Een op fluorescentie gebaseerd protocol voor voorlopige screening van eiwitsyntheseremmers uit natuurlijke bronnen

Een op fluorescentie gebaseerd protocol voor voorlopige screening van eiwitsyntheseremmers uit natuurlijke bronnen. Eiwitsynthese omvat sterk gereguleerde processen, transcriptie en translatie. Transcriptie wordt voornamelijk gereguleerd door transcriptiefactoren, chromatinemodificaties en regulerende RNA's.

Terwijl translatie wordt geregeld door initiatiefactoren, signaalroutes en RNA-stabiliteitsmechanismen. Deze regulatiesystemen stellen cellen in staat cellulaire functies te behouden en effectief te reageren op stress of schade. Kankercellen ontregelen de eiwitsynthese door translationele machines te kapen om hun hoge energiebehoefte en ongecontroleerde groei te ondersteunen.

Deze herprogrammering is het gevolg van een dysregulatie van bijna alle belangrijke oncogene signaalroutes, wat celoverleving, proliferatie en metastase bevordert terwijl celsterfteroutes worden onderdrukt. Omdat deze verbeterde eiwitsynthese cruciaal is voor het overleven van kanker, tonen behandelingen die dit proces targeten en blokkeren veelbelovend potentieel als mogelijke therapieën. Om eiwitsyntheseremmers te identificeren, kan de volgende fluorescentietest voor eiwitsynthese worden gebruikt.

Voordat het experiment wordt gestart, moeten verbindingen worden toegediend in een geschikte concentratie onder de toxiciteitsdrempel om betrouwbare resultaten te verkrijgen. Om een startconcentratie vast te stellen, moet een cytotoxiciteitstest worden uitgevoerd om de EC 50 van de verbinding te bepalen. Als dit niet haalbaar is, kunnen verbindingen in deze assay op dosisafhankelijke wijze worden getest om de meest effectieve concentratieparameters te bepalen.

Als de concentratie van verbindingen celdood veroorzaakt, wordt testen bij lagere concentraties noodzakelijk. Het is ook belangrijk om kleurstoffen te allen tijde te beschermen tegen licht wanneer ze niet worden gebruikt. Langdurige lichtblootstelling leidt tot fotobleaching, wat leidt tot een verminderde datakwaliteit.

Stap 3.1: bereid hoofdmengsel A voor, label een centrifugebuis als A, pipetteer 598,5 microliter kweekmedium en 1,5 microliter eiwit in A. Sussep dit mengsel opnieuw om homogeniteit te waarborgen door omhoog en omlaag te pipetten. Bereid nu de hoofdmix B voor. Label een centrifugebuis als B, pipetteer vervolgens 1,5 microliter eiwitlabel, 6,6 microliter cycloheximide en 591,9 liter kweekmedium in B. Susstrueer dit mengsel opnieuw om homogeniteit te garanderen door op en neer te pipetten. Na het pipetteren van één microliter testmiddel en één microliter vehicle in twee putten, pipetteert voorzichtig 99 microliter mastermix A in beide putten en pipetteert schuin in de zijkant van de put om kinetische verstoring van cellen te voorkomen.

Pipetteer 100 microliter mastermix B in twee onbehandelde putten. Pipetteer schuin in de zijkant van de put om kinetische verstoring van cellen te voorkomen. Tik voorzichtig op de plaat om de gewenste componenten volledig in de cellen te integreren.

Incubeer cellen op 37 graden Celsius gedurende 30 minuten tot twee uur. Verwijder het celkweekmedium via aspiratie. Kantel de plaat en aspireer aan de zijkant van de put in plaats van in het midden om kinetische verstoring van cellen te voorkomen.

Voeg vervolgens 100 microliter PBS-buffer toe aan elke put en centrifugeer de plaat op 900g gedurende vijf minuten. Na het centrifugeren moet je de PBS-buffer verwijderen via aspiratie. Stap vijf, fixatie en permeabilisatie.

Voeg 100 microliter fixatieve oplossing toe aan elke put. Daarna incubeer je de cellen op kamertemperatuur gedurende 15 minuten in een donkere omgeving. Daarna aspireer ik de cellen.

Was de cellen met 100 microliter wasfilter en verwijder via aspiratie. Herhaal dit twee keer. Voeg 100 microliter permeabilisatiebuffer toe aan elke put.

