Name: Urządzenie mikroprzepływowe do ilościowego określania chemotaksji bakteryjnej w stabilnych gradientach stężeń (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-19T17:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: Poznaj mikroprzepływową metodę badania chemotaksji bakterii E. coli RP 4 37 w stabilnych gradientach stężeń. To podejście umożliwia precyzyjną analizę ruchu komórek w odpowiedzi na sygnały chemiczne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Praca ta była częściowo wspierana przez National Science Foundation (CBET 0846453).

1. Wytwarzanie matryc krzemowych przy użyciu standardowej fotolitografii SU-81(nie pokazano w tym filmie).
 <ol>
<li>Należy zastosować standardowe metody fotolitografii SU-8 w celu stworzenia „matrycy” SU-8 (SU-8 2025, MicroChem, Newton, MA) do wykonania formy z PDMS zawierającej sieć mikroprzepływową i komorę chemotaktyczną. Takie formy matrycowe można wykonać w dowolnej jednostce mikrowytwórczej (np. Stanford Microfluidics Foundry; <a href="http://thebigone.stanford.edu/foundry/">http://thebigone.stanford.edu/foundry/</a>). </li>
<li>Przed powielaniem w PDMS należy poddać matrycę SU-8 działaniu par fluorosilanu w eksykatorze podłączonym do źródła próżni, aby ułatwić oddzielenie PDMS od matrycy. Należy nanieść kroplę fluorosilanu na ręcznik papierowy i zastosować próżnię przez 1 min. Następnie należy odciąć próżnię i odczekać 30 min na osadzenie się fluorosilanu. Matrycę SU-8 należy przechowywać w zamkniętym pojemniku do późniejszego użycia. </li>
 </ol>
2. Formowanie replikacyjne PDMS z matrycy SU-8: Warstwa fluidyczna i warstwa sterująca są wytwarzane poprzez formowanie replikacyjne PDMS z matrycy SU-8.
<ol>
<li>Wymieszać prepolimer PDMS z utwardzaczem w stosunku masowym 10:1 i odgazować w eksyكاتهrze przez 1 godzinę (lub do momentu usunięcia pęcherzyków powietrza z mieszaniny PDMS).</li>
<li>Umieścić matrycę SU-8 w szalce Petriego i ostrożnie wlać mieszaninę PDMS na matrycę SU-8 do pożądanej grubości.</li>
<li>Podgrzewać szalkę Petriego zawierającą PDMS i formę matrycy SU-8 w temperaturze 80°C przez dwie godziny, aby utwardzić PDMS.</li>
<li>Zdjąć utwardzoną matrycę SU-8 pokrytą PDMS z płyty grzejnej i oddzielić formę z PDMS od matrycy SU-8. Pożądana struktura zostanie zatopiona w formie z PDMS.</li>
<li>Wywiercić w formie z PDMS otwory na rurki prowadzące do generatora gradientu i wlotu komórek, używając tępej igły o rozmiarze 20 G.</li>
</ol>
3. Bondowanie urządzeń z PDMS:
 <ol>
<li>Oczyść szklany szkiełko mikroskopowe izopropanolem i wysusz azotem lub strumieniem powietrza.</li>
<li>Poddaj PDMS i szkiełko szklane działaniu plazmy tlenowej w urządzeniu do trawienia plazmowego.</li>
<li>Dociśnij formę z PDMS do szkiełka szklanego. Podgrzewaj połączone szkiełko i formę z PDMS w temperaturze 65°C przez 15 min.</li>
</ol>
4. Montaż urządzenia z PDMS
<ol>
 <li>Za pomocą żyletki odciąć rurkę pod kątem 45°, zachowując odpowiednią długość wymaganą dla urządzenia.</li>
 <li>Wprowadzić jeden koniec rurki do otworów wykonanych w urządzeniu (np. wylotu), używając pęsety.</li>
 <li>Za pomocą pęsety wprowadzić tępą igłę o rozmiarze 30G do drugiego końca rurki.</li>
 <li>Powtórzyć krok 4.2 dla wszystkich pozostałych otworów.</li>
 <li>Pobrać 1mL buforu do chemotaksji (CB) do strzykawki 3mL, dbając o usunięcie pęcherzyków powietrza ze strzykawki.</li>
