Cytogenetyka

Cytogenetyka to nauka zajmująca się badaniem struktury i właściwości chromosomów, a także ich zachowania podczas podziału komórki i ich roli w dziedziczności. Chromosom, który jest cząsteczką DNA i związanymi z nią białkami, można obserwować pod mikroskopem za pomocą barwników i sond. Takie obserwacje są skutecznym podejściem do wykrywania defektów w strukturze i liczbie chromosomów, które często są związane z chorobami i zaburzeniami.

W tym filmie omówione zostaną zasady cytogenetyki, protokół powszechnie stosowanej techniki podkreślania określonych cech chromosomów, znanej jako fluorescencyjna hybrydyzacja in situ, oraz niektóre zastosowania tej techniki.

Zacznijmy od omówienia znaczenia cytogenetyki i zasad stojących za niektórymi klasycznymi i nowoczesnymi technikami w tej dziedzinie.

Cytogenetyka polega na bezpośredniej obserwacji struktury i liczby chromosomów komórki, znanej jako "kariotyp". Może być stosowana do wykrywania odchyleń od normalnej diploidalnej lub sparowanej liczby chromosomów, co nazywa się aneuploidią, a także defektów w strukturze chromosomów.

Wiele chorób i zaburzeń wynika z nieprawidłowości chromosomalnych. Na przykład chromosom Philadelphia, który powstaje w wyniku wzajemnej translokacji między częściami chromosomów 9 i 22, jest związany z przewlekłą białaczką szpikową. Innym przykładem jest trisomia 21, najczęstsza przyczyna zespołu Downa, w której dziedziczona jest dodatkowa kopia chromosomu 21.

Kariotypowanie jest zwykle wykonywane na komórkach, które przygotowują się do podziału, gdy ich chromosomy są zagęszczone i można je łatwo odróżnić.

Chromosomy w kariotypie mogą być leczone barwieniami, które ujawniają charakterystyczne wzory prążków. Wybarwione chromosomy można następnie ułożyć według rozmiaru i kształtu w celu analizy kariotypu. Można zastosować kilka barwników w celu podkreślenia określonych cech chromosomowych. Barwienie za pomocą Giemsy lub pasm G oznacza gęsto upakowane, zwykle ubogie w geny regiony bogate w zasady A-T. Prążki R to odwrócone barwienie Giemsy, które podkreśla regiony chromosomowe bogate w zasady G-C. Prążki C podkreślają najgęstsze regiony chromosomów wokół centromeru, struktury, która łączy identyczne połówki zduplikowanego chromosomu, podczas gdy prążki T podkreślają końce chromosomów lub telomery.

Inna technika, zwana hybrydyzacją fluorescencyjną in situ lub FISH, pozwala na wykrycie określonych chromosomów, regionów DNA lub transkryptów RNA. Osiąga się to poprzez inkubację próbki z wysoce specyficznymi sondami oligonukleotydowymi, które są znakowane fluorescencyjnie. Ponieważ sondy te mogą być hybrydyzowane z nieskondensowanymi chromosomami w niedzielących się komórkach, FISH może być szerzej stosowany niż klasyczne metody kariotypowania.

Wreszcie, naukowcy opracowali również metodę zwaną porównawczą hybrydyzacją genomową w celu wykrycia brakujących lub zduplikowanych regionów chromosomowych. Genomowe DNA od osoby badanej i kontrolnej jest izolowane, fragmentowane i znakowane różnokolorowymi fluoroforami. Rozdrobnione preparaty genomowe są następnie mieszane i kompetycyjnie hybrydyzowane do normalnego rozsiewu chromosomów. Kolory na wynikowym kariotypie wskazują, czy region jest zduplikowany w próbce testowej, co generuje więcej fragmentów do wiązania rozprzestrzeniania się, czy też region jest usunięty, co skutkuje preferencyjnym wiązaniem z liczniejszymi fragmentami kontrolnymi.

Teraz, gdy rozumiesz zasady cytogenetyki, zastosujmy je w praktyce i przyjrzyjmy się bliżej, jak wykonuje się FISH.

