Generatie en eencel-transcriptomische analyse van hepatocellulaire carcinoomorganoïden na medicamenteuze behandeling
26 mei 2026
Dit protocol schetst een gestroomlijnde methode voor het genereren van hepatocellulaire carcinoomorganoïden, het toepassen van medicamenteuze behandeling en het uitvoeren van single-cell RNA-sequencing voor en na de behandeling om therapiegerelateerde transcriptieveranderingen te karakteriseren.
We richten ons op hoe HCC-organoïden reageren op medicamenteuze behandeling en hoe hun translationele studies op het werk veranderen. Dit protocol is nuttig voor HCC-organoïden en kan ook worden aangepast aan andere tumororganoïdesystemen. Om te beginnen vestig je hepatocellulair carcinoom of organoïden afkomstig van HCC-patiënten en bereid je deze voor op therapeutische verstoring.
Bereid de lenvatinibbouillonoplossing voor in dimethylsulfoxide, of DMSO, volgens de instructies van de fabrikant. Verdun de bouillonoplossing direct voor gebruik in een voorwarme cultuurmedium tot de vooraf gedefinieerde werksconcentratie. Bereid voldoende oplossing voor om gelijke eindvolumes in alle putten te bereiken, zodat dezelfde DMSO-concentratie in elke put wordt gegarandeerd.
Voeg vervolgens lenvatinib-houdend medium toe op 20 micromolair langs de wand van elke put om verstoring van de matrixkoepels te voorkomen. Voeg een voertuigbesturing toe met dezelfde uiteindelijke DMSO-concentratie. Incubeer de organoïden onder standaard kweekomstandigheden gedurende de vooraf bepaalde behandelperiode.
Voor behandelingen die langer zijn dan 72 uur, vervang het medium met geneesmiddel elke 48 tot 72 uur, zodat een consistent vervangingsschema in alle putten wordt gegarandeerd. Registreer baseline brightfield-beelden vóór de behandeling. Maakt beelden op vaste intervallen tijdens de behandeling met identieke microscoopinstellingen, vergroting en veldposities.
Voor morfologie-gebaseerde evaluatie van de behandelingsrespons gebruik je identieke belichtingsinstellingen, vergrotings- en analysedrempels voor alle beelden. Meet de groeicurve van het organoïdegebied door het totale organoïde-oppervlak, per put of veld, op elk tijdstip te berekenen en de waarden te normaliseren naar de basislijn. Om de gemiddelde organoïdediameter te meten, bepaal je de diameter van individuele intacte organoïden en bereken je de gemiddelde waarde per put.
Bepaal vervolgens het aantal overgebleven organoïden door morfologisch identificeerbare intacte organoïden te tellen, terwijl eventuele resten of ingestorte fragmenten worden uitgesloten. Voer een driedimensionale luminescentie-levensvatbaarheidsassay uit aan het behandeleindpunt als aanvullende bulk-levensvatbaarheidsbeoordeling nodig is volgens de instructies van de fabrikant. Vervolgens plot je de groeicurves van het organoïde gebied over de tijd.
Vergelijk de gemiddelde organoïdediameter tussen de door het voertuig behandelde en lenvatinib-behandelde groepen. Vergelijk ook overgebleven organoïdentellingen tussen behandelgroepen. Zorg ervoor dat consistente beeldschema's, inclusiecriteria en analyseparameters worden gebruikt om reproduceerbaarheid te waarborgen.
Selecteer organoïde putten met intacte 3D-morfologie, voldoende materiaal voor singlecel-vangst en geen zichtbare besmetting. Leg helderveldbeelden van elk geselecteerd vast ruim voor dissociatie met identieke microscoopinstellingen, vergrotings- en veldselectiecriteria. Verzamel organoïden op overeenkomende tijdstippen tussen controle- en behandelde groepen, terwijl identieke platingdichtheid, behandelschema en mediumvervangingscondities voor alle monsters behouden blijven.
