1. Przygotowanie do prac aseptycznych
- Zaopatrz się w następujące środki ochrony indywidualnej i załóż je: fartuch laboratoryjny, rękawice lateksowe lub nitrylowe (wolne od rozdarć lub dziur) oraz okulary ochronne (Rysunek 1). Dla bezpieczeństwa w przypadku użycia otwartego ognia zwiąż długie włosy.
Rysunek 1: Środki ochrony indywidualnej: fartuch laboratoryjny, rękawice lateksowe i okulary ochronne. - Drugim ważnym aspektem techniki aseptycznej jest właściwa sterylizacja i przechowywanie pożywek/odczynników, które mają być używane w laboratorium. Przygotuj płynną pożywkę bulionową (e.g., tryptyczny bulion sojowy) i pożywkę na bazie agaru (e.g., R2A), ważąc odpowiednią ilość suszonego proszku bazowego, który dodaje się do odpowiedniej ilości wody dejonizowanej.
- W przypadku pożywki bulionowej rozpuść proszek na gorącej płycie z małym ogniem i dozuj płyn w objętościach 100 ml do szklanych kolb zakręcanych lub w objętościach 10 ml do szklanych zakręcanych probówek. Za pomocą mieszadła magnetycznego mieszaj pożywkę agarozową na mieszadle z płytą grzejną, aż proszek całkowicie się rozpuści.
- Do pojemników należy przyłożyć taśmę autoklawową i autoklawować media zgodnie z instrukcjami producenta (e.g., 20 min w temperaturze 121 °C) (Rysunki 2 i 3). Należy pamiętać, że kolor pasków na taśmie autoklawu powinien zmienić się z białego (pre-autoklaw) na czarny (post-autoklaw). Chociaż zmiana koloru ogólnie wskazuje, że sterylizacja się powiodła, można przeprowadzić kontrole sterylności przy użyciu zestawów pasków z zarodnikami w celu zweryfikowania procesu autoklawowania.
Rysunek 2: Taśma autoklawowa nakładana na materiał.
Rysunek 3: Zwróć uwagę na zmianę koloru pasków na taśmie autoklawu z białego (przed autoklawem) na czarny (po autoklawie). - Schłodzić płynny bulion do temperatury pokojowej, a następnie przechowywać w temperaturze pokojowej lub w lodówce w temperaturze 4 °C.
- Schłodzić pożywkę agarozową, umieszczając pojemnik w łaźni wodnej nastawionej na ~50 °C. Po schłodzeniu pożywkę można przelać do sterylnych szalek Petriego. Pozostawić pożywkę do ostygnięcia i zestalenia, a następnie skonsolidować w celu przechowywania w temperaturach określonych przez producenta.
- Istnieje kilka odmian pożywek hodowlanych, których nie można sterylizować w autoklawie, ponieważ wysokie temperatury degradują krytyczne składniki. Sterylizacja wymaga sterylizacji filtra za pomocą systemu filtracji próżniowej wykorzystującego filtr 0,22 μm, a następnie przechowywania w odpowiedniej temperaturze.
- Przed przystąpieniem do pracy na blacie należy zdezynfekować powierzchnię za pomocą odpowiedniego roztworu (e.g., wybielacz 500 ppm). Zmniejsza to ryzyko przeniesienia zanieczyszczeń z powierzchni roboczej do kultur i sterylnych pożywek.
- Aby ustanowić sterylne pole, włącz palnik Bunsena. Rodzaj płomienia najlepiej nadający się do sterylizacji metalowych pętli zaszczepiających to intensywnie niebieski płomień, z wyraźnym niebieskim stożkiem obserwowanym pośrodku (Rysunek 4).
Rysunek 4: Przeniesienie bakterii z jednej płytki Petriego wykazującej wzrost hodowanego izolatu na inną niezaszczepioną płytkę Petriego zawierającą pożywkę wzrostową na bazie agaru. - Powoli przełóż pętlę zaszczepiającą przez najgorętszą część płomienia (końcówka niebieskiego stożka). Pętla powinna rozgrzać się do czerwoności w celu sterylizacji.
2. Transfery bakteryjne: z płytki Petriego na płytkę Petriego
- Jednym ze scenariuszy przenoszenia bakterii jest przeniesienie z jednej płytki Petriego wykazującej wzrost hodowanego izolatu na inną, sterylną płytkę Petriego zawierającą pożywkę wzrostową na bazie agaru.
- Na początek lekko otwórz płytkę Petriego zawierającą czystą kulturę bakteryjną i delikatnie postukaj gorącą, wysterylizowaną pętlę zaszczepiającą w powierzchnię agaru.