Po pierwsze, wyizolowane tkanki lub komórki są traktowane utrwalaczem, takim jak paraformaldehyd, aby zachować morfologię i integralność chromosomów. Następnie przygotowuje się rozprzestrzenianie chromosomów, na przykład poprzez mechaniczne rozerwanie materiału. Chromosomy są następnie odwadniane w serii roztworów o rosnącym stężeniu etanolu i przepuszczane w roztworze pepsyny, aby sekwencje docelowe były bardziej dostępne dla sond. Chromosomy są następnie myte i stabilizowane za pomocą przyrostka, denaturowane formamidem, tak aby jednoniciowe DNA mogło wiązać sondy, a następnie odwadniane w drugiej serii coraz bardziej skoncentrowanych roztworów etanolu.

Znakowane fluorescencyjnie, wysoce specyficzne sondy DNA są przygotowywane i mieszane z nieznakowanymi powtarzającymi się fragmentami DNA w celu zablokowania niespecyficznego wiązania. Sonda jest następnie nakładana na rozprzestrzenianie się chromosomu, gdzie hybrydyzuje się z sekwencją docelową, a niezwiązana sonda jest usuwana za pomocą serii płukań.

Na koniec chromosomy są montowane w podłożu, które zachowuje próbkę i zawiera ogólne przeciwbarwienie DNA, takie jak DAPI, które oznacza tło genomowego DNA, i nakłada się szkiełko nakrywkowe. W tym momencie próbki można obserwować pod mikroskopem fluorescencyjnym przy użyciu odpowiednich zestawów filtrów do wizualizacji genomowego DNA i cech specyficznych dla sekwencji.

Po zobaczeniu, jak wykonuje się FISH, przyjrzyjmy się niektórym zastosowaniom tej potężnej techniki.

FISH może być wykorzystany do potwierdzenia, że kariotyp zarodka jest prawidłowy przed implantacją. W tym przypadku pojedyncza komórka, znana jako blastomer, została poddana biopsji z zarodka trzy dni po zapłodnieniu, a następnie poddana lizie i utrwalona bezpośrednio na szkiełku mikroskopowym. Rozprzestrzenianie się chromosomu zostało następnie zhybrydyzowane z sondami specjalnie dobranymi do identyfikacji potencjalnych zaburzeń chromosomowych. W tym przypadku odchylenia od oczekiwanego wzorca sygnałów hybrydyzacji wskazują na zakłócenia w liczbie chromosomów lub strukturze.

Opracowano również innowacyjne techniki znakowania wszystkich chromosomów z jednej próbki biologicznej. Jedną z takich metod jest urządzenie Octochrome, ośmiokomorowy szklany szkiełko z fabrycznie załadowanymi sondami fluorescencyjnymi. Wszystkie 22 chromosomy niedeterminujące płci, zwane autosomami, oraz dwa chromosomy płci zostały oznaczone poprzez rozmieszczenie ich w ośmiu oknach, z których każde zawierało trzy fluorofory specyficzne dla chromosomów. Pozwoliło to na jednoczesne badania przesiewowe wszystkich chromosomów z pojedynczej hybrydyzacji.

Wreszcie, zamiast rozdzielać sondy na różne okna na szkiełku, wszystkie chromosomy można oznaczyć, a następnie wykryć razem za pomocą podejścia zwanego kariotypowaniem spektralnym lub SKY. Wiele sond specyficznych dla chromosomów z różnymi znacznikami fluorescencyjnymi zostało zhybrydyzowanych z każdym chromosomem, nadając każdemu z nich unikalny kolor widmowy. Równoczesne obserwacje połączonej mieszaniny chromosomów są szczególnie przydatne do identyfikacji wad kariotypu i mogą być wykorzystane do identyfikacji aneuploidii, a także delecji i translokacji chromosomów.

Właśnie obejrzałeś film JoVE na temat cytogenetyki. W tym filmie zapoznałeś się z zasadami cytogenetyki, technikami takimi jak kariotypowanie i FISH, które są używane do podkreślenia określonych cech chromosomów, oraz zastosowaniami tych technik. Ostatnie postępy w cytogenetyce zwiększyły ich możliwości zarówno w laboratoriach badawczych, jak i patologicznych, i będą nadal znajdować szerokie zastosowanie w czołówce badań i diagnostyki chorób. Dzięki za oglądanie!