 <li>Zamocować piastę igły na jednym końcu rurki wylotowej.</li>
 <li>Dodać CB do piasty igły, a następnie opukać piastę, aby usunąć ewentualne pęcherzyki powietrza.</li>
 <li>Wypchnąć niewielką ilość CB z końcówki strzykawki i połączyć strzykawkę 3mL z piastą igły w sposób zapobiegający uwięzieniu powietrza.</li>
 <li>Przepchnąć CB przez urządzenie, aż wszystkie pozostałe piasty igieł zostaną wypełnione CB. Powinno to usunąć większość pęcherzyków powietrza.</li>
 <li>Napełnić dwie strzykawki 500μL buforem CB zawierającym odpowiednie stężenia testowanego chemoefektora. Aby zapobiec powstawaniu pęcherzyków powietrza, wypchnąć małą kroplę zawartości strzykawki, dotknąć kropli do cieczy w piastach igieł i połączyć elementy.</li>
 <li>W podobny sposób połączyć strzykawkę zawierającą CB z wlotem dla bakterii. Zostanie ona usunięta w momencie wprowadzania bakterii do urządzenia.</li>
</ol>
5. Hodowla wysoko ruchliwych E. coli
<ol>
<li>Hoduj nocne kultury E. coli RP437 z plazmidem ekspresyjnym GFP w 20 mL bulionu tryptonowego (TB) w temperaturze 32°C z wytrząsaniem. Dodaj odpowiednie stężenia antybiotyku w celu utrzymania plazmidu. W naszym protokole stosujemy plazmid o niskiej liczbie kopii pCM182 do detekcji bakterii na podstawie fluorescencji w urządzeniu. W przypadku E. coli zaleca się hodowlę w 32°C dla zapewnienia wysokiej ruchliwości, ponieważ ruchliwość jest niższa w wyższych temperaturach.</li>
<li>Wykorzystaj nocną kulturę do zaszczepienia 20 mL kultury TB w kolbie Erlenmeyera o pojemności 250 mL do gęstości optycznej przy 600nm wynoszącej ~ 0,05. Hoduj kulturę z wytrząsaniem w 32°C.</li>
<li>Zbierz komórki przy OD600 wynoszącej ~0,35–0,45 poprzez wirowanie z niską prędkością 400 x g przez 5 min.</li>
<li>Resuspenduj komórki do OD600 ~0,35 w buforze CB zawierającym chemoefektor w stężeniu przewidywanym w środku kanału.</li>
<li>Dodaj martwe komórki znakowane RFP przy OD600 ~ 0,35 do żywych komórek ekspresyjnych GFP. Martwe (czerwone) komórki służą jako kontrola wewnętrzna, aby upewnić się, że jakakolwiek migracja nie wynika z efektów przepływu.</li>
</ol>
6. Monitorowanie chemotaksji
<ol>
<li>Usuń część CB z piasty igły wlotowej do komory. Uzupełnij ją zawiesiną komórkową.</li>
<li>Ostrożnie napełnij strzykawkę 50 μL resuspensowanymi komórkami. Krok ten należy wykonać powoli, ponieważ flagella mogą zostać odcięte, co zmniejszy ruchliwość.</li>
<li>Przymocuj strzykawkę 50 μL do piasty igły wlotowej zgodnie z opisem w kroku 4.10.</li>
<li>Umieść urządzenie na stoliku mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w szybką kamerę do akwizycji obrazów. Umieść strzykawki wlotowe (zarówno strzykawki gradientowe 500 μL, jak i strzykawkę z komórkami 50 μL) w pompie strzykawkowej i rozpocznij przepływ tak, aby utworzył się gradient, a komórki zaczęły przepływać przez cewki.</li>
<li>Po wprowadzeniu komórek do komory chemotaktycznej odczekaj około 20 min aż system się ustabilizuje przed rozpoczęciem obrazowania.</li>
<li>Zbierz obrazy fluorescencji zielonej (żywe komórki) i czerwonej (martwe komórki) w różnych miejscach wzdłuż komory (odpowiadających różnym czasom ekspozycji). Zazwyczaj zbieramy 100 obrazów w każdym punkcie w odstępach 3 s.</li>
</ol>
7. Analiza danych: następujące kroki można wykonać przy użyciu dowolnego dostępnego komercyjnie programu do analizy obrazu (np. ImageJ, Metamorph) lub za pomocą prostych kodów napisanych w programie Matlab.