- Pobrać jedną izolowaną kolonię z powierzchni płytki za pomocą schłodzonej pętli zaszczepiającej i zamknąć płytkę Petriego.
- Wykonać serię izolacji przy użyciu świeżej płytki Petriego zawierającej pożywkę hodowlaną, z lekko uchyloną pokrywką.
- Dla każdej części smugi izolacyjnej (w sumie 3 na płytkę) wysterylizuj płomieniowo pętlę zaszczepiającą tuż przed użyciem. Ponadto, wysterylizuj płomieniowo pętlę zaraz po wykonaniu ostatniej smugi, aby zapobiec zanieczyszczeniu powierzchni stołu i jako wzgląd na inne osoby w laboratorium, które mogą później użyć lub wejść w kontakt z pętlami zaszczepiającymi.
- Umieść płytki z prążkami w inkubatorze do wzrostu przez noc.
3. Transfery bakteryjne: od kultury bulionu do płytki Petriego
- Drugi scenariusz przenoszenia bakterii polega na przeniesieniu bakterii z kultury bulionowej wykazującej wzrost, co zwykle obserwuje się przez zmętnienie, na sterylną płytkę Petriego zawierającą pożywkę wzrostową.
- Zdejmij nakrętkę z probówki (lub kolby) zawierającej czystą kulturę bakteryjną i przepuść otwór pojemnika 2-3 razy przez najgorętszą część płomienia. Aby zapobiec zanieczyszczeniu, nie kładź nasadki na blacie.
- Ostrożnie opuść wysterylizowaną pętlę zaszczepiającą do probówki/kolby i delikatnie dociśnij do boku pojemnika, aby ostygł tuż przed włożeniem do kultury bulionowej.
- Usuń jedną pętlę kultury bulionowej (Rysunek 5) i natychmiast załóż nakrętkę.
Rysunek 5: Jedna pętla kultury bulionowej. - Wykonaj serię do izolacji, używając świeżej płytki Petriego zawierającej pożywkę hodowlaną, z lekko uchyloną pokrywką.
- Dla każdej porcji smugi (łącznie 3 na płytkę) wysterylizuj płomieniowo pętlę zaszczepiającą tuż przed użyciem. Również wysterylizuj pętlę płomieniowo zaraz po wykonaniu ostatniej smugi, aby zapobiec zanieczyszczeniu powierzchni stołu i jako wzgląd na inne osoby w laboratorium, które mogą później użyć pętli zaszczepiających.
- Umieść płytki z prążkami do izolacji w inkubatorze w celu wzrostu przez noc.
4. Przenoszenie bakterii: od płytki Petriego ze wzrostem do sterylnego płynnego podłoża
- Trzeci scenariusz przenoszenia bakterii polega na przeniesieniu z płytki Petriego zawierającej izolowaną smugę kultury do probówki/kolby zawierającej sterylną płynną pożywkę wzrostową.
- Lekko otworzyć szalkę Petriego zawierającą czystą kulturę bakteryjną i schłodzić gorącą pętlę zaszczepiającą, delikatnie stukając nią w powierzchnię agaru.
- Pobrać jedną izolowaną kolonię z powierzchni płytki za pomocą schłodzonej pętli zaszczepiającej i zamknąć płytkę Petriego.
- Zdjąć nakrętkę z probówki (lub kolby) zawierającej sterylną płynną pożywkę wzrostową i przepuścić otwór pojemnika 2 do 3 razy przez najgorętszą część płomienia. Aby zapobiec zanieczyszczeniu, nie kładź nakrętki na blacie.
- Ostrożnie opuść wyekstrahowaną kolonię do płynnego podłoża bulionowego i delikatnie porusz pętlę, aby uwolnić bakterie. Natychmiast załóż nasadkę.
- Sterylizuj płomieniowo pętlę zaszczepiającą, aby zapobiec zanieczyszczeniu powierzchni stołu i jako wzgląd na inne osoby w laboratorium, które mogą później korzystać z pętli zaszczepiających.
- Umieścić kolbę w inkubatorze w celu wzrostu na noc.
- Następnego dnia wyjąć kolbę z inkubacji. Wykonaj serię rozcieńczeń, aby wyliczyć kulturę.
- Rozcieńczenia z serii należy rozłożyć na płytkach na pożywkach do hodowli agarozy i inkubować płytki przez noc.
- Wyjmij płytki następnego dnia i obserwuj, czy nie ma zanieczyszczeń.
5. Przenoszenie bakterii: od kultury bulionu do sterylnego płynnego podłoża wzrostowego
- Czwartym scenariuszem przenoszenia bakterii jest przeniesienie kultury bulionu wykazującej wzrost do probówki/kolby zawierającej sterylną płynną pożywkę wzrostową.
