Vergelijkende RNA-structuuranalyse van ontluikende en rijpe transcripten in Saccharomyces cerevisiae

We bestudeerden cotranscriptionele RNA-verwerking, en dat omvat hoe onthullend RNA zich vouwt wanneer het uit de RNA-polymerase ontstaat die het synthetiseert. Voor deze methode konden we niet monitoren hoe RNA zich vouwt tijdens de synthese, en dit hield ons onderzoek tegen. Dus deze nieuwe methode overwint die gaten.

CoSTseq werd ontwikkeld om het opkomende RNA-vouwen in gist te onderzoeken. Het is bijzonder effectief voor het analyseren van zeer overvloedige RNA's. Om te beginnen inoculeer je de stam BY4741 van Saccharomyces cerevisiae in 50 milliliter YPAD-medium en breng je bij 30 graden Celsius met schudden van 200 omwentelingen per minuut totdat de cultuur de mid-logitmafase bereikt.

Verzamel ongeveer drie milliliter gistcultuur die overeenkomt met 1,8 optische dichtheidseenheden en centrifugeer op 2.500 x g gedurende drie minuten bij vier graden Celsius met een voorgekoelde centrifuge. Gooi het supernatant weg in een afvalcontainer. Sussen de pellet opnieuw in 10 milliliter koude PBS en centrifugeer opnieuw op 2.500 x g gedurende drie minuten bij vier graden Celsius.

Verwijder het supernatant en bewaar de gistpellet op ijs. Suspendeer de gistpellet voorzichtig opnieuw in 10 milliliter koude 0,5% sarkosyl zonder bellen te veroorzaken. Incubeer de opnieuw gesuspendeerde gist 20 minuten op ijs om permeatie mogelijk te maken, pellet de cellen vervolgens op 400 x g gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius en suspendeer de doorlatende gistcellen opnieuw in 100 microliter nucleasevrij water met een P-1000 pipet.

Bereid een werkoplossing voor van 2,5X transcriptiebuffer met vers toegevoegde vijf millimolaire dithiothreitol en verwarm de 2,5X structuurprobingbuffer voor tot 30 graden Celsius. Voeg in een schone buis van twee milliliter alle benodigde reactiecomponenten toe en meng grondig. Voeg vervolgens 100 microliter van de voorbereide gistcellen toe aan de reactiebuis en bebroeus deze in de thermomixer die op 30 graden Celsius staat, met het schudden van 500 omwentelingen per minuut gedurende twee minuten.

Voeg vervolgens snel 200 microliter van de voorverwarmde 2,5X structuur-sondebuffer toe, en tegelijkertijd 25 microliter dimethylsulfaatreagens. Vortex de buis voorzichtig in twee pulsen en plaats hem terug in de broedmachine ingesteld op 30 graden Celsius en 500 omwentelingen per minuut. Blijf vier minuten op de thermomixer incuberen, met een tussenruimte van 30 seconden tussen de monsters.

Bereid de stop- en wasbeschermers van tevoren voor en leg ze op ijs tot gebruik. Stop de methylsulfaatmethylering door één milliliter stopbuffer aan de reactiebuis toe te voegen. Centrifugeer nu de met dimethylsulfaat gelabelde monsters op 3.500 x g gedurende vijf minuten in een voorkoelde centrifuge.

Na het draaien gooi je het supernatant weg in een geschikte afvalcontainer. Voeg één milliliter gekoelde wasdemper toe aan de pellet en sussie opnieuw. Herhaal de centrifugatie op 3.500 x g gedurende vijf minuten.

Ga direct over tot RNA-extractie en vries de gistpellet niet in. Sussen de met dimethylsulfaat gelabelde gistpellet opnieuw in 600 microliter RNA-lysisbuffer en breng de suspensie vervolgens over in een buis met 40 microliter natriumdodecylsulfaat. Incubeer het monster bij 65 graden Celsius gedurende 30 seconden, met schudden van 950 omwentelingen per minuut.

