Name: Isolatie en kwantificering van axonale mRNAs met behulp van poreuze membraaninserts en RTddPCR (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-02-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: Leer axonale mRNA-isolatie met poreuze membraaninserts en RT-ddPCR voor kwantificering van laag-abundante transcripten in neuronen. Deze methode ondersteunt onderzoek naar mRNA-transport en lokale translatie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<table><tbody><tr><td>Cell culture Inserts voor 6-well plate, 1.0&nbsp;&mu;m Poriegrootte, steriele</td><td>Corning</td><td>353102</td><td>Consumables</td></tr><tr><td>Cell culture Inserts voor 6-well plate, 3.0&nbsp;&mu;m Poriegrootte, steriele</td><td>CELLTREAT</td><td>230603</td><td>Consumables</td></tr><tr><td>Cell Lifter met smalle kling</td><td>VWR</td><td>76036-006</td><td>Consumables</td></tr><tr><td>CELLSTAR 6-well weefselkweekplaten</td><td>VWR</td><td>82050-842</td><td>Consumables</td></tr><tr><td>ddPCR 96-Well Plates&nbsp;</td><td>Bio-rad</td><td>12001925</td><td>Consumables</td></tr><tr><td>ddPCR Droplet Reader Olie&nbsp;</td><td>Bio-rad</td><td>1863004</td><td>Reagents</td></tr><tr><td>DG8 Cartridges voor QX200/QX100 Droplet Generator</td><td>Bio-rad</td><td>1864008</td><td>Consumables</td></tr><tr><td>Laminine</td><td>Gibco/Fisher Scientific</td><td>23017-015</td><td>Reagents</td></tr><tr><td>LunaScript RT SuperMix Kit</td><td>NEB</td><td>E3010L</td><td>Reagents</td></tr><tr><td>Microplates voor fluorescentie-gebaseerde, 96-well, zwart</td><td>Thermo Fisher</td><td>M33089</td><td>Consumables</td></tr><tr><td>PCR Plate Heat Seal, folie, doorboorbaar</td><td>Bio-rad</td><td>1814040</td><td>Consumables</td></tr><tr><td>Poly-Lysine</td><td>Sigma</td><td>P1274</td><td>Reagents</td></tr><tr><td>PTC Tempo 96 Thermische Cycler</td><td>Bio-rad</td><td>12015382</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>QuantaSoft software</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>PCR data analysesoftware</td></tr><tr><td>Quant-it RiboGreen Reagent en RNA Assay Kit</td><td>Thermo Fisher</td><td>R11490</td><td>Reagents</td></tr><tr><td>QX200 ddPCR EvaGreen Supermix</td><td>Bio-rad</td><td>1864034</td><td>Reagents</td></tr><tr><td>QX200 Droplet Generation Olie voor EvaGreen</td><td>Bio-rad</td><td>1864005</td><td>Reagents</td></tr><tr><td>QX200 Droplet Generator</td><td>Bio-rad</td><td>17005227</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>QX200 Droplet Reader</td><td>Bio-rad</td><td>17005228</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>TRIzol Reagent</td><td>Invitrogen</td><td>15-596-026</td><td>Reagents</td></tr></tbody></table>

isolatie en kwantificering van axonale mrna's met behulp van poreuze membraaninserts en rtddpcr

Isolation and Quantification of Axonal mRNAs Using Porous Membrane Inserts and RTddPCR