- Zdjąć nakrętkę z probówki (lub kolby) zawierającej czystą kulturę bakteryjną i dwukrotnie przepuścić otwór pojemnika przez najgorętszą część płomienia. Aby zapobiec zanieczyszczeniu, nie kładź nasadki na blacie.
- Ostrożnie opuść pętlę zaszczepiającą do probówki/kolby i delikatnie dociśnij do boku pojemnika, aby ostygł tuż przed włożeniem do kultury bulionowej.
- Usuń jedną pętlę kultury bulionowej i natychmiast załóż nakrętkę.
- Zdjąć nakrętkę z probówki (lub kolby) zawierającej sterylną płynną pożywkę wzrostową i dwukrotnie przepuścić otwór pojemnika przez najgorętszą część płomienia. Aby zapobiec zanieczyszczeniu, nie kładź nasadki na blacie.
- Ostrożnie opuść wyekstrahowaną pętlę do sterylnego płynnego podłoża bulionowego i delikatnie porusz pętlę, aby uwolnić bakterie. Natychmiast załóż nasadkę.
- Wysterylizuj płomieniowo pętlę zaszczepiającą (Rysunek 6), aby zapobiec zanieczyszczeniu powierzchni stołu i jako wzgląd na inne osoby w laboratorium, które mogą później korzystać z pętli zaszczepiających.
Rysunek 6: Pętla zaszczepiająca rozgrzewająca się do czerwoności podczas sterylizacji palnikiem Bunsena. - Umieścić kolbę w inkubatorze w celu wzrostu na noc.
- Następnego dnia wyjąć kolbę z inkubacji. Wykonaj serię rozcieńczeń, aby wyliczyć kulturę.
- Rozcieńczenia z serii należy rozłożyć na płytkach na pożywkach do hodowli agarozy i inkubować płytki przez noc.
- Wyjmij płytki następnego dnia i obserwuj, czy nie ma zanieczyszczeń.
Źródło: Laboratoria dr Iana Peppera i dr Charlesa Gerby - Uniwersytet Arizony
Autor demonstracji: Luisa Ikner
Technika aseptyczna jest podstawową umiejętnością szeroko praktykowaną w dziedzinie mikrobiologii środowiskowej, która wymaga równowagi między uważnością a praktyką w laboratorium. Właściwe zastosowanie tej techniki zmniejsza prawdopodobieństwo zanieczyszczenia bakteryjnego lub grzybiczego odczynników, pożywek hodowlanych i próbek środowiskowych. Technika aseptyczna jest również niezbędna do zapewnienia integralności danych i utrzymania czystości bibliotek kultur, które mogą składać się z bardzo rzadkich i trudnych do hodowli izolatów. Źródła zanieczyszczenia w środowisku laboratoryjnym obejmują mikroorganizmy unoszące się w powietrzu (w tym przylegające do kurzu i cząstek kłaczków), drobnoustroje obecne na stole laboratoryjnym lub na niesterylizowanym szkle lub sprzęcie oraz drobnoustroje przenoszone z ciała i włosów badacza. Stosowanie techniki aseptycznej jest również środkiem bezpieczeństwa, który zmniejsza możliwość przenoszenia mikroorganizmów na badaczy, co jest szczególnie ważne podczas pracy z patogenami.
1. Przygotowanie do prac aseptycznych
- Zaopatrz się w następujące środki ochrony indywidualnej i załóż je: fartuch laboratoryjny, rękawice lateksowe lub nitrylowe (wolne od rozdarć lub dziur) oraz okulary ochronne (Rysunek 1). Dla bezpieczeństwa w przypadku użycia otwartego ognia zwiąż długie włosy.
Rysunek 1: Środki ochrony indywidualnej: fartuch laboratoryjny, rękawice lateksowe i okulary ochronne. - Drugim ważnym aspektem techniki aseptycznej jest właściwa sterylizacja i przechowywanie pożywek/odczynników, które mają być używane w laboratorium. Przygotuj płynną pożywkę bulionową (e.g., tryptyczny bulion sojowy) i pożywkę na bazie agaru (e.g., R2A), ważąc odpowiednią ilość suszonego proszku bazowego, który dodaje się do odpowiedniej ilości wody dejonizowanej.
- W przypadku pożywki bulionowej rozpuść proszek na gorącej płycie z małym ogniem i dozuj płyn w objętościach 100 ml do szklanych kolb zakręcanych lub w objętościach 10 ml do szklanych zakręcanych probówek. Za pomocą mieszadła magnetycznego mieszaj pożywkę agarozową na mieszadle z płytą grzejną, aż proszek całkowicie się rozpuści.
