Morfometrische analyses van vorm: De analysesoftware-toolbox voor craniofaciale vormkwantificatie bij zebravissen

Ons onderzoek gebruikt morfometrische software om te kwantificeren of ethanol en bmp7a met elkaar interageren en subtiele craniofaciale defecten veroorzaken bij zebravissen. Lineaire maten missen subtiele veranderingen. Met deze methode gebruiken we herkenningspunten om vormveranderingen te kwantificeren en tegelijkertijd te controleren op grootteverschillen.

Om te beginnen open je de tpsDigs2-software. Klik op Input source, vervolgens op File, en selecteer het opgeslagen TPS Notepad-bestand. Klik op Opties om de optie Afbeeldingstools te visualiseren.

Stel de referentielengte in op 100 micrometer en druk op de Set-schaal. Klik op OK om de schaalparameters te bevestigen en sluit dan het venster Image tools. Klik vervolgens op het richtsymbool en plaats het eerste herkenningspunt op de middenlijn tussen de kraakbeen van de Meckel.

Plaats de tweede herkenningspunten bij de bilaterale gewrichten tussen Meckel's en het palatoquadraat kraakbeen. Plaats het derde herkenningspunt bij het middenlijngewricht tussen de ceratohyale kraakbeen en het vierde herkenningspunt bij de bilaterale gewrichten tussen het palatoquadraat en ceratohyale kraakbeen. Plaats vervolgens de vijfde herkenningspunten aan het distale uiteinde van de hyomandibulaire kraakbeen, zodat herkenningspunten voor elk beeld in dezelfde volgorde worden geplaatst.

Klik na het plaatsen van herkenningspunten op Bestand om het dropdownmenu te openen. Selecteer gegevens opslaan en vervolgens Overschrijven om het bijgewerkte bestand op te slaan. Verlaat de tpsDigs2-software.

Start de MorphoJ-software. Klik op Bestand, selecteer Create New Dataset en wijs een naam toe aan de dataset. Klik op TPS en selecteer het Notepad-bestand met de nieuw toegevoegde datapunten.

Maak vervolgens de dataset aan. Klik in de projectboom op de dataset. Selecteer Preliminaries, daarna New Procrustes Fit.

Kies Aligneren op hoofdassen en klik op Uitvoeren Procrustes Passen. Selecteer onder Preliminaries Covariantiematrix genereren om procrustescoördinaten te verkrijgen. Voer de functie uit wanneer daarom wordt gevraagd.

Selecteer nu Wireframe maken of bewerken en koppel de punten op de afbeeldingen. Klik op gekoppelde punten en accepteer of maak de afbeelding, en bewerk classifiers indien nodig. Open een spreadsheetprogramma terwijl je MorphoJ open houdt.

Voer classifierinformatie in zoals GENOTYPE, TREATMENT en GENOTYPE TREATMENT. Sla het bestand vervolgens op als een CSV-bestand. Klik in MorphoJ op Bestand en selecteer Importeren Classifiervariabelen om het CSV-bestand te importeren. Ga terug naar de projectboom en klik op de dataset.

Selecteer onder Preliminaries Classifiers Bewerken om te bevestigen dat alle afbeeldingen zijn opgenomen. Selecteer in de projectboom CovMatrix en klik vervolgens bovenaan de pagina op Variatie. Selecteer Principal Component Analysis om de score van principal component te berekenen.

Klik op PC-scores om de gegenereerde grafiek weer te geven. Klik met de rechtermuisknop op de grafiek en selecteer Betrouwbaarheidsellips om de gewenste classifier toe te voegen. Selecteer Kleurgegevenspunten, wijs kleuren toe en klik op OK om wijzigingen toe te passen.

Selecteer onder Voorlopige opties instellen voor de vormgrafiek onderaan het scherm. Kies Wireframe Graphs en pas de kleuren van de doelvorm, startvorm en getallen aan. Selecteer variatie, kies vervolgens procrustes ANOVA.