Primaire embryonale knaagdiercorticale neuronen, hippocampusneuronen en BFCN's die zijn geplaatst op PLL-gecoate 1 μm-inserts hechten stevig en verlengen neurieten over het membraan met 5-7 dagen in vitro (DIV). Tegen 11 DIV vertonen culturen dichte netwerken. Voor volwassen ratten-DRG's helpt het toevoegen van een laag laminine aan PLL-gecoate 3 μm-inserts om vergelijkbare axonale extensie met 5 DIV te bereiken. Deze waarnemingen bevestigen het vermogen van inserts om langdurige neuronale groei te ondersteunen en voldoende axonaal materiaal te leveren voor downstream RNA-extractie. In geval van schaal combineren we meerdere inserts om voldoende materiaal te krijgen.
TRIzol-extractie uit individuele inserts levert voldoende RNA op voor reverse transcriptie en daaropvolgende ddPCR. RiboGreen-kwantificatie bevestigt consistente RNA-opbrengsten van hele neuronfracties (212,85 ng/insert) en lagere opbrengsten van neurietfracties (42,75 ng/insert) (Figuur 2). We krijgen over het algemeen ~5-7 keer RNA uit de hele neuronfractie versus de neurietverrijkte fractie.
Alle primers worden gevalideerd vóór RTddPCR-experimenten. Voor elk doeltranscript worden ten minste twee primersets besteld en getest met conventionele PCR op cDNA dat uit dezelfde neuronale monsters is gegenereerd. Het primerpaar dat de sterkste en meest specifieke band produceert, wordt geselecteerd voor RTddPCR (Figuur 3A). We kozen bijvoorbeeld primer set 1 voor Gap43. In gevallen van ambigue resultaten, zoals die verkregen voor Actγ, voeren we een gradient PCR uit om de annealingtemperaturen te optimaliseren (Figuur 3B). Dit zorgt ervoor dat alleen goed gevalideerde primers worden gebruikt voor absolute kwantificering, waardoor de kans op artefacten bij druppelafscheiding afneemt.
De schrap- en uitstrijkprocedure scheidt somatische en neuritische compartimenten betrouwbaar. RNA dat uit de hele neuronfracties is geïsoleerd, vertoont verrijking van transcripten, zoals Actγ 46,47,48,49 (Figuur 4). Daarentegen leveren axon-/neurietfracties aanzienlijk lager totaal RNA op, wat consistent is met hun beperkte volume, maar vertonen ze verrijking van transcripten waarvan bekend is dat ze lokaliseren naar distale processen, zoals Gap43 (Figuur 4). Minimale kruisdetectie van soma-gestricteerde transcripten wijst op een hoge compartmentele zuiverheid wanneer inserts zorgvuldig worden behandeld en met optimale dichtheid worden verplat.
Positieve resultaten worden gekenmerkt door: (1) intacte neuronale morfologie met duidelijke axonale extensie, (2) een schone scheiding van compartimenten zonder scheuring van het membraan, (3) gevalideerde primers die een duidelijke scheiding tussen positieve en negatieve druppels veroorzaken, en (4) sterke RTddPCR-signalen voor axonale transcripten. Suboptimale experimenten resulteren in een lage RNA-opbrengst, kruisbesmetting aangetoond door soma-markers in neurietfracties, of RTddPCR-artefacten zoals verhoogde druppel-"regen" door primerdimerisatie. Deze problemen worden meestal in verband gebracht met schade aan het inzetmembraan, overmatige schraapdruk of onvoldoende optimalisatie van de temperatuur van de primer-annealing.
<img alt="Figuur 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69601/69601fig1.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 1"> 
Figuur 1: Overzicht van compartimentspecifieke RNA-isolatie met behulp van membraaninserts. Knaagdierneuronen werden gekweekt op semipermeabele inserts met een porie van 1-3 μm, wat neurietextensie mogelijk maakt terwijl het soma wordt beperkt. Voor de voorbereiding van hele neuronen werden cellen uit het bovenste compartiment afgeschraapt met een steriele celschraper, gepelleteerd en vervolgens gelyseerd in TRIzol voor RNA-isolatie, cDNA-synthese en RTddPCR. Resterende cellulaire resten werden verwijderd uit het insertmembraan met een steriel wattenstaafje. Voor neurietvoorbereiding werd het insertmembraan dat nu alleen neurieten bevat, omgekeerd en met een scalpelblad gesneden, en direct ondergedompeld in TRIzol, gevolgd door RNA-isolatie, cDNA-synthese en RTddPCR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69601/69601fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figuur 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69601/69601fig2.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 2"> 
Figuur 2: Standaard RNA-concentratiecurve met behulp van RiboGreen-assay. (A) Fluorescentieintensiteit werd gemeten met de RiboGreen RNA-kwantificatie-assay over een verdunningsreeks RNA-standaarden. Een lineaire regressieanalyse toonde een sterke correlatie aan tussen RNA-concentratie en fluorescentiesignaal (R² = 0,9956). De R²-waarde dicht bij één toont uitstekende lineariteit en betrouwbaarheid van de RiboGreen-assay voor nauwkeurige RNA-kwantificatie. (B) Met behulp van de vergelijking (y=19,738x + 14,905) voor de in A verkregen helling werd het totale RNA voor elke fractie berekend. Klik <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69601/69601fig2large.jpg" target="_blank">hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figuur 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69601/69601fig3v2.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 3"> 
Figuur 3: Primervalidatie door PCR en agarosegelelektroforese. (A) PCR-amplificatieproducten met cDNA voor Actγ en Gap43 werden opgelost op een 2% agarosegel om de specificiteit van de primer te beoordelen. Voor elk gen werden twee onafhankelijke primersets (set 1 en set 2) getest. DNA-groottemarkers (ladders) worden weergegeven in aangrenzende banen met aangegeven molecuulgewichten (10 kb, 0,5 kb, 0,1 kb). Verschillende enkele banden van de verwachte grootte bevestigen succesvolle versterking en specificiteit van de geselecteerde primersets. (B) PCR-versterking werd uitgevoerd met Actγ-primer ingesteld 2 over een temperatuurgradiënt (55-65 °C) om de optimale annealingtemperatuur te bepalen. Geamplificeerde producten werden opgelost op een 2% agarosegel naast een DNA-ladder (baan 2, maten aangegeven). Consistente enkele banden van de verwachte grootte werden waargenomen over het geteste bereik, met de sterkste versterking gedetecteerd bij 55 °C, wat suggereert dat dit de optimale temperatuur is voor deze primerset. Klik <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69601/69601fig3v2large.jpg" target="_blank">hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figuur 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69601/69601fig4.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 4"> 
Figuur 4: RTddPCR-analyse van geselecteerde transcripten en kwantificering van mRNA-kopieën. (A,B) Representatieve eendimensionale amplitudeplots die druppelafscheiding tonen voor (A) Actγ, en (B) Gap43. Elke stip vertegenwoordigt een enkele druppel, waarbij blauwe druppels positieve versterking aangeven en grijze druppels negatieve versterking. De Y-as geeft de amplitude weer en de X-as geeft de positie van het putje in de ddPCR-plaat aan. Een duidelijke scheiding tussen positieve (blauwe) en negatieve (grijze) druppels bevestigt robuuste detectie van de doeltranscripten met de aangegeven primersets. (C) Tabel die het aantal kopieën/μL en kopieën per ng van het totale RNA voor Actγ- en Gap43-transcripten samenvat in hele neuron- en neurietfracties. Schattingen van het kopieeraantal werden verkregen uit absolute kwantificatie met ddPCR-druppeltellingen (weergegeven in panelen A,B). Klik <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69601/69601fig4large.jpg" target="_blank">hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Isolatie en kwantificering van axonale mRNA's met behulp van poreuze membraaninserts en RTddPCR