- Do pojemników należy przyłożyć taśmę autoklawową i autoklawować media zgodnie z instrukcjami producenta (e.g., 20 min w temperaturze 121 °C) (Rysunki 2 i 3). Należy pamiętać, że kolor pasków na taśmie autoklawu powinien zmienić się z białego (pre-autoklaw) na czarny (post-autoklaw). Chociaż zmiana koloru ogólnie wskazuje, że sterylizacja się powiodła, można przeprowadzić kontrole sterylności przy użyciu zestawów pasków z zarodnikami w celu zweryfikowania procesu autoklawowania.
Rysunek 2: Taśma autoklawowa nakładana na materiał.
Rysunek 3: Zwróć uwagę na zmianę koloru pasków na taśmie autoklawu z białego (przed autoklawem) na czarny (po autoklawie). - Schłodzić płynny bulion do temperatury pokojowej, a następnie przechowywać w temperaturze pokojowej lub w lodówce w temperaturze 4 °C.
- Schłodzić pożywkę agarozową, umieszczając pojemnik w łaźni wodnej nastawionej na ~50 °C. Po schłodzeniu pożywkę można przelać do sterylnych szalek Petriego. Pozostawić pożywkę do ostygnięcia i zestalenia, a następnie skonsolidować w celu przechowywania w temperaturach określonych przez producenta.
- Istnieje kilka odmian pożywek hodowlanych, których nie można sterylizować w autoklawie, ponieważ wysokie temperatury degradują krytyczne składniki. Sterylizacja wymaga sterylizacji filtra za pomocą systemu filtracji próżniowej wykorzystującego filtr 0,22 μm, a następnie przechowywania w odpowiedniej temperaturze.
- Przed przystąpieniem do pracy na blacie należy zdezynfekować powierzchnię za pomocą odpowiedniego roztworu (e.g., wybielacz 500 ppm). Zmniejsza to ryzyko przeniesienia zanieczyszczeń z powierzchni roboczej do kultur i sterylnych pożywek.
- Aby ustanowić sterylne pole, włącz palnik Bunsena. Rodzaj płomienia najlepiej nadający się do sterylizacji metalowych pętli zaszczepiających to intensywnie niebieski płomień, z wyraźnym niebieskim stożkiem obserwowanym pośrodku (Rysunek 4).
Rysunek 4: Przeniesienie bakterii z jednej płytki Petriego wykazującej wzrost hodowanego izolatu na inną niezaszczepioną płytkę Petriego zawierającą pożywkę wzrostową na bazie agaru. - Powoli przełóż pętlę zaszczepiającą przez najgorętszą część płomienia (końcówka niebieskiego stożka). Pętla powinna rozgrzać się do czerwoności w celu sterylizacji.
2. Transfery bakteryjne: z płytki Petriego na płytkę Petriego
- Jednym ze scenariuszy przenoszenia bakterii jest przeniesienie z jednej płytki Petriego wykazującej wzrost hodowanego izolatu na inną, sterylną płytkę Petriego zawierającą pożywkę wzrostową na bazie agaru.
- Na początek lekko otwórz płytkę Petriego zawierającą czystą kulturę bakteryjną i delikatnie postukaj gorącą, wysterylizowaną pętlę zaszczepiającą w powierzchnię agaru.
- Pobrać jedną izolowaną kolonię z powierzchni płytki za pomocą schłodzonej pętli zaszczepiającej i zamknąć płytkę Petriego.
- Wykonać serię izolacji przy użyciu świeżej płytki Petriego zawierającej pożywkę hodowlaną, z lekko uchyloną pokrywką.
- Dla każdej części smugi izolacyjnej (w sumie 3 na płytkę) wysterylizuj płomieniowo pętlę zaszczepiającą tuż przed użyciem. Ponadto, wysterylizuj płomieniowo pętlę zaraz po wykonaniu ostatniej smugi, aby zapobiec zanieczyszczeniu powierzchni stołu i jako wzgląd na inne osoby w laboratorium, które mogą później użyć lub wejść w kontakt z pętlami zaszczepiającymi.
- Umieść płytki z prążkami w inkubatorze do wzrostu przez noc.
3. Transfery bakteryjne: od kultury bulionu do płytki Petriego
- Drugi scenariusz przenoszenia bakterii polega na przeniesieniu bakterii z kultury bulionowej wykazującej wzrost, co zwykle obserwuje się przez zmętnienie, na sterylną płytkę Petriego zawierającą pożywkę wzrostową.
