Een scanning elektronenmicroscopie-compatibele optische beeldvormingsmethode voor mesoscopische all-cel hersenmapping

Ons onderzoek richt zich op connectomics. We ontwikkelen hoogdoorvoer optische of elektronenbeeldacquisitiemethodologieën, waarmee neurocircuits en synaptische connectiviteitskenmerken kunnen worden geanalyseerd om de fundamentele verbindingslogica van neurocircuits te ontcijferen. Oorspronkelijke connectomics met hoge revolutie zijn beperkt tot kleine hersenvolumes vanwege kostbare gegevensverzameling en precies, terwijl snelle microscopische analyse en gerichte microscopische studie potentieel bieden voor volledige hersenconnectomics.

In vergelijking met andere microscopische benaderingen, zoals diverse Larsens-microscopen, maakt OMLIT beelden van alle neuronen met informatie over dendrieten en axonzorgen. Naast de compatibiliteit met de elektronenmicroscoop is er ook nog meer nanoschaalresolutiebeeldvorming onder EF. OMLIT helpt bij het bouwen van uitgebreide hersenmodellen, waarbij alle langeafstandsprojecties in kaart worden gebracht, inclusief hun richting, sterkte en type, naast de lokale microcircuits in combinatie met seriële thema's. Het biedt inzicht in de gestructureerde architectuur en informatiestroom door het hele brein.

We ontwikkelen geautomatiseerde OMLIT-beeldvorming en EM-gegevensverzameling geleid door OMLIT-gedefinieerde RI's, wat efficiënte connectomische gegevensverzameling en -analyse mogelijk maakt over grote of volledige hersenvolumes. Om te beginnen kies je ofwel capton- of D50-film met een dikte van 50 micrometer, die op het gemotoriseerde wikkelsysteem wordt gemonteerd. Met een dubbelkop magnetronsputtersysteem breng je een uniforme dunne laag chroom of andere metalen zoals aluminium, zilver of koper aan op het oppervlak van de tape.

Plaats de tape op een afstand van 80 millimeter van het sputterende doel. Voer het proces uit onder gelijkstroom en bij een druk van één pascal die wordt geregeld door 99,99% argongas. Stel nu de wikkelsnelheid van de band in op 0,6 millimeter per seconde om een metaalcoatingdikte van 50 nanometer te bereiken.

Na het depositieproces haal je de tape uit het systeem zodra deze is afgekoeld tot kamertemperatuur. Evalueer de dikte en uniformiteit van de coating met behulp van een stylusprofiler, atoomkrachtmicroscopie of scanning-elektronenmicroscopie. Voor een strategie met lage reflectiviteit maak je de tape schoon en hydrofiel met een plasmareiniger van 80 watt vermogen terwijl je de band beweegt met zeven millimeter per seconde.

Na de behandeling plaats je waterdruppels op het tapeoppervlak om te bevestigen dat ze zich snel verspreiden tot een dunne film. Met een kleine slijpmachine of vergelijkbaar snijgereedschap snoei je de hars aan de monsterzijde ruw af om omringende blanco hars te verwijderen en het monsteroppervlak bloot te leggen. Plaats het met hars ingebedde blok in de monsterhouder en draai het vast om het blok stevig vast te zetten.

Bevestig de monsterhouder op de beweegbare arm van het microtoom. Plaats een glazen mes of diamanttrimmes onder een hoek van 45 graden op de messenhouder. Onder de microscoop snijd je het monsteroppervlak in een piramidevorm en maak je het glad, en trim je vervolgens de vier zijden van het monsterblok af om overtollige hars te verwijderen.

Draai de knop om de voor- en achterranden van het blok horizontaal uit te lijnen. Verwijder het trimmingsmes en vervang het door een diamantmes, geplaatst onder een hoek van 45 graden. Stel de kantelhoek van de microtoombasis in op zes graden en beweeg de messenhouder langzaam met de knop totdat de voorrand van het mes één tot twee millimeter van het monsteroppervlak verwijderd is.

Let op de heldere band tussen het monsteroppervlak en de mesrand, en pas de kantelhoek aan zodat de band van boven naar beneden en van links naar rechts gelijk is. Spuit nu gedestilleerd water in de groef van het diamantmesje om het lemmet nat te maken. Verwijder wat water met een spuit totdat het vloeistofniveau daalt en de reflectie zilverachtig lijkt.

