Technika aseptyczna w naukach o środowisku

1. Przygotowanie do prac aseptycznych

1. Zaopatrz się w następujące środki ochrony indywidualnej i załóż je: fartuch laboratoryjny, rękawice lateksowe lub nitrylowe (wolne od rozdarć lub dziur) oraz okulary ochronne (Rysunek 1). Dla bezpieczeństwa w przypadku użycia otwartego ognia zwiąż długie włosy.
   
   Rysunek 1: Środki ochrony indywidualnej: fartuch laboratoryjny, rękawice lateksowe i okulary ochronne.
2. Drugim ważnym aspektem techniki aseptycznej jest właściwa sterylizacja i przechowywanie pożywek/odczynników, które mają być używane w laboratorium. Przygotuj płynną pożywkę bulionową (e.g., tryptyczny bulion sojowy) i pożywkę na bazie agaru (e.g., R2A), ważąc odpowiednią ilość suszonego proszku bazowego, który dodaje się do odpowiedniej ilości wody dejonizowanej.
3. W przypadku pożywki bulionowej rozpuść proszek na gorącej płycie z małym ogniem i dozuj płyn w objętościach 100 ml do szklanych kolb zakręcanych lub w objętościach 10 ml do szklanych zakręcanych probówek. Za pomocą mieszadła magnetycznego mieszaj pożywkę agarozową na mieszadle z płytą grzejną, aż proszek całkowicie się rozpuści.
4. Do pojemników należy przyłożyć taśmę autoklawową i autoklawować media zgodnie z instrukcjami producenta (e.g., 20 min w temperaturze 121 °C) (Rysunki 2 i 3). Należy pamiętać, że kolor pasków na taśmie autoklawu powinien zmienić się z białego (pre-autoklaw) na czarny (post-autoklaw). Chociaż zmiana koloru ogólnie wskazuje, że sterylizacja się powiodła, można przeprowadzić kontrole sterylności przy użyciu zestawów pasków z zarodnikami w celu zweryfikowania procesu autoklawowania.
   
   Rysunek 2: Taśma autoklawowa nakładana na materiał.
   
   Rysunek 3: Zwróć uwagę na zmianę koloru pasków na taśmie autoklawu z białego (przed autoklawem) na czarny (po autoklawie).
5. Schłodzić płynny bulion do temperatury pokojowej, a następnie przechowywać w temperaturze pokojowej lub w lodówce w temperaturze 4 °C.
6. Schłodzić pożywkę agarozową, umieszczając pojemnik w łaźni wodnej nastawionej na ~50 °C. Po schłodzeniu pożywkę można przelać do sterylnych szalek Petriego. Pozostawić pożywkę do ostygnięcia i zestalenia, a następnie skonsolidować w celu przechowywania w temperaturach określonych przez producenta.
7. Istnieje kilka odmian pożywek hodowlanych, których nie można sterylizować w autoklawie, ponieważ wysokie temperatury degradują krytyczne składniki. Sterylizacja wymaga sterylizacji filtra za pomocą systemu filtracji próżniowej wykorzystującego filtr 0,22 μm, a następnie przechowywania w odpowiedniej temperaturze.
8. Przed przystąpieniem do pracy na blacie należy zdezynfekować powierzchnię za pomocą odpowiedniego roztworu (e.g., wybielacz 500 ppm). Zmniejsza to ryzyko przeniesienia zanieczyszczeń z powierzchni roboczej do kultur i sterylnych pożywek.
9. Aby ustanowić sterylne pole, włącz palnik Bunsena. Rodzaj płomienia najlepiej nadający się do sterylizacji metalowych pętli zaszczepiających to intensywnie niebieski płomień, z wyraźnym niebieskim stożkiem obserwowanym pośrodku (Rysunek 4).
   
   Rysunek 4: Przeniesienie bakterii z jednej płytki Petriego wykazującej wzrost hodowanego izolatu na inną niezaszczepioną płytkę Petriego zawierającą pożywkę wzrostową na bazie agaru.
10. Powoli przełóż pętlę zaszczepiającą przez najgorętszą część płomienia (końcówka niebieskiego stożka). Pętla powinna rozgrzać się do czerwoności w celu sterylizacji.

2. Transfery bakteryjne: z płytki Petriego na płytkę Petriego

1. Jednym ze scenariuszy przenoszenia bakterii jest przeniesienie z jednej płytki Petriego wykazującej wzrost hodowanego izolatu na inną, sterylną płytkę Petriego zawierającą pożywkę wzrostową na bazie agaru.
2. Na początek lekko otwórz płytkę Petriego zawierającą czystą kulturę bakteryjną i delikatnie postukaj gorącą, wysterylizowaną pętlę zaszczepiającą w powierzchnię agaru.
3. Pobrać jedną izolowaną kolonię z powierzchni płytki za pomocą schłodzonej pętli zaszczepiającej i zamknąć płytkę Petriego.
4. Wykonać serię izolacji przy użyciu świeżej płytki Petriego zawierającej pożywkę hodowlaną, z lekko uchyloną pokrywką.
5. Dla każdej części smugi izolacyjnej (w sumie 3 na płytkę) wysterylizuj płomieniowo pętlę zaszczepiającą tuż przed użyciem. Ponadto, wysterylizuj płomieniowo pętlę zaraz po wykonaniu ostatniej smugi, aby zapobiec zanieczyszczeniu powierzchni stołu i jako wzgląd na inne osoby w laboratorium, które mogą później użyć lub wejść w kontakt z pętlami zaszczepiającymi.
6. Umieść płytki z prążkami w inkubatorze do wzrostu przez noc.