- Zdejmij nakrętkę z probówki (lub kolby) zawierającej czystą kulturę bakteryjną i przepuść otwór pojemnika 2-3 razy przez najgorętszą część płomienia. Aby zapobiec zanieczyszczeniu, nie kładź nasadki na blacie.
- Ostrożnie opuść wysterylizowaną pętlę zaszczepiającą do probówki/kolby i delikatnie dociśnij do boku pojemnika, aby ostygł tuż przed włożeniem do kultury bulionowej.
- Usuń jedną pętlę kultury bulionowej (Rysunek 5) i natychmiast załóż nakrętkę.
Rysunek 5: Jedna pętla kultury bulionowej. - Wykonaj serię do izolacji, używając świeżej płytki Petriego zawierającej pożywkę hodowlaną, z lekko uchyloną pokrywką.
- Dla każdej porcji smugi (łącznie 3 na płytkę) wysterylizuj płomieniowo pętlę zaszczepiającą tuż przed użyciem. Również wysterylizuj pętlę płomieniowo zaraz po wykonaniu ostatniej smugi, aby zapobiec zanieczyszczeniu powierzchni stołu i jako wzgląd na inne osoby w laboratorium, które mogą później użyć pętli zaszczepiających.
- Umieść płytki z prążkami do izolacji w inkubatorze w celu wzrostu przez noc.
4. Przenoszenie bakterii: od płytki Petriego ze wzrostem do sterylnego płynnego podłoża
- Trzeci scenariusz przenoszenia bakterii polega na przeniesieniu z płytki Petriego zawierającej izolowaną smugę kultury do probówki/kolby zawierającej sterylną płynną pożywkę wzrostową.
- Lekko otworzyć szalkę Petriego zawierającą czystą kulturę bakteryjną i schłodzić gorącą pętlę zaszczepiającą, delikatnie stukając nią w powierzchnię agaru.
- Pobrać jedną izolowaną kolonię z powierzchni płytki za pomocą schłodzonej pętli zaszczepiającej i zamknąć płytkę Petriego.
- Zdjąć nakrętkę z probówki (lub kolby) zawierającej sterylną płynną pożywkę wzrostową i przepuścić otwór pojemnika 2 do 3 razy przez najgorętszą część płomienia. Aby zapobiec zanieczyszczeniu, nie kładź nakrętki na blacie.
- Ostrożnie opuść wyekstrahowaną kolonię do płynnego podłoża bulionowego i delikatnie porusz pętlę, aby uwolnić bakterie. Natychmiast załóż nasadkę.
- Sterylizuj płomieniowo pętlę zaszczepiającą, aby zapobiec zanieczyszczeniu powierzchni stołu i jako wzgląd na inne osoby w laboratorium, które mogą później korzystać z pętli zaszczepiających.
- Umieścić kolbę w inkubatorze w celu wzrostu na noc.
- Następnego dnia wyjąć kolbę z inkubacji. Wykonaj serię rozcieńczeń, aby wyliczyć kulturę.
- Rozcieńczenia z serii należy rozłożyć na płytkach na pożywkach do hodowli agarozy i inkubować płytki przez noc.
- Wyjmij płytki następnego dnia i obserwuj, czy nie ma zanieczyszczeń.
5. Przenoszenie bakterii: od kultury bulionu do sterylnego płynnego podłoża wzrostowego
- Czwartym scenariuszem przenoszenia bakterii jest przeniesienie kultury bulionu wykazującej wzrost do probówki/kolby zawierającej sterylną płynną pożywkę wzrostową.
- Zdjąć nakrętkę z probówki (lub kolby) zawierającej czystą kulturę bakteryjną i dwukrotnie przepuścić otwór pojemnika przez najgorętszą część płomienia. Aby zapobiec zanieczyszczeniu, nie kładź nasadki na blacie.
- Ostrożnie opuść pętlę zaszczepiającą do probówki/kolby i delikatnie dociśnij do boku pojemnika, aby ostygł tuż przed włożeniem do kultury bulionowej.
- Usuń jedną pętlę kultury bulionowej i natychmiast załóż nakrętkę.
- Zdjąć nakrętkę z probówki (lub kolby) zawierającej sterylną płynną pożywkę wzrostową i dwukrotnie przepuścić otwór pojemnika przez najgorętszą część płomienia. Aby zapobiec zanieczyszczeniu, nie kładź nasadki na blacie.
- Ostrożnie opuść wyekstrahowaną pętlę do sterylnego płynnego podłoża bulionowego i delikatnie porusz pętlę, aby uwolnić bakterie. Natychmiast załóż nasadkę.
- Wysterylizuj płomieniowo pętlę zaszczepiającą (Rysunek 6), aby zapobiec zanieczyszczeniu powierzchni stołu i jako wzgląd na inne osoby w laboratorium, które mogą później korzystać z pętli zaszczepiających.