The spatial dynamics of mRNA localization and translation within neurons are essential for various mechanisms of neuronal function, including neuronal ...

isolation-quantification-axonal-mrnas-using-porous-membrane-inserts

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

In deze video-artikel stellen we een methode voor de isolatie en zuivering...

Isolatie en zuivering van Drosophila Perifere neuronen door Magnetic Bead sorteren

Neuronen zijn in de eerste elektrofysiologische gekarakteriseerd. Dan het cytoplasma van de opgenomen neuron is opgezogen en onderworpen aan transcriptie-PCR analyse achteruit om de expressie van mRNA's voor de neurotransmitters synthese enzymen, ion kanalen en receptoren op te sporen.

Profiling Voltage-gated kalium kanaal mRNA expressie in Nigral Neuronen met behulp van Single-cell RT-PCR-technieken

Een stap voor stap-protocol om het isoleren en identificeren van RNA bijbehorende complexen door middel van RIP-Chip.

Werkwijze voor het isoleren en identificeren van mRNAs, microRNA en eiwitcomponenten van ribonucleoproteïne complexen uit celextracten met RIP-Chip

Dit artikel beschrijft een neuronaal kweeksysteem dat kan worden gebruikt om grote hoeveelheden zuivere axonale monsters te verkrijgen voor biochemische en immunocytochemische analyses. Deze techniek zal een beter begrip mogelijk maken van normale axonale fysiologie en signaaltransductieroutes die leiden tot neurodegeneratie.

