Etykietowanie metaboliczne

Znakowanie metaboliczne służy do badania maszynerii komórki. Osiąga się to za pomocą analogów chemicznych do badania zachodzących przemian i modyfikacji biochemicznych. Ten film pokaże zasady znakowania metabolicznego, typowe procedury znakowania izotopowego i fotoreaktywnego oraz niektóre zastosowania.

Znakowanie metaboliczne można przeprowadzić przy użyciu wielu strategii. Tutaj opiszemy znakowanie izotopowe, fotoreaktywne i bioortogonalne.

Znakowanie izotopowe odbywa się przy użyciu analogów strukturalnych, które są chemicznie identyczne z ich naturalnymi odpowiednikami, ale mają rzadkie izotopy wbudowane w swoją strukturę. W tym analogu L-lizyny atomy węgla i azotu są zastąpione węglem-13 i azotem-15. Komórki hodowane w obecności analogów izotopowych włączą je do swoich struktur biochemicznych. Metabolity są pobierane z komórek i oczyszczane do analizy. Próbki ze stabilnymi izotopami są analizowane przy użyciu technik takich jak spektrometria mas lub spektroskopia NMR. Próbki z znakami promieniotwórczymi są analizowane za pomocą płynnego zliczania scyntylacyjnego i filmów rentgenowskich, co zostanie zademonstrowane w protokole znakowania izotopowego.

Znaczniki fotoreaktywne to grupy funkcyjne wbudowane w białka, które są stabilne do momentu wystawienia na działanie światła ultrafioletowego. Grupa funkcyjna tworzy reaktywny rodnik, który wiąże się z najbliższym białkiem. Typowym przykładem, L-fotoleucyna, jest pierścień diacyrynowy, który jest fotoreaktywnym środkiem sieciującym. W przeciwieństwie do znakowania izotopowego, istnieje pewna różnica chemiczna między fotoreaktywnymi analogami chemicznymi a ich naturalnymi odpowiednikami. Komórki mogą preferencyjnie zawierać naturalne związki zamiast analogów. Dlatego ważne jest, aby wykonać znakowanie fotoreaktywne w podłożu wolnym od naśladowanego związku. Po wystawieniu na działanie promieniowania ultrafioletowego grupy fotoreaktywne w znakowanym białku stają się niestabilne i wysoce reaktywne, powodując jego sieciowanie z oddziałującymi białkami, tworząc kompleks białkowy. Usieciowane kompleksy działają jak migawki, które można następnie analizować za pomocą metod SDS-PAGE i spektrometrii mas. Zapewnia to wgląd w to, jakie reakcje zachodzą w szlaku metabolicznym, identyfikując gatunki reakcji i sposób ich oddziaływania, określając miejsca wiązania.

Strategie znakowania bioortogonalnego wykorzystują analogi z małymi grupami funkcyjnymi, które mają niewielką lub żadną reaktywność z naturalnymi biomolekułami. Na przykład azydki to małe grupy funkcyjne, o których mówi się, że reaktywność jest ortogonalna do reakcji biochemicznych. W podwiązaniu Staudingera grupa fosfinowa atakuje grupę azydo. Daje to stan przejściowy, który reaguje wewnątrzcząsteczkowo z pobliskim estrem, w wyniku czego powstaje ligand związany aminami. Bioortogonalne grupy funkcyjne włączone do biomolekuł mogą być ligowane za pomocą znaczników detekcyjnych, takich jak fluorescencyjne grupy funkcyjne, i znaczników powinowactwa, takich jak antygeny.

Teraz, gdy omówiono już niektóre koncepcje i strategie znakowania metabolicznego, przyjrzyjmy się procesowi w laboratorium.

Pierwszym krokiem w eksperymencie znakowania metabolicznego jest zebranie interesującego białka. Aby to zrobić, komórki są hodowane na płytce, a metoda ekspresji jest stosowana w celu promowania syntezy pożądanego białka. W tym przykładzie dochodzi do ekspresji kinaz powtórzeniowych bogatych w leucynę lub LRRK. Jako analog stosuje się fosforan disodowy, zawierający radioaktywny fosfor-32. Należy podjąć odpowiednie środki w celu ochrony przed promieniowaniem jonizującym. Obejmuje to przygotowanie miejsca pracy, noszenie odpowiedniego sprzętu ochronnego i sprawdzanie skażenia radioaktywnego. Po podjęciu środków bezpieczeństwa przygotowuje się pożywkę zawierającą analogi izotopowe. Pożywkę z kultury usuwa się i zastępuje pożywką zawierającą izotopowe analogi chemiczne, a następnie inkubuje. Po inkubacji komórki są poddawane lizie. Lizat jest zbierany i oczyszczany.