Rysunek 6: Pętla zaszczepiająca rozgrzewająca się do czerwoności podczas sterylizacji palnikiem Bunsena. - Umieścić kolbę w inkubatorze w celu wzrostu na noc.
- Następnego dnia wyjąć kolbę z inkubacji. Wykonaj serię rozcieńczeń, aby wyliczyć kulturę.
- Rozcieńczenia z serii należy rozłożyć na płytkach na pożywkach do hodowli agarozy i inkubować płytki przez noc.
- Wyjmij płytki następnego dnia i obserwuj, czy nie ma zanieczyszczeń.
Technika aseptyczna jest podstawową umiejętnością w mikrobiologii i ma kluczowe zastosowanie w badaniach środowiskowych.
Jeśli kultury mikrobiologiczne są skażone, czas, praca i koszty finansowe, które byłyby wymagane od laboratorium do "oczyszczenia" lub wymiany kultur, szczególnie rzadkich izolatów z unikalnych środowisk, mogą być bardzo wysokie i zaporowe, a niektóre próbki mogą być niezastąpione.
Właściwe stosowanie technik aseptycznych zmniejsza prawdopodobieństwo zanieczyszczenia bakteryjnego i grzybiczego odczynników, pożywek hodowlanych i próbek środowiskowych, a także pozwala uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego między próbkami. Jest to również środek bezpieczeństwa, który zmniejsza potencjalną transmisję drobnoustrojów na eksperymentatora, co jest szczególnie ważne podczas pracy z patogenami.
W tym filmie przedstawimy zasady aseptyki; kilka ważnych technik utrzymywania sterylnych odczynników i kultur; I wreszcie niektóre z ich zastosowań w naukach o środowisku.
Celem stosowania technik aseptycznych jest stworzenie i utrzymanie sterylnego środowiska pracy, sprzętu i odczynników, tak aby zminimalizować zanieczyszczenie próbek biologicznych. Częstymi źródłami zanieczyszczenia są mikroorganizmy unoszące się w powietrzu, drobnoustroje obecne na stole laboratoryjnym lub sprzęcie laboratoryjnym oraz te pochodzące z włosów, ciała i ubrania badacza.
Dwa rodzaje środków mają kluczowe znaczenie dla usuwania lub zapobiegania zanieczyszczeniom w laboratorium: środki dezynfekujące, chemikalia i ciepło. Roztwory takie jak 70% etanol i rozcieńczony wybielacz są często używane do dezynfekcji sprzętu, powierzchni roboczych i rękawic eksperymentatorów przed przystąpieniem do prac aseptycznych.
W tym samym czasie drobnoustroje znajdujące się na narzędziach, wyrobach szklanych i płynnych mediach mogą zostać zabite termicznie w autoklawie, która jest komorą, która sterylizuje zawartość poprzez wystawienie na działanie pary pod ciśnieniem o wysokiej temperaturze. Ponadto narzędzia, takie jak szklane pręty używane do rozprowadzania galwanizacji i metalowe pętle inokulacyjne, mogą być sterylizowane termicznie za pomocą źródła płomienia, takiego jak palnik Bunsena.
Zastosowanie źródła płomienia jest również jednym z najczęstszych sposobów na stworzenie aseptycznego środowiska pracy. Ciepło z płomienia powoduje konwekcję powietrza, generując prąd wstępujący, który unosi wszelkie zanieczyszczenia unoszące się w powietrzu z dala od otoczenia palnika i tworząc "sterylne pole", w którym można przeprowadzić aseptyczne prace eksperymentalne.
Teraz, gdy już rozumiesz zasady stojące za technikami aseptycznymi i dlaczego są one ważne, przejdźmy do protokołu tworzenia aseptycznego środowiska pracy, tworzenia sterylnych pożywek wzrostowych i aseptycznego przenoszenia bakterii między różnymi warunkami hodowli.
Przed rozpoczęciem pracy aseptycznej ważne jest, aby eksperymentator założył odpowiednie środki ochrony osobistej lub środki ochrony osobistej. Ma to na celu zarówno zapobieżenie zanieczyszczeniu próbek i kultur laboratoryjnych przez eksperymentatora, jak i zapobieżenie przeniesieniu potencjalnie chorobotwórczych drobnoustrojów na badacza. Środki ochrony osobistej obejmują fartuch laboratoryjny, rękawice i okulary ochronne.