Stel vervolgens de snijsnelheid en het snijvenster in de sectiedikte in de besturingseenheid. Pas de doorsnedingssnelheid aan op 0,6 millimeter per seconde en de doorsnededikte op 60 nanometer, afhankelijk van de kwaliteit van het monster. Begin met het doorsnijden met het microtoom.

Zodra stabiele en uniforme secties zijn geproduceerd, pauzeer je het proces. Gebruik daarna een fijne kwast om gesneden delen en vuil te verwijderen. Plaats nu zowel de gecoate tapespoel als een lege ophaalspoel op het automatische, ultradunne sectieverzamelsysteem.

Zet het vergrendelingsmechanisme vast en voer een proefrit uit om de soepele bandbeweging bij constante snelheid en correcte verzameling op de ophaalspoel te bevestigen. Dompel de verzamelkop van het met tape beveiligde verzamelapparaat onder in het waterbad van het diamanten mes en stel de kop zo in dat deze parallel aan de mesrand ligt op 1,5 keer de lengte van de schijf van het monster. Beveilig het verzamelapparaat en hervat de sectievorming, terwijl het bandverzamelapparaat tegelijkertijd wordt gebruikt.

Na het verzamelen van voldoende doorlopende secties, pauzeer je het doorsnijden. Knip de tape door op een plek zonder secties. Laat het tape-verzamelapparaat draaien totdat alle tape op de spoel is gewonden.

Verwijder vervolgens de spoel en plaats deze in een elektronische droogoven. Maak het tapeverzamelapparaat en het microtoom schoon en breng alle accessoires terug op hun juiste plek. Voor de montering op een siliciumwafer, haal je de transparante beschermfolie van de dubbelzijdige geleidende tape af.

Breng de tape parallel aan de dubbelzijdige geleidende tape aan en plaats tot drie stukken tape op elk stuk. Plaats de siliciumwafer op het podium van de optische microscoop en bevestig deze met niet-residu lijmband. Gebruik een vijfvoudige objectieflens om een overzichtsbeeld te krijgen van de siliciumwafer, de tape en het monster.

Op de overzichtsafbeelding maak je elke sectie omlijnd en sorteer je die, voeg je scherpstel- en belichtingspunten toe om automatisch beeldvorming uit te voeren met 20 of 50 keer vergroting over de hele wafer. Na het beelden sla je de beelden op en controleer je de kwaliteit, herfocus en beeld je opnieuw als er beelden onscherp of slechte kwaliteit zijn. Importeer de TIFF-afbeeldingstack in VAST 22 door importeren te selecteren, gevolgd door beeldvolume importeren van afbeeldingen naar VSV-bestand.

Sluit een externe tablet aan en gebruik de penseeltool en tekensegmentmodus om handmatig structuren te segmenteren en te traceren. Gebruik de sneltoetsen A en Z om tussen afbeeldingsslices te navigeren. Visualiseer nu de gesegmenteerde structuur in drie dimensies door venster te selecteren, gevolgd door 3D-viewer, view en update.

Sla tenslotte de segmentatieresultaten op na het selecteren van bestand en segmentatie opslaan. In de beelden met hoge reflectiviteit vertoonden de cytoplasmatische en vasculaire lumengebieden een hogere intensiteit dan de omliggende gebieden, terwijl in de beelden met lage reflectiviteit de cytoplasmatische en vasculaire lumenregio's een lagere intensiteit vertoonden. Kwantificeerde resultaten toonden aan dat de strategieën met hoge reflectiviteit en lage reflectiviteit.

Beide hadden voordelen qua contrast en informatie-entropie. OMLIT optische microscopiebeeldvorming maakte het mogelijk axonen, bloedvaten, cellichamen en dendrieten te identificeren. Handmatige segmentatie van omeletbeelden, met behulp van VAST, toonde talrijke dicht gerangschikte cellichamen, dendrieten en axonen.

De gesegmenteerde resultaten werden gecombineerd met het originele beeld om een driedimensionale visualisatie te produceren. Vergrote OMLIT-beelden toonden onvoldoende resolutie om fijnere structuren te onthullen. Elektronenmicroscopiebeelden van hetzelfde gebied toonden synapsen, mitochondriën, celkernen en blaasjes.