Isolatie en kwantificering van axonale mRNA's met behulp van poreuze membraaninserts en RTddPCR

Ons onderzoek onderzoekt hoe lokale eiwitsynthese wordt gereguleerd en hun rol in neurale reparatie, ontwikkeling en degeneratie. Recente ontwikkelingen omvatten hooggevoelige mRNA-detectietechnieken, zoals gdPCR, voor het identificeren van laag-abundantie axonale MRNA's en het compartimenteren van neuronale culturen. Om te beginnen kun je 250 microliter triazol in een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter passen, die overeenkomt met elke insert in één put of insert van een zes-put plaat.

Houd de sondes apart tot ze nodig zijn. Voeg twee milliliter steriele PBS toe aan elke put van een tweede zes-put plaat, zodat het aantal putten of platen overeenkomt met het aantal inserts. Pipetteer het kweekmedium uit zowel de bovenste onderkant van de insert en breng de insert over in de zes-well-plaat met PBS.

Plaats nu met een tang voorzichtig het inzetstuk en voeg er twee milliliter PBS bovenop. Aspiraat de PBS van beide kanten en herhaal om twee keer te wassen. Laat het insert dan in verse PBS.

Gebruik vervolgens een steriele celschraper om de hele neuronfractie van de bovenkant van het inzetstuk te verwijderen. Verzamel het soma lysate uit het inlegblad. Doe het over in een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter.

Centrifugeer de buis op 10.000 tot 15.000 G gedurende twee minuten. Gooi het supernatant weg en suspendeer de pellet opnieuw in 250 microliter trizol. Label deze buis als de hele neuronfractie.

Om de neurietfractie te verzamelen, beweeg je het ene uiteinde van een steriel wattenstaafje langzaam in een zigzagpatroon van boven naar beneden aan de hele neuronzijde van het insert. Draai het inzetstuk 90 graden en herhaal dit met het andere uiteinde van het wattenstaafje. Gooi dan het wattenstaafje weg.

Gebruik een nieuw staafje en beweeg in concentrische cirkels, beginnend vanuit het midden van het inzetstuk naar buiten, waarbij je ook de omtrek schoonmaakt. Draai het inzetstuk om zodat de neurietzijde naar boven wijst. Snijd het membraan door met een nieuw steriel scalpelmesje.

Plaats het doorgesneden membraan in de zes-wellplaat met trizol met de neurietzijde naar beneden. Zorg ervoor dat het membraan ondergedompeld is. Haal nu de trizol met het neurietlysaat uit de put.

Doe het over in een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter. Ga verder met RNA-isolatie of sla de soma en neurietlysaten op bij min 80 graden Celsius voor latere verwerking. Bereid reverse transcriptie druppeldruppels digitale PCR-reacties voor met Droplet Digital PCR Ready-To-Use Universal Mix en richt specifieke primers met passend complementair DNA.

Pipetteer het reactiemengsel in de druppelgeneratiepatroon. Voeg vervolgens de generatieolie toe aan de aangewezen putten van de cartridge. Sluit nu de cartridge af met de pakking.

Genereer de druppels met behulp van de druppelgenerator. Zodra de druppels zijn gegenereerd, plaats je ze in een 96-put PCR-plaat en sluit je af met folie voordat je de plaat in de thermocycler plaatst. Open de QX Manager-software om de analyse te starten.

Klik op de optie Bladeren en open het bestand om geanalyseerd te worden. Wanneer het bestand geladen is, verschijnt het dashboardbeeld op het linkerpaneel. Selecteer de interessante putten door de Control-toets ingedrukt te houden tijdens het klikken.

Klik op 1D Amplitude om een dotplot te visualiseren. Selecteer Threshold Multiple Wells om dezelfde drempel op meer dan één put toe te passen. Voer de drempelwaarde in op basis van waar een duidelijke scheiding is tussen positieve en negatieve druppels.

Bekijk nu de gegevenssectie goed, waarin de monsterbeschrijving, concentratiewaarden, aantal geaccepteerde druppels, evenals positieve en negatieve druppeltellingen worden weergegeven. Klik op Opslaan om de drempelresultaten op te nemen. RNA-kwantificatie met behulp van de ribo-groene assay toonde aan dat hele neuronfracties 212,85 nanogram RNA per insert opleverden, terwijl neurietfracties 42,75 nanogram opleverden.

PCR-validatie identificeerde primerset één als de meest specifieke voor het Gap43-transcript, met een duidelijk enkele band. Onduidelijke PCR-resultaten voor gamma-actine leidden tot een temperatuurgradiënttest met primerset twee, die de sterkste versterking liet zien bij 55 graden Celsius. RT-ddPCR-amplitudeplots toonden duidelijke druppelafscheiding voor gamma-actine in zowel hele neuron- als neurietmonsters, wat betrouwbare transcriptdetectie bevestigde.

Voor Gap43 is bijna 23% van de mRNA-pool aanwezig in de neurieten, vergeleken met Gamma-actine, waar slechts 5% van de mRNA-pool aanwezig is in de neurieten in vergelijking met de hele neuronfractie. We hebben de aanwezigheid van stressgranule-structuren in de axonen onder fysiologische omstandigheden aangetoond, die de lokale eiwitsynthese remmen. Ons protocol biedt een betrouwbare en consistente methode om neuronale compartimenten te isoleren en mRNA's in lage omgeving te detecteren.

Toekomstige analyses zullen zich richten op het isoleren en karakteriseren van verschillende axonale subdomeinen, zoals groeikegels en axonale schacht, buiten bulkanalyse.