Następnym krokiem jest odpowiednia sterylizacja i przechowywanie pożywki wzrostowej, która ma być użyta do hodowli próbek drobnoustrojów. Najpierw odważ odpowiednią ilość składników pożywki stałej i dodaj je do odpowiedniej objętości ciekłego rozpuszczalnika określonego przez producenta, takiego jak woda dejonizowana, w pojemniku autoklawowalnym Dodaj mieszadło magnetyczne, umieść pojemnik na mieszadle z gorącą płytą i rozpuść składniki podłoża stałego na małym ogniu i mieszając.
Zamknij pojemniki z podłożem. Jeśli używasz szklanego naczynia z zakręcaną nakrętką, pamiętaj, aby nie dokręcać nakrętki całkowicie, ponieważ powietrze wewnątrz naczyń rozszerzy się z powodu ogrzewania podczas autoklawowania i będzie musiało uciec. Bez ucieczki gaz może spowodować pęknięcie naczynia. Połóż kawałek taśmy autoklawu na naczyniach i autoklaw media zgodnie z instrukcjami producenta, np. 20 min w temperaturze 121 °C. Po sterylizacji w autoklawie sprawdź, czy paski na taśmach autoklawu zmieniły kolor na czarny, wskazując na osiągnięcie odpowiedniej temperatury.
W przypadku płynnych pożywek wzrostowych pozwól im ostygnąć do temperatury pokojowej i przechowuj je w temperaturze pokojowej lub w lodówce, jeśli to konieczne. W przypadku stałych pożywek wzrostowych na bazie agaru pozwól im ostygnąć do około 50 ? C, a następnie wlać do sterylnych szalek Petriego. Pozwól agarowi ostygnąć i zestalić się przed przechowywaniem w odpowiedniej temperaturze.
W przypadku mediów, których nie można sterylizować w autoklawie ze względu na obecność składników wrażliwych na ciepło, filtr należy sterylizować za pomocą filtra 0,22 μm.
Podstawową techniką w pracach mikrobiologicznych jest aseptyczne przenoszenie kultur bakteryjnych między różnymi pożywkami wzrostowymi, zarówno stałymi, jak i ciekłymi. Przed rozpoczęciem wyczyść powierzchnię stołu laboratoryjnego środkiem dezynfekującym. Zmniejsza to ryzyko skażenia kultur lub sterylnych pożywek.
Przenoszenie kultur bakteryjnych zwykle odbywa się przy użyciu narzędzia zwanego pętlą zaszczepiającą, którą przed użyciem należy wysterylizować poprzez podgrzanie w płomieniu.
Włącz źródło płomienia. Powoli przełóż pętlę zaszczepiającą przez końcówkę płomienia. Pętla zmieni kolor na czerwony. Aby przenieść kolonię bakterii z litej płytki agarowej, lekko otwórz płytkę Petriego i delikatnie postukaj gorącą pętlą zaszczepiającą w pustą część powierzchni agaru, aby uniknąć zabijania bakterii termicznie. Zeskrob pojedynczą kolonię za pomocą pętli zaszczepiającej i zamknij płytkę.
Aby przenieść bakterie z płynnej pożywki wzrostowej, zdejmij nakrętkę z pojemnika hodowlanego. Aby zapobiec zanieczyszczeniu, unikaj odkładania nasadki na ławkę. Przełóż otwór pojemnika 2-3 razy przez najgorętszą część płomienia. Następnie ostrożnie przyłóż gorącą, wysterylizowaną pętlę inokulacyjną do wnętrza pojemnika i pozwól jej ostygnąć przed włożeniem jej do kultury bulionowej. Usuń jedną pętlę kultury i natychmiast zamknij nakrętkę.
W celu przeniesienia otrzymanych bakterii na sterylne podłoże wzrostowe należy zdjąć nakrętkę z pojemnika ze sterylnym bulionem i przepuścić otwór pojemnika przez płomień 2-3 razy. Następnie ostrożnie opuść pętlę inokulacyjną do pożywki i delikatnie zamieszaj, aby uwolnić bakterie. Natychmiast zamknij korek. Po użyciu wysterylizuj pętlę inokulacyjną.
W przypadku przenoszenia bakterii na sterylną płytkę agarową, należy otworzyć pokrywkę świeżej płytki Petriego z niezaszczepionym agarem. Przełóż pętlę inokulacyjną z kulturą bakteryjną tam iz powrotem przez jeden sektor agaru. Wysterylizuj pętlę i ostudź ją, dotykając pustej części agaru, a następnie wykonaj kolejną smugę na agarze pod kątem rozwartym do pierwszej smugi, upewniając się, że przecinasz pierwszą smugę przy pierwszych 1-2 pociągnięciach, ale unikaj dotykania pierwszej smugi przy kolejnych pociągnięciach. Powtórz sterylizację i smugi jeszcze 2 razy. Zamknij płytkę Petriego i wysterylizuj pętlę inokulacyjną.