Productie en isolatie van axonen van sensorische neuronen voor Biochemische analyse met behulp van poreuze filters

In deze studie, een roman platform om intraneuronaal moleculaire handtekeningen van respons op de behandeling in een bipolaire stoornis (BD) te onderzoeken werd ontwikkeld en gevalideerd. Reukepitheel van BD-patiënten werd verkregen door middel van nasale biopsieën. Vervolgens werd laser-capture microdissection gecombineerd met Real Time RT PCR om de moleculaire signatuur van lithium reactie in BD onderzoeken.

Reukneuronen Verkregen door Neus Biopsie Gecombineerd met Laser-Capture Microdissection: Een benadering die voor Studie respons op de behandeling in Mental Disorders

Genexpressie analyse van een subset van cellen in een specifiek weefsel vormt een grote uitdaging. In dit artikel wordt beschreven hoe u een hoge kwaliteit totaal RNA van een specifieke cel populatie te isoleren door het combineren van een snelle immunolabeling methode met lasermicrodissectie.

RNA isolatie van de Cel specifieke subpopulaties met behulp van laser-capture Microdissection Gecombineerd met Rapid immunolabeling

RNA-eiwitinteracties liggen aan de basis van veel cellulaire processen. Hier beschrijven we een in vivo methode om specifiek RNA te isoleren en nieuwe eiwitten te identificeren die ermee geassocieerd zijn. Dit kan nieuw licht werpen op hoe RNA's in de cel worden gereguleerd.

Novel-RNA-bindende eiwitten Isolatie door de snelle Methodologie

Hier presenteren we een protocol voor de detectie van microRNA expressie in het peritoneale membraan van de ratten met behulp van kwantitatieve real-time reverse-transcriptie-polymerase kettingreactie. Deze methode is geschikt voor het bestuderen van het microRNA-expressieprofiel in het peritoneale membraan in verschillende pathologische omstandigheden.

Detectie van microRNA-expressie in peritoneale membraan van ratten met behulp van kwantitatieve real-time PCR

Dit protocol beschrijft de kritische stappen en voorzorgsmaatregelen moeten uitvoeren van eencellige multiplex omgekeerde transcriptie polymerase-kettingreactie na patch-clamp. Deze techniek is een eenvoudige en effectieve methode voor het analyseren van het profiel van de expressie van een vooraf vastgesteld samenstel van genen van een enkele cel gekenmerkt door patch-clamp recordings.

Eencellige Multiplex omgekeerde transcriptie Polymerase-kettingreactie na Patch-clamp

Een tandem RNA isolatie procedure (reis) voor herstel van endogeen gevormde mRNA-eiwitcomplexen wordt beschreven. Specifiek, RNA-eiwitcomplexen kruisverwijzende in vivo, polyadenylated RNAs zijn geïsoleerd uit extracten met oligo(dT) kralen en bepaalde mRNAs met gemodificeerde RNA antisense oligonucleotides worden vastgelegd. Eiwitten gebonden aan mRNAs worden gedetecteerd door analyse van de immunoblot.

Een Oligonucleotide gebaseerde Tandem RNA isolatie Procedure om te herstellen van eukaryotische mRNA-eiwitcomplexen

We bieden een protocol voor isolatie van Microglia uit verschillende ontleed gebieden van een volwassen muis hersen halfrond, gevolgd door semi-geautomatiseerde bibliotheek voorbereiding voor diepe eencellige RNA-sequencing van volledige lengte transcriptomes. Deze methode zal helpen om functionele heterogeniteit van Microglia in gezondheid en ziekte te verhelmaken.

Isolatie van regiospecifieke Microglia van één volwassen muis hersen halfrond voor diepe eencellige RNA-sequencing

Leer axonale mRNA-isolatie met poreuze membraaninserts en RT-ddPCR voor kwantificering van laag-abundante transcripten in neuronen. Deze methode ondersteunt onderzoek naar mRNA-transport en lokale translatie.

Isolatie en kwantificering van axonale mRNA's met behulp van poreuze membraaninserts en RTddPCR

Meer video's verkennen