knijpen om ze stabiel te houden. Knijp bij het tweede paar het lichaam net achter het eerste punt en trek eraan om de achterste helft te scheiden, waardoor het voorste gedeelte wordt geïsoleerd.

Keer de voorste helft om door beide zijden van het afgesneden uiteinde met een pincet vast te pakken en de kop erdoor te duwen met een tweede paar, waardoor het binnenstebuiten wordt gekeerd. Dit legt interne structuren bloot, zoals denkbeeldige schijven, luchtpijp, speekselklieren, vetlichaam en darmen. Verwijder de speekselklieren, het vetlichaam en de darm met behulp van een tang en zorg ervoor dat u de laterale tracheale stammen die over de vleugelschijven liggen niet verstoort.

Breng met een tang de gereinigde voorste helften met bevestigde vleugelschijven over in een druppel schoon live beeldmedium met haken die tussen de afstandhouders van de glaasjes zijn geplaatst. Om de vleugelschijven te isoleren, ontleedt u ze voorzichtig van de fijne tracheale takken met een mes van de ontleedtang of een fijne wolfraamdraad die op een ontleednaaldhouder is gemonteerd. Gooi het resterende karkas weg.

Richt de vleugelschijven met behulp van een snijtang of wolfraamnaald zodat de peripodiale membraanzijde naar boven wijst. Pas het gemiddelde volume aan zodat het de put boven het afstandsniveau iets te vol doet. Verwijder de bovenste beschermkap van de imaging spacer en laat voorzichtig een dekglaasje over het monster zakken.

Druk het afdekglaasje op de contactpunten van de afstandhouder met behulp van het afgeronde uiteinde van de tang om een goede hechting te garanderen. Als u de afbeeldingsstapels in ImageJ wilt projecteren, selecteert u Afbeelding, vervolgens Stapels, gevolgd door Z Project, en kiest u Maximale intensiteit in het menu. Identificeer in de projectiebeelden met maximale intensiteit het gebied van de vleugelzak op basis van het vouwpatroon van de vleugelschijf met behulp van het haakkanaal en de polygoonselectietool.

Pas dezelfde selectie toe op het GFP-kanaal en selecteer Bewerken gevolgd door Buiten wissen om ruis buiten het geselecteerde gebied te elimineren. Gebruik het hooks-kanaal in de projectiebeelden met maximale intensiteit om de artefactische vlekken in de GFP-afbeeldingen te identificeren. Selecteer vervolgens het gebied met behulp van het gereedschap voor het selecteren van polygonen.

Klik op Bewerken en kies Wissen. Selecteer in de opgeschoonde projectiebeelden met maximale intensiteit de optie Analyseren, gevolgd door Histogram en kies Lijst om alle pixelwaarden op te halen. Kopieer deze lijst naar een spreadsheettabel.

Om een drempelwaarde in te stellen, analyseert u het achtergrondsignaal in de negatieve controlemonsters en bevestigt u deze waarde met behulp van andere voorbeeldafbeeldingen. Bereken het percentage GFP-positieve oppervlakken door het aantal pixels boven de drempelwaarde te delen door het totale aantal geldige pixels en het resultaat te vermenigvuldigen met 100. Normaliseer ten slotte elke berekende waarde nadat u deze hebt gedeeld door het gemiddelde van de referentievoorwaarde, die is ingesteld op één.

In wildtype schijven die beide gesplitste GFP-componenten misten, werd slechts minimale granulaire GFP-autofluorescentie waargenomen nabij het midden van de vleugelzak, en dit basissignaal werd gebruikt om een fluorescentiedrempel te definiëren. Schijven die alleen CD4-splitsing GFP1-10 in de eigenlijke schijflaag tot expressie brengen, vertoonden fluorescentieniveaus die niet te onderscheiden waren van wildtype, wat de niet-fluorescerende aard van GFP1-10 alleen bevestigt. Co-expressie van CD4 split GFP1-10 in de eigenlijke schijf en CD4spGFP11 in het peripodiale membraan leidde tot een merkbare toename van discrete, heldere GFP-vlekken gelokaliseerd in het schijflumen, met een significant groter fluorescentie-positief gebied boven de drempel dan controles.

Slik-expressie in de eigenlijke schijf veroorzaakte een sterke toename van de dichtheid van peripodiale membraankernen en een dramatische toename van de GFP-signaalintensiteit in het vleugelzakgebied, wat suggereert dat door Slik geïnduceerde cytoneken een verbeterd contact met peripodiale membraancellen tot stand brengen.