Exporteer de PROCRUSTES ANOVA-resultaten naar het eerder aangemaakte spreadsheetbestand. Selecteer in MorphoJ de originele dataset in Project Tree. Klik op Vergelijking, daarna op Canonieke Variaatanalyse.

Selecteer de classifiervariabelen GENOTYPE TREATMENT en voer de functie uit. Om de resultaten te exporteren, klik je op het tabblad Resultaten en klik je met de rechtermuisknop op de resultatenpagina. Selecteer Exporteren naar Bestand en sla de resultaten op.

Selecteer in Project Tree Canonical Variate Analysis en vervolgens scores. Klik op Bestand, kies Exporteren Dataset, selecteer het datatype en GENOTYPE BEHANDELING. Sla de CVA-scores op als een TXT-bestand.

Om het bestand voor te bereiden voor PAST-software, open je de opgeslagen CVA-scores in een teksteditor. Vervang het term id linksboven door Label en sla het bewerkte bestand op. Open de PAST-software en klik op Bestand, en open dan om het bewerkte CVA-scorebestand te selecteren.

In het importvenster. Selecteer Namen, gegevens voor rij en kolom en Tab als scheidingspunt, en klik dan op Importeren. Selecteer onder het tabblad Weergeven kolomattributen.

Wijs in het dropdownmenu naast Type Groep toe aan de eerste kolom met classifiervariabelen. Markeer de hoofdcomponent- of canonieke variabele datakolommen. Selecteer Multivariate, vervolgens Tests, en kies Multivariate normality om de normaliteitstest apart uit te voeren voor principal component en canonical variate data.

Klik op de grijze lege cel linksboven Type om de volledige dataset te selecteren. Selecteer Multivariate, vervolgens Tests, en kies multivariate analyse van varianten om de analyse uit te voeren. Exporteer de MANOVA-resultaten naar het eerder aangemaakte spreadsheetbestand.

Beelden van het viscerocranium werden gemaakt voor elke larve in elk genotype en behandelgroep. Kraakbeen van het viscerocranium werd gelabeld in een representatieve afbeelding, en op elke afbeelding werden herkenningspunten geplaatst om datasets met herkenningspunten te genereren. Hoofdcomponent 1 was verantwoordelijk voor ongeveer 34% van de totale vormvariatie en hoofdcomponent 2 voor 20% van de totale vormvariatie.

Elke hoofdcomponent vertoonde specifieke variatie in de vorm van de viscerocraniale vorm ten opzichte van de gemiddelde vorm van alle viscerocranie. De hoofdcomponentanalysegrafiek toonde overlappende gemiddelden tussen de genotype- en behandelgroepen zonder duidelijke clustering. Ethanolbehandelde wildtypelarven vertoonden een grote 95% betrouwbaarheidsellips van het gemiddelde vanwege de lage steekproefgrootte.

Canonieke variaat 1 vertegenwoordigde een subtiele verkorting of verlenging van het ceratohyale gewricht in het magenta wireframe ten opzichte van het gemiddelde zwarte wireframe. Canonieke variaat 2 vertoonde een verschuiving mediaal alleen aan één zijde van het viscerocranium bij de gewrichten tussen het Meckel-palatoquadraat en het palatoquadrat-ceratohyal. Ethanol-behandelde wildtypelarven vertoonden een grote ellips van 95% betrouwbaarheid van het gemiddelde die alle andere groepen overlapte.

Multivariate analyse van varianten toonde een significant algemeen effect op genotype en behandeling. Consistente montage van samples is de grootste uitdaging. Schuine larven kunnen onnauwkeurige metingen veroorzaken en de resultaten beïnvloeden.

Dit protocol past zich aan verschillende anatomische structuren aan, analyseert 3D-gegevens, genereert lineaire metingen en helpt bij het bepalen van de monstergroottes van experimentele monsters. Toekomstige studies zullen andere genotype-ethanolgevoeligheden onderzoeken, de steekproefgroottes uitbreiden en deze veelzijdige gereedschapskist toepassen op diverse anatomische structuren.