3. Transfery bakteryjne: od kultury bulionu do płytki Petriego

1. Drugi scenariusz przenoszenia bakterii polega na przeniesieniu bakterii z kultury bulionowej wykazującej wzrost, co zwykle obserwuje się przez zmętnienie, na sterylną płytkę Petriego zawierającą pożywkę wzrostową.
2. Zdejmij nakrętkę z probówki (lub kolby) zawierającej czystą kulturę bakteryjną i przepuść otwór pojemnika 2-3 razy przez najgorętszą część płomienia. Aby zapobiec zanieczyszczeniu, nie kładź nasadki na blacie.
3. Ostrożnie opuść wysterylizowaną pętlę zaszczepiającą do probówki/kolby i delikatnie dociśnij do boku pojemnika, aby ostygł tuż przed włożeniem do kultury bulionowej.
4. Usuń jedną pętlę kultury bulionowej (Rysunek 5) i natychmiast załóż nakrętkę.
   
   Rysunek 5: Jedna pętla kultury bulionowej.
5. Wykonaj serię do izolacji, używając świeżej płytki Petriego zawierającej pożywkę hodowlaną, z lekko uchyloną pokrywką.
6. Dla każdej porcji smugi (łącznie 3 na płytkę) wysterylizuj płomieniowo pętlę zaszczepiającą tuż przed użyciem. Również wysterylizuj pętlę płomieniowo zaraz po wykonaniu ostatniej smugi, aby zapobiec zanieczyszczeniu powierzchni stołu i jako wzgląd na inne osoby w laboratorium, które mogą później użyć pętli zaszczepiających.
7. Umieść płytki z prążkami do izolacji w inkubatorze w celu wzrostu przez noc.

4. Przenoszenie bakterii: od płytki Petriego ze wzrostem do sterylnego płynnego podłoża

1. Trzeci scenariusz przenoszenia bakterii polega na przeniesieniu z płytki Petriego zawierającej izolowaną smugę kultury do probówki/kolby zawierającej sterylną płynną pożywkę wzrostową.
2. Lekko otworzyć szalkę Petriego zawierającą czystą kulturę bakteryjną i schłodzić gorącą pętlę zaszczepiającą, delikatnie stukając nią w powierzchnię agaru.
3. Pobrać jedną izolowaną kolonię z powierzchni płytki za pomocą schłodzonej pętli zaszczepiającej i zamknąć płytkę Petriego.
4. Zdjąć nakrętkę z probówki (lub kolby) zawierającej sterylną płynną pożywkę wzrostową i przepuścić otwór pojemnika 2 do 3 razy przez najgorętszą część płomienia. Aby zapobiec zanieczyszczeniu, nie kładź nakrętki na blacie.
5. Ostrożnie opuść wyekstrahowaną kolonię do płynnego podłoża bulionowego i delikatnie porusz pętlę, aby uwolnić bakterie. Natychmiast załóż nasadkę.
6. Sterylizuj płomieniowo pętlę zaszczepiającą, aby zapobiec zanieczyszczeniu powierzchni stołu i jako wzgląd na inne osoby w laboratorium, które mogą później korzystać z pętli zaszczepiających.
7. Umieścić kolbę w inkubatorze w celu wzrostu na noc.
8. Następnego dnia wyjąć kolbę z inkubacji. Wykonaj serię rozcieńczeń, aby wyliczyć kulturę.
9. Rozcieńczenia z serii należy rozłożyć na płytkach na pożywkach do hodowli agarozy i inkubować płytki przez noc.
10. Wyjmij płytki następnego dnia i obserwuj, czy nie ma zanieczyszczeń.

5. Przenoszenie bakterii: od kultury bulionu do sterylnego płynnego podłoża wzrostowego

1. Czwartym scenariuszem przenoszenia bakterii jest przeniesienie kultury bulionu wykazującej wzrost do probówki/kolby zawierającej sterylną płynną pożywkę wzrostową.
2. Zdjąć nakrętkę z probówki (lub kolby) zawierającej czystą kulturę bakteryjną i dwukrotnie przepuścić otwór pojemnika przez najgorętszą część płomienia. Aby zapobiec zanieczyszczeniu, nie kładź nasadki na blacie.
3. Ostrożnie opuść pętlę zaszczepiającą do probówki/kolby i delikatnie dociśnij do boku pojemnika, aby ostygł tuż przed włożeniem do kultury bulionowej.
4. Usuń jedną pętlę kultury bulionowej i natychmiast załóż nakrętkę.
5. Zdjąć nakrętkę z probówki (lub kolby) zawierającej sterylną płynną pożywkę wzrostową i dwukrotnie przepuścić otwór pojemnika przez najgorętszą część płomienia. Aby zapobiec zanieczyszczeniu, nie kładź nasadki na blacie.
6. Ostrożnie opuść wyekstrahowaną pętlę do sterylnego płynnego podłoża bulionowego i delikatnie porusz pętlę, aby uwolnić bakterie. Natychmiast załóż nasadkę.
7. Wysterylizuj płomieniowo pętlę zaszczepiającą (Rysunek 6), aby zapobiec zanieczyszczeniu powierzchni stołu i jako wzgląd na inne osoby w laboratorium, które mogą później korzystać z pętli zaszczepiających.
   
   Rysunek 6: Pętla zaszczepiająca rozgrzewająca się do czerwoności podczas sterylizacji palnikiem Bunsena.
8. Umieścić kolbę w inkubatorze w celu wzrostu na noc.
9. Następnego dnia wyjąć kolbę z inkubacji. Wykonaj serię rozcieńczeń, aby wyliczyć kulturę.
10. Rozcieńczenia z serii należy rozłożyć na płytkach na pożywkach do hodowli agarozy i inkubować płytki przez noc.
11. Wyjmij płytki następnego dnia i obserwuj, czy nie ma zanieczyszczeń.