<ol>
<li>Usuń piksele tła z obrazu (tzn. ustaw próg intensywności pikseli i usuń wszystkie piksele, których intensywność jest niższa od progu). Minimalizuje to szum w analizie.</li>
<li>Wykorzystaj położenie martwych komórek (czerwona fluorescencja) do wyznaczenia centrum obrazu. Ponieważ martwe komórki nie wykazują chemotaksji, reprezentuje to pozycję, w której komórki weszły do komory chemotaktycznej i byłyby wykryte w przypadku braku jakiejkolwiek migracji.</li>
<li>Zlokalizuj żywe komórki (zielona fluorescencja) na obrazie.</li>
<li>Podziel obraz na kanały i określ liczbę żywych komórek w każdym kanale. W naszej poprzedniej pracy3 komora chemotaktyczna o szerokości 1050 μm została podzielona na 64 kanały o szerokości ok. 16 μm każdy.</li>
<li>Powtórz kroki 7.1–7.3 dla wszystkich obrazów i zsumuj całkowitą liczbę komórek dla każdego kanału we wszystkich obrazach. Pozwala to uzyskać całkowitą liczbę komórek wykrytych w każdym kanale w czasie trwania eksperymentu.</li>
<li>Oblicz współczynnik podziału chemotaksji (CPC), który reprezentuje kierunek migracji, w następujący sposób: każdej komórce znajdującej się po stronie wysokiego stężenia (prawej) i niskiego stężenia (lewej) względem martwych komórek przypisuje się mnożnik odpowiednio +1 i -1. Oznacza to, że komórka migrująca w górę gradientu jest mnożona przez +1, natomiast komórki poruszające się w dół gradientu są mnożone przez -1. Wszystkie pomnożone wartości są sumowane i normalizowane do całkowitej liczby wykrytych komórek. Na przykład wartość CPC wynosząca 0,40 wskazuje, że o 40% więcej całkowitej liczby bakterii przemieściło się na stronę wysokiego stężenia niż na stronę niskiego stężenia (tzn. chemoefektor jest atraktantem, ponieważ wykryto więcej bakterii poruszających się w górę gradientu).</li>
<li>Oblicz współczynnik migracji chemotaktycznej (CMC), który waży migrację komórek w zależności od przebytej odległości, w następujący sposób: pomnóż liczbę komórek w każdym kanale przez czynnik proporcjonalny do odległości, na jaką migrują komórki. Komórka, która przemieszcza się do najdalej położonej pozycji wysokiego stężenia (kanał 64), otrzymuje czynnik wagowy +1, natomiast komórka, która przemieściła się do połowy strony o wyższym stężeniu, otrzymuje czynnik wagowy +0,5, a komórka przemieszczająca się do najdalej położonej pozycji niskiego stężenia jest ważona przez -1. Zsumuj wszystkie ważone liczby komórek i znormalizuj je do liczby komórek, aby wygenerować CMC.</li>
</ol>
Reprezentatywne wyniki3,4:
Wykorzystaliśmy urządzenie mikrofluidyczne (Rysunek 1A) opisanej w niniejszym opracowaniu w celu zbadania chemotaksji E. coli w gradientach atraktantów (kwas asparginowy, autoinduktor-2) i repelentów (NiSO4, indol)3,4Prototypowy szczep chemotaktyczny5 E. coli Wykorzystano szczep RP437 eksponujący GFP, a także szczep zabity kanamycyną E. coli Komórki TG1 wykazujące ekspresję czerwonego białka fluorescencyjnego w celu monitorowania efektów przepływu. Gradient stężeń utworzony w μFlow urządzenie przedstawiono na Rysunek 1BWlot komory został zamknięty w taki sposób, aby uniemożliwić przepływ, a w urządzeniu ustanowiono stabilny gradient fluoresceiny w zakresie 0–100 ng/mL. Do wyznaczenia profilu stężeń fluoresceiny wykorzystano intensywność pikseli w obrębie urządzenia. Dane wykazują, że bakterie napotykają gradient liniowy w momencie wejścia do komory chemotaksji. Rycina 2A i B przedstawia obrazy fluorescencyjne E. coli Migracja RP437 w odpowiedzi na gradienty kwasu asparaginowego (0 100 μM) i NiSO4 (0 225 μM). Zaobserwowane reakcje na te kanoniczne substancje wabiące i odstraszające są zgodne z przewidywaniami. Rycina 3A przedstawia ilościowy rozkład E. coli RP437 w przypadku braku gradientu stężeń (tzn. zerowego gradientu kwasu asparginowego), podczas gdy Ryciny 3B i C przedstaw rozkład gradientów kwasu asparginowego i NiSO44Specyficzność tych odpowiedzi (tj. stronniczość w migracji) jest widoczna jako E. coli RP437 ΔSmała szczep (tj. szczep pozbawiony chemoreceptora Tar, który jest wykorzystywany w E. coli (do wykrywania kwasu asparaginowego i niklu) nie wykazuje błędu migracji w obecności gradientu stężeń kwasu asparaginowego lub NiSO44Trendy widoczne w profilach rozkładu przestrzennego są również zgodne z obliczonymi wartościami CPC i CMC. Wartości CPC dla migracji E. coli RP437 w gradientach kwasu asparaginowego lub NiSO₄4 wynoszą odpowiednio +0,33 i -0,33. Odpowiednie wartości CMC wynoszą odpowiednio +0,13 i -0,14. W przeciwieństwie do tego wartości CPC i CMC z E. coli RP437 ΔSmała szczepy w gradientach kwasu asparaginowego lub NiSO44 są pomijalne. Ponadto wartość CPC i CMC w gradiencie zerowym kwasu asparaginowego wynosi odpowiednio +0,03 i +0,02, co wskazuje na brak błędu migracji w przypadku braku gradientu.
