Trawienia enzymami restrykcyjnymi

Enzymy restrykcyjne, czyli endonukleazy restrykcyjne, są wykorzystywane w wielu różnych zastosowaniach w biologii molekularnej. Enzymy te rozpoznają i przecinają specyficzną sekwencję DNA, nazywaną miejscem restrykcyjnym. Film, który teraz obejrzysz, dostarcza podstawowych informacji na temat tych niezwykłych cząsteczek oraz pokazuje, jak przygotować reakcję trawienia enzymami restrykcyjnymi.

Skąd właściwie biorą się enzymy restrykcyjne? Enzymy te są adaptacją bakterii, która pełni funkcję mechanizmu obronnego przeciwko wirusom znanym jako bakteriofagi. Dzięki przyłączaniu grup metylowych do miejsc rozpoznawanych przez enzymy restrykcyjne w bakteryjnym DNA, enzymy te rozpoznają i przecinają jedynie DNA faga, zapobiegając tym samym infekcji.

Enzymy restrykcyjne mają dość specyficzne nazwy. Przykładami są HindIII, NotI, EcoRI i BamHI. Trzy pierwsze litery w nazwie enzymu restrykcyjnego odnoszą się do organizmu, z którego został wyizolowany. Na przykład enzym restrykcyjny EcoRI wyizolowano z E. coli. Czwarta litera, jeśli jest konieczna, odnosi się do szczepu bakterii, z którego wyizolowano enzym. Rzymska cyfra wskazuje, czy jest to pierwszy, drugi lub trzeci enzym wyizolowany z danego organizmu.

Enzymy restrykcyjne rozpoznają sekwencję nukleotydów, zazwyczaj o długości od czterech do ośmiu par zasad, zwaną miejscem rozpoznania. W konkretnych punktach sekwencji enzym rozrywa wiązania fosfodiesterowe w szkielecie DNA. Miejsca rozpoznania są zazwyczaj palindromiczne, co oznacza, że sekwencja czytana jest tak samo w obu kierunkach. Gdy palindrom występuje na komplementarnych niciach cząsteczki DNA, nazywa się go palindromem z odwróconą powtórką.

Enzymy restrykcyjne po przecięciu DNA mogą pozostawić różne rodzaje końców: lepkie i tępe. Końce lepkie tworzą nawisy 3’ i 5’, natomiast końce tępe nie pozostawiają nawisów. Rodzaj końca determinuje, w jaki sposób fragment DNA wyizolowany w wyniku trawienia enzymem restrykcyjnym zostanie połączony z innymi fragmentami DNA w procesie zwanym ligacją.

Trawienie enzymami restrykcyjnymi powinno być starannie zaplanowane. Reakcja trawienia zazwyczaj składa się z następujących elementów: wody dejonizowanej, DNA podlegającego cięciu, buforu specyficznego dla użytego enzymu, a czasami białka zwanego albuminą surowicy bydlęcej lub BSA. BSA stabilizuje reakcję, zapobiegając przywieraniu enzymu do ścianek naczynia, w którym odbywa się trawienie. Każdy enzym restrykcyjny może wymagać innych warunków buforowych, temperatur inkubacji oraz różnej ilości BSA. Dostawcy enzymów restrykcyjnych udostępniają materiały, w których można znaleźć wszystkie niezbędne informacje.

Aby rozpocząć przygotowanie trawienia, wyjmij enzym restrykcyjny z zamrażarki lub lodówki. Przechowuj enzym restrykcyjny w lodu lub w pojemniku odpornym termicznie, aby zapewnić optymalną aktywność w przyszłych reakcjach. Do probówki do mikrocentryfugi należy dodać składniki reakcji w następującej kolejności. Najpierw objętość sterylnej wody wolnej od nukleaz, tak aby końcowa objętość reakcji wynosiła 20μL. Następnie 10x bufor do enzymów restrykcyjnych, potem BSA, jeśli jest wymagane, do 1μg DNA oraz 2-10 jednostek enzymu. Jednostki definiuje się jako ilość enzymu potrzebną do całkowitego trawienia 1μg kontrolnego DNA w ciągu 60 minut w temperaturze 37°C przy objętości reakcji 50μL. Następnie zmieszaj zawartość za pomocą wortexa, a potem krótko odwiruj przy 12,000xg w mikrocentryfudze, aby zebrać zawartość na dnie probówki. Potem inkubuj w temperaturze optymalnej dla danego enzymu restrykcyjnego, zazwyczaj 37°C w bloku grzejnym przez 1 do 4 godzin.