Po oczyszczeniu białka są rozpuszczane za pomocą SDS-PAGE, a następnie przenoszone do membrany PVDF. Autoradiografia jest wykonywana przez wystawienie membrany na kliszę rentgenowską i mierzona za pomocą imagera luminoforowego. Western blotting służy do pomiaru względnego poziomu białka w błonie PVDF. W tym przykładzie zmierzono poziomy fosforylacji bogatych w leucynę kinaz powtórzeniowych syntetyzowanych w komórkach 293T. Autoradiogram pokazuje, ile fosforu zostało włączone do białka. Western blotting wyjaśnia poziomy białek LRRK. Oprogramowanie do analizy obrazu służy do uzyskiwania danych ilościowych dotyczących poziomów fosforylacji białek.

W następnej procedurze demonstrowane jest znakowanie fotoreaktywne. Najpierw komórki są przygotowywane i hodowane. Fotoreaktywny analog dodaje się do komórek w środkowej fazie logarytmu i inkubuje. W tej procedurze stosuje się p-benzoilofenyloalaninę. Próbki pobiera się w odstępach czasu i umieszcza na lodzie. Próbki są następnie poddawane ekspozycji w celu uzyskania migawek szlaków biochemicznych w czasie. Interesujące białka są następnie oczyszczane i rozpuszczane za pomocą SDS-PAGE.

Zastosowano strategię znakowania fotoreaktywnego w celu zidentyfikowania związków, które wchodzą w interakcje z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania. Immunodetekcja z Western blotting pokazuje, że prążki białkowe, które wskazują, że białka o większej masie cząsteczkowej są obecne w napromieniowanych próbkach. Są one wynikiem sieciowania w wyniku interakcji białko-białko zachodzącej podczas promieniowania UV.

Teraz, gdy dokonaliśmy przeglądu procedur znakowania metabolicznego, przyjrzyjmy się niektórym sposobom wykorzystania tego procesu.

Koncepcje znakowania metabolicznego można rozszerzyć na organizmy wielokomórkowe. Rośliny są uprawiane w szczelnym środowisku, bogatym w stabilne izotopy do wyprodukowanego znakowanego materiału roślinnego. Do obudowy dodawany jest dwutlenek węgla zawierający węgiel-13, natomiast stosowany jest nawóz bogaty w azot-15. Uzyskany w ten sposób materiał roślinny może pomóc odpowiedzieć na pytania dotyczące obiegu węgla i azotu w ekosystemie.

Znakowanie umożliwia oddzielenie nowo zsyntetyzowanego RNA od starszego RNA. Zmieniając początkowe stężenie analogu, można określić kinetykę syntezy nowego RNA. Wyniki pokazują, że stężenie 4-tiourydyny wpływa na ilość transkrybowanego nowego RNA. Dodatkowo, szybkość włączenia etykiety do RNA można bezpośrednio określić ilościowo za pomocą spektrofotometru.

Za pomocą biortogonicznej chemii kliknięć można znakować glikany w zarodku danio pręgowanego. Jaja są wstrzykiwane za pomocą związku znakującego, który powoduje powstawanie etykiet alkinowych na glikanach. Glikany w larwach są następnie podwiązywane do związku barwnika na pożądanym etapie rozwoju. Następnie obrazuje się glikany w zarodkach. Glikany wytwarzane w różnych punktach czasowych można zidentyfikować, oznaczając je różnymi kolorami na różnych etapach rozwoju zarodka.

Właśnie obejrzałeś film JoVE na temat etykietowania metabolicznego. W tym filmie opisano koncepcje stojące za etykietowaniem metabolicznym i ich strategie, omówiono dwie ogólne procedury i omówiono niektóre zastosowania tych technik.

Dzięki za oglądanie!