Vervolgens voer fenol-chloroform-extractie van RNA uit volgens de standaardprocedure. Vortex de streptavidine magnetische korrels en overbrengen 44 microliter van de kralen naar een nieuwe buis voor elk monster van 80 microgram totaal RNA. Plaats de magnetische kralen op een magnetisch rek totdat de kralen bezonken zijn.

Na het verwijderen van de opslagbuffer sussend je de kralen opnieuw in één milliliter voorwasbuffer A. Breng de suspensie nu twee minuten uit bij kamertemperatuur, magnetiseer en verwijder dan het supernatant. Na het wassen breng je de kralen opnieuw in 88 microliter 2X bindingsbuffer. Breng 80 microliter suspensie over in een steriele buis van 1,5 milliliter met 80 microgram biotinyleerd RNA-monster in 80 microliter.

Draai het parelmonstermengsel 20 minuten op een rotator op kamertemperatuur. Plaats vervolgens de buis op het magnetische rek om de stroom op te vangen met volwassen RNA en bewaar deze voor precipitatie om poly-A selectie van rijpe RNA's uit te voeren met behulp van de DMS-MaPseq workflow. Spoel vervolgens het kraal-nascent RNA-complex twee keer met 500 microliter hoge zoutbuffer.

Spoel daarna één keer met 500 microliter 1X bindingsbuffer, gevolgd door een laatste spoeling met 500 microliter laag zout buffer. Voeg nu 300 microliter RNA-reagens toe aan het bead=nascent RNA-complex, hersuspendeer grondig en incubeer vijf minuten op de thermomixer bij 60 graden Celsius. Voeg vervolgens 60 microliter chloroform toe, vortex en breng drie minuten uit bij kamertemperatuur.

Centrifugeer het monster op 14.000 x g gedurende vijf minuten in de voorkoelde centrifuge. Breng tenslotte de bovenste waterige fase ongeveer 180 microliter over naar een nieuwe verzamelbuis. Verwijder de resterende organische fase, waarbij de kralen en de resterende waterige oplossing worden achtergelaten.

Na het zuiveren van het beginnende RNA voer je sjabloonwisseling reverse transcriptie uit, ligate je de 5'-adapter en selecteer je bibliotheken voor sequencing. Visualisatie van de test-PCR-producten op een 1%agarosegel toonde minimale primerdimervorming en een karakteristieke uitstrijk rond 300 basenparen voor co-transcriptionele structuursequencing of CoSTseq- en DMS-MaPseq-bibliotheken. Het elektroferogram van CoSTseq monster één bevestigde de bibliotheekgrootteverdeling met een piek rond 285 basenparen.

Leesuitlijning van ASC1 mRNA toonde aan dat de CoSTseq-bibliotheek dekking over het hele intron omvatte, wat bevestigt dat het RNA nog in de beginfase is. Terwijl de DMS-MaPseq-bibliotheek geen introndekking had, wat aangeeft dat het RNA rijp is. De cot-transcriptionele vouwmatrix van 18S pre-rRNA toonde aan dat de DMS-reactiviteit abrupte veranderingen vertoonde naarmate RNA-polymerase van positie 790 naar 811 langs de rDNA-locus vorderde.

DMS-reactiviteitsanalyse van ADH1 mRNA toonde vergelijkbare profielen tussen beginnende en volwassen vormen, wat wijst op regio's van structurele stabiliteit. Daarentegen vertoonde SSA2 mRNA regio's met verschillende DMS-reactiviteit tussen beginnende en volwassen vormen, wat wijst op structurele veranderingen tijdens de rijping. Met CoSTseq kunnen onderzoekers in vivo beginnende RNA-secundaire structuren en de positie van RNA-polymerase langs RNA-transcripten bepalen.

CoSTseq heeft tijdgevoelige stappen en gebruikt giftige chemicaliën. Het is beter om niet meer dan twee monsters tegelijk te verwerken. Uit het totale RNA dat wordt gegenereerd uit CoSTseq, kunnen niet-biotinyleerde RNA's worden gebruikt voor gelijktijdige volwassen structuurprobing met traditionele DMS-MaPseq.