Po zakończeniu trawienia zaleca się inkubację mieszaniny reakcyjnej w temperaturze 65˚C, aby termicznie inaktywować enzymy restrykcyjne. Choć enzymy restrykcyjne zazwyczaj tną specyficznie w obrębie danej sekwencji, zbyt długi czas inkubacji może prowadzić do tzw. aktywności gwiazdowej (star activity), czyli cięcia w miejscach podobnych, lecz odmiennych od ich typowych miejsc trawienia.

Po inaktywacji DNA należy poddać elektroforezie w żelu agarozowym, aby potwierdzić prawidłowy przebieg procesu trawienia.

Oto kilka pomocnych wskazówek dotyczących przeprowadzania trawień i zapewnienia sukcesu eksperymentu.

Czasami może wystąpić sytuacja, w której do wygenerowania konkretnego fragmentu DNA konieczne jest użycie kilku enzymów. W takim przypadku należy sprawdzić, czy warunki buforowe i temperatury inkubacji są zgodne dla obu enzymów; jeśli tak, można przeprowadzić trawienie podwójne, w którym oba enzymy tną w jednej reakcji. Czasami jednak warunki reakcji dla dwóch enzymów są niezgodne – w takim przypadku rozwiązaniem jest zastosowanie enzymów sekwencyjnie. Na przykład trawienie można najpierw przeprowadzić jednym enzymem, a następnie zmienić skład buforu tak, aby był optymalny dla drugiego enzymu. Innym sposobem na pokonanie niezgodności buforów i przeprowadzenie trawienia sekwencyjnego jest oczyszczenie DNA po pierwszym trawieniu, a następnie przeprowadzenie drugiego trawienia.

Stosowanie kontroli jest dobrym sposobem na zrozumienie przyczyn niepowodzenia trawienia. Na przykład kontrola bez enzymu pozwala sprawdzić integralność próbki DNA i ustalić, czy występuje aktywność egzonukleazy. Użycie kontrolnego DNA o znanych miejscach restrykcyjnych pozwala przetestować aktywność enzymu.

Po zapoznaniu się ze sposobem przeprowadzania trawienia, przyjrzyjmy się różnym zastosowaniom enzymów restrykcyjnych.

Enzymy restrykcyjne mogą być wykorzystywane diagnostycznie w celu identyfikacji konkretnych próbek. Poprzez wprowadzenie produktów trawienia do specjalistycznego chipa, a następnie umieszczenie tego chipa w urządzeniu zwanym bioanalizatorem, badacze mogą analizować wielkości fragmentów DNA powstałych w wyniku trawienia, aby określić autentyczność próbek ryb. Różnice w rozmieszczeniu prążków dla tego samego genu u danego gatunku, lub w tym przypadku u różnych gatunków, nazywa się polimorfizmem długości fragmentów restrykcyjnych.

Enzymy restrykcyjne mogą być również stosowane w subklonowaniu w celu wyizolowania fragmentu DNA z jednego plazmidu i wstawienia go do innego, aby pożądany fragment mógł być replikowany przy użyciu bakterii.

Wykorzystując reakcję łańcuchową polimerazy, czyli PCR, do wprowadzenia miejsc restrykcyjnych w genach w bardzo konkretnych lokalizacjach, enzymy restrykcyjne mogą służyć do wykrywania pojedynczych różnic nukleotydowych w alternatywnych formach tego samego genu, czyli allelach. Te polimorfizmy pojedynczego nukleotydu, czyli SNP, są trudne do wykrycia przy użyciu samego PCR i elektroforezy żelowej. Dzięki wprowadzeniu miejsca restrykcyjnego w obrębie SNP, proste trawienie pozwala odróżnić poszczególne allele.

Właśnie obejrzeli Państwo film JoVE na temat enzymów restrykcyjnych. Dowiedzieli się Państwo, skąd pochodzą te enzymy, poznali podstawy ich działania, zobaczyli jak przeprowadzić trawienie oraz dowiedzieli się, w jaki sposób enzymy restrykcyjne są wykorzystywane w biologii molekularnej. Jak zawsze, dziękujemy za oglądanie!