Aspireer het kweekmedium volledig uit elke put. Was elke bron twee keer met ijskoude PBS om restmateriaal en vuil te verwijderen. Voeg één milliliter ijskoude celhersteloplossing toe aan elke put en broede 20 tot 30 minuten op ijs.
Pipette voorzichtig elke vijf tot zeven minuten tijdens de incubatie om de oplossing van de matrix te vergemakkelijken. Breng het opgeloste materiaal over in voorgekoelde buizen met een brede boring of gesneden pipettip om de schuifspanning te minimaliseren. Ga pas over tot enzymatische dissociatie nadat de matrix grotendeels is opgelost en er minimaal zichtbaar gelresidu overblijft.
Centrifugeer de teruggewonnen organoïde suspensie bij 300 G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius. Verwijder het supernatant voorzichtig zonder het pelletje te verstoren. Sussen de pellet opnieuw in één milliliter recombinant celdissociatie-enzym en incubeer bij 37 graden Celsius gedurende vijf tot tien minuten.
Pipetteer voorzichtig acht tot tien keer elke twee tot drie minuten, met een brede pijp van P1000, om dissociatie te bevorderen. Stop de vertering wanneer de meeste organoïde fragmenten zijn verspreid in enkele cellen, en alleen kleine restclusters overblijven. Voeg vervolgens vier milliliter ijskoude PBS toe met 2% foetaal rundserum om de spijsvertering te stoppen.
Filter vervolgens de suspensie door een 40-micrometer celfilter. Was één keer met PBS om restenzymen, aggregaten en vuil te verwijderen. Tel de cellen met trypan blue exclusion.
Na het waarborgen van de cellevensvatbaarheid van 85% of meer, pas je de uiteindelijke celconcentratie aan op 700 op 1.200 cellen per microliter. Sluit monsters met overmatig afval, overvloedige dode cellen, grote zichtbare aggregaten of onvolledige dissociatie uit. Herhaal de filtratie vóór het laden als er aggregaten aanwezig zijn.
Procescontrole en behandelde monsters onder identieke omstandigheden, waaronder het dissociatie-enzym, de verteringstijd, de pipetfrequentie, de filtratiemethode, de celconcentratie en de laadstrategie. Tot slot, na enkelcel-bibliotheekversterking, wordt single-celsequencing uitgevoerd. Organoïde overleefde en breidde zich uit onder standaard driedimensionale kweekomstandigheden van dag één tot dag zes na herstel.
Op dag één verschenen organoïden als kleine, compacte structuren, terwijl ze op dag zes een grotere omvang en een goed gedefinieerde morfologie vertoonden. Met lenvatinib behandelde organoïden waren kleiner en vertoonden een veranderde morfologie vergeleken met DMSO-behandelde controles. Kwantitatieve analyse toonde een vermindering van de gemiddelde organoïde diameter na lenvatinibbehandeling vergeleken met DMSO-controles.
Dit protocol stelt ons in staat veranderingen in celtoestand, cellulaire samenstelling en genexpressie na behandeling te bestuderen. De grootste uitdaging is het behouden van cellevensvatbaarheid, zodat eenvoudige verwerking consistent blijft tussen alle groepen. Cellulaire downstream-analyse kan worden uitgevoerd volgens deze procedure, waaronder clustering, analyse van differentiële genexperimenten, analyse van padverrijking en treasury-inferentie.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overview
This article presents a standardized workflow for generating hepatocellular carcinoma (HCC) organoids, applying drug treatment, and performing single-cell RNA sequencing to analyze transcriptional changes before and after treatment. The protocol is robust, scalable, and adaptable to other tumor organoid systems, enabling detailed characterization of cellular composition and gene expression changes associated with drug exposure.
Key Study Components
Area of Science
- Cancer biology
- Organoid technology
- Single-cell transcriptomics
Background
- Hepatocellular carcinoma is a leading cause of cancer-related deaths worldwide.
- Marked intratumoral heterogeneity in HCC contributes to variable treatment responses and disease progression.