Po zaszczepieniu bulion lub płytkę agarową należy inkubować w idealnej temperaturze wzrostu dla danego mikroorganizmu, aby uzyskać żywotną kulturę. Na podłożu stałym trawnik lub ciągłe pasmo bakterii byłoby widoczne na agarze pokrytym pierwszymi dwoma smugami, ale pojedyncze kolonie należy uzyskać na ostatnim pasku. Złe techniki aseptyczne skutkowałyby rozwojem pleśni i innych zanieczyszczeń na płycie.
Techniki aseptyczne są ważne w wielu eksperymentach z udziałem próbek drobnoustrojów pochodzących ze środowiska. W tym badaniu naukowcy wyizolowali bakteriofagi, które są wirusami infekującymi bakterie, od pospolitej bakterii glebowej Arthrobacter. Kultury Arthrobacter były początkowo uprawiane w warunkach aseptycznych. Próbki gleby zostały następnie umyte i przefiltrowane w buforze fagowym, a roztwór fagowy zmieszano z kulturą bakteryjną i posiewano na płytkach agarowych. Na talerzu tworzyłby się bakteryjny trawnik, ale w miejscach, w których wirus zainfekował i zabił bakterie, pojawiałyby się prześwity lub "blaszki". Fagi można następnie oczyścić z tych blaszek w celu dalszych badań.
Oprócz stosowania palników Bunsena, aseptyczne środowisko pracy może być również utrzymywane w specjalistycznych stacjach roboczych znanych jako okapy z przepływem laminarnym, które wykorzystują ukierunkowany przepływ powietrza i filtry w celu utrzymania sterylności. Naukowcy pracowali w okapie przepływowym, aby wyizolować potencjalne chorobotwórcze bakterie i wirusy z próbek wody. Izolaty te były następnie hodowane razem z amebami. Ponieważ ameby zwykle żywią się bakteriami "fagocytozą", wszelkie bakterie, które były w stanie oprzeć się trawieniu ameb i pozostać w tych organizmach, mogą również potencjalnie pozostać żywotne w komórkach ludzkich i powodować choroby.
Wreszcie, sterylne warunki pozwalają na szczegółowe badanie mechanizmów ekologicznych, takich jak tworzenie się guzków korzeniowych w roślinach strączkowych - narządów wypełnionych bakteriami, które "wiążą" azot atmosferyczny w amoniaku, który jest wykorzystywany przez roślinę do wzrostu. Naukowcy stworzyli tutaj "mikrokosmosy" do badania procesu nodulacji za pomocą karbowanych płytek Petriego z pożywką do wzrostu roślin, umieścili w nich sadzonki i zaszczepili sadzonki bakteriami ryzobialnymi tworzącymi guzki. Aseptyczne środowisko okapu przepływowego zapobiega zanieczyszczeniu kultur innymi bakteriami lub grzybami.
Właśnie obejrzałeś film JoVE na temat technik aseptycznych w naukach o środowisku. Powinieneś teraz zrozumieć, dlaczego aseptyczne warunki pracy są ważne; jak aseptycznie przeprowadzać eksperymenty mikrobiologiczne; oraz niektóre zastosowania technik aseptycznych w badaniach środowiskowych. Jak zawsze, dziękujemy za oglądanie!
Wynik procedury wskazuje na prawidłową technikę aseptyczną i słabą technikę aseptyczną. Rysunek 7 ilustruje zanieczyszczenie, które może powstać w wyniku złej techniki aseptyki podczas nalewania płytek agarozowych (górna płytka: sterylne podłoże; dolne płytki: zanieczyszczone podłoże).
Rysunek 7: Zanieczyszczenie, które może powstać w wyniku złej techniki aseptyk...
Oprócz stosowania palników Bunsena, aseptyczne środowisko pracy może być również utrzymywane w specjalistycznych stacjach roboczych znanych jako okapy z przepływem laminarnym, które wykorzystują ukierunkowany przepływ powietrza i filtry w celu utrzymania sterylności.
Właściwe stosowanie techniki aeptycznej ma zasadnicze znaczenie dla mikrobiologów środowiskowych podczas pobierania próbek w terenie oraz w laboratorium podczas pracy z pożywkami, odczynnikami i izolatami hodowlanymi. Zła technika...
Chapters in this video
0:00
Overview
1:10
Principles of Aseptic Technique
3:02
Preparation for Aseptic Work
5:10
Aseptic Transfer of Bacteria Between Liquid Media and Petri Plates
8:13
Applications
10:20
Summary
Videos from this collection:
Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. All rights reserved