Daarna broeden ze 10 minuten op kamertemperatuur. Verwijder de permeabilisatiebuffer via aspiratie. Stap zes, eiwitreactie en kleuring.

Bereid de reactie-cocktail master mix voor. Voeg 651 microliter PBS-buffer toe aan een centrifugebuis. Voeg dan zeven microliter 100x koperreagens toe.

Daarna zeven microliter fluorescerend azide. En tot slot voeg je 35 microliter reducerend middel, aan de centrifugebuis. Volg deze exacte volgorde bij het toevoegen van de reagentia en voeg vervolgens 100 microliter van de reactiecocktail toe aan elke put.

Incubeer de cellen 30 minuten in een donkere omgeving op kamertemperatuur om fotobleaching te voorkomen. Centrifugeer de cellen op 900g gedurende vijf minuten. Aspireer, was de cellen en aspireer dan opnieuw.

Bereid een verdunning van 1x van de totale DNA-kleuring voor en voeg 100 microliter toe aan elke put. Incubeer cellen op kamertemperatuur gedurende 20 minuten in een donkere omgeving om fotobleaching te voorkomen. Centrifugeer het bord op 900g gedurende vijf minuten.

Was de cellen met 100 microliter wasbuffer en verwijder via aspiratie. Herhaal deze stap twee keer. Tot slot wordt de cellen opnieuw opgehangen met 100 microliter gekoelde PBS-buffer om ze voor te bereiden op beeldvorming.

Stap acht, beeldvorming. Steek de plaat in de plaatlezer en stel de vergroting in op 20 x. Analyseer de kernkleuring met het GFP 469/525 nanometerkanaal.

Gebruik auto-bending en autofocus om de beeldkwaliteit te verbeteren. Analyseer de synthese van actieve eiwitten met het Texas Red 586/647 nanometerkanaal. Gebruik auto-bending en autofocus om de beeldkwaliteit te verbeteren.

Fluorescerende probes zijn gevoelig voor fotobleaching, een fenomeen waarbij straling met licht ervoor zorgt dat fluoroforen hun fluorescerende eigenschappen verliezen. Kleurstoffen moeten te allen tijde beschermd zijn tegen licht wanneer ze niet worden gebruikt. Daarnaast moet het aantal scans binnen elke put en de tijd onder bestraald licht worden beperkt.

Langdurige lichtblootstelling leidt tot fotobleaching, wat uiteindelijk leidt tot een verminderde datakwaliteit. Laten we naar de representatieve resultaten kijken. Levende cellen zijn hier zichtbaar in groene en actieve eiwitsynthese wordt aangegeven door rood.

De bekende eiwitsynthese-remmer cycloheximide resulteert in een grote afname van de eiwitsynthese, zoals te zien is in figuur 1B vergeleken met de negatieve controle DMSO in figuur 1A, er wordt minder rood fluorescerend licht uitgezonden. Behandeling met verbinding één zoals te zien in figuur 1C resulteerde in ofwel celloslating of celdood. Daarom kunnen we geen definitieve claims doen over de remmingsactiviteit van de eiwitsynthese.

Dit rechtvaardigt verdere dosisresponsstudies om te proberen te bepalen of het de eiwitsynthese bij lagere concentraties remt. Verbinding twee vertoont matige remming van eiwitsynthese, zoals aangegeven in figuur 1D. Deze fluorometrische assay is een waardevol onderzoeksinstrument en een toegankelijke chemische biologische methode voor het opleiden van bachelorstudenten.

Door een toegankelijk, efficiënt protocol te bieden met minimale dataverwerking, krijgen studenten praktijkervaring en moderne geneesmiddelenontdekkingstechnieken en versnelt het het geneesmiddelenontdekkingsproces. Het protocol maakt gebruik van een fluorescerend substraat en geavanceerde fluorescentiemicroscopietechnieken om systematisch de remmende eigenschappen van natuurlijke productverbindingen één en twee te detecteren en te meten. Met cycloheximide als referentie-remmer vertoonden beide natuurlijke producten verschillende niveaus van proteïnesynthese-inhibitie.

Naarmate de vraag naar nieuwe eiwitsyntheseremmers toeneemt, biedt deze aanpak bachelorstudenten zinvolle onderzoeksmogelijkheden en draagt het bij aan vooruitgang in kankertherapieën.