- Understanding transcriptional changes in tumor cells before and after drug treatment is critical for improving therapies.
- Existing workflows connecting organoid-based drug treatment with single-cell transcriptomic profiling are limited.
Purpose of Study
- To develop a reproducible protocol for drug treatment and single-cell RNA sequencing of HCC organoids.
- To enable side-by-side comparison of cellular and transcriptional changes in response to therapy.
- To provide technical guidance for improving reproducibility and sample quality in organoid studies.
Methods Used
- Establishment and expansion of HCC patient-derived organoids.
- Drug treatment with lenvatinib and vehicle control under standardized conditions.
- Imaging and quantitative assessment of organoid morphology, area, diameter, and viability.
- Single-cell dissociation, viability assessment, and preparation for single-cell RNA sequencing.
- Comparative analysis of single-cell transcriptomic data, including clustering and pathway enrichment.
Main Results
- Lenvatinib-treated organoids showed reduced size and altered morphology compared to controls.
- Quantitative analysis revealed a decrease in mean organoid diameter after drug treatment.
- The protocol preserved high cell viability and reproducibility across samples.
- Single-cell RNA sequencing enabled detailed analysis of cell state, composition, and gene expression changes post-treatment.
Conclusions
- The workflow provides a practical and scalable approach for studying drug responses in HCC organoids at single-cell resolution.
- It facilitates robust comparative analysis of transcriptional changes associated with therapy.
- The protocol is adaptable to other organoid systems and supports downstream cellular analyses.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
Single-cell transcriptomic profiling of hepatocellular carcinoma (HCC) organoids before and after drug treatment addresses the challenge of intratumoral heterogeneity and variable therapeutic response. This workflow enables high-resolution analysis of cellular and transcriptional changes, supporting predictive confidence in early-stage oncology discovery. The protocol's scalability and adaptability position it as a reusable platform for portfolio-wide mechanistic de-risking and target validation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of therapeutic hypotheses by capturing drug-induced transcriptional shifts at single-cell resolution.
- Supports biological de-risking through detailed mapping of cell state and composition changes post-treatment.
- Facilitates functional target validation by linking drug exposure to specific gene expression alterations.
- Provides predictive confidence for triaging candidate compounds based on mechanistic response profiles.
Screening & Assay Development
- Prepares validated organoid systems for downstream screening and quantitative assessment of drug effects.
- Standardizes imaging, viability, and morphological metrics to ensure reproducibility and assay reliability.
- Enables scalable, side-by-side evaluation of compound efficacy using robust, quantitative outputs.
- Supports platform reuse across different tumor organoid models for broader screening applications.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro drug response data with disease-relevant cellular heterogeneity observed in patient tumors.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by enabling comparative transcriptomic analysis.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by revealing pathway-level and cell-type-specific drug effects.
- Enhances predictive de-risking for translational biomarker identification and validation.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates from early discovery through lead identification and preclinical research, bridging drug perturbation studies with high-content single-cell analytics.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by mapping drug-induced gene expression changes.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative readouts for compound evaluation in organoid models.
- Analytics: Enables clustering, differential expression, and pathway enrichment analyses to compare treatment conditions.
- Translational Research: Connects in vitro findings to disease-relevant cellular diversity and biomarker discovery.
- Enterprise Reuse: Provides a standardized, adaptable workflow for repeated use across oncology portfolios.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in drug response studies.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable workflows for organoid-based analytics.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by enabling robust early-stage de-risking.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of oncology assets based on high-content data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in organoid culture, single-cell dissociation, and transcriptomic library preparation.
- Demands access to advanced imaging, cell viability assessment, and single-cell sequencing infrastructure.
- Necessitates strict cross-team standardization of imaging, dissociation, and analysis parameters for reproducibility.
- Adaptable across different tumor organoid systems with attention to model-specific dissociation and viability challenges.
- Sample quality and cell viability are critical limitations that must be managed throughout processing.