<img src="/files/ftp_upload/1779/1779fig1a.jpg" alt="Schemat mikrofluidycznej komory do chemotaksji z generatorem gradientu do analizy ruchu bakterii." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1a"> <img src="/files/ftp_upload/1779/1779fig1b.jpg" alt="Wykres intensywności fluorescencji; analiza znormalizowanej pozycji; gęstość optyczna; badanie spektroskopowe." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1b"> Rycina 1. Schemat urządzenia i gradient stężeń. 
(A) Schematyczne przedstawienie mikrofluidycznego urządzenia do chemotaksji. Urządzenie składa się z modułu mieszania gradientu (20 x 100 x 18750 μm) oraz modułu obserwacji chemotaksji (20 x 1050 x 11500 μm). Szerokość dwóch kanałów gradientowych doprowadzonych do urządzenia wynosi 500 μm, a szerokość wlotu dla bakterii wynosi 50 μm. Wstawka przedstawia gradient cząsteczki sygnałowej (szarej) oraz bakterie migrujące w odpowiedzi na ten sygnał. Żywe bakterie przedstawiono jako pełne owale, natomiast martwe bakterie jako owale puste. (B) W urządzeniu wygenerowano gradient stężeń fluoresceiny od 0 do 100 ng/mL i zobrazowano go za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Obrazy fluorescencyjne zarejestrowano po 30 min i poddano kwantyfikacji poprzez analizę obrazu.
<img src="/files/ftp_upload/1779/1779fig2.jpg" alt="Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej przedstawiający porównanie agregacji białek zależnej od dawki przy różnych stężeniach." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> Rycina 2. Chemotaksja E. coli RP437 w urządzeniu mikrofluidycznym. 
E. coli RP437 wystawiono w urządzeniu na gradient (A) 0-100 μM L-asparaginianu lub (B) 0-225 μM NiSO4; migrację żywych bakterii (zielone) w kierunku L-asparaginianu lub z dala od niklu obrazowano co 2,5 sec przez 30 min. Martwe bakterie (czerwone) służyły jako kontrola efektów przepływu w urządzeniu. Obrazy poddano kwantyfikacji przy użyciu opracowanego wewnętrznie programu analitycznego3. Przedstawione dane to reprezentatywne obrazy w pseudokolorach z trzech niezależnych eksperymentów.
<img src="/files/ftp_upload/1779/1779fig3a.jpg" alt="Wykres rozkładu komórek; liczba vs. pozycja w mikrokanale; analiza danych z cytometrii przepływowej." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3a"> <img src="/files/ftp_upload/1779/1779fig3b.jpg" alt="Wykres analizy rozkładu komórek, liczba komórek vs. pozycja w kanale, wyniki elektroforezy" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3b"> <img src="/files/ftp_upload/1779/1779fig3c.jpg" alt="Wykres rozkładu komórek, pozycja vs. liczba komórek, wskazujący stężenie próbki w kanale." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3c"> Rycina 3: Ilościowe określenie profili migracji w odpowiedzi na kanoniczny atraktant i repelent. 
Rozkład przestrzenny RP437 w urządzeniu mikrofluidycznym w odpowiedzi na (A) jednorodne 100 μM L-asparaginianu (tzn. brak gradientu), (B) gradient asparaginianu 0 100 μM oraz (C) gradient NiSO4 0 225 μM. Rozkład martwych komórek przedstawiono linią ciągłą, rozkład komórek RP437 linią przerywaną, a rozkład komórek RP437 eda+ Δtar linią kropkowaną. Przedstawione dane są średnimi z trzech niezależnych eksperymentów.

<ol><li>McDonald, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prototyping+of+microfluidic+devices+in+poly%28dimethylsiloxane%29+using+solid-object+printing%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Prototyping of microfluidic devices in poly(dimethylsiloxane) using solid-object printing.</a> Anal Chem. 74, 1537-1545 (2002).</li>
<li>Hansen, M. C., Palmer, R. J. J., Udsen, C., White, D. C., Molin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+GFP+fluorescence+in+cells+of+Streptococcus+gordonii+under+conditions+of+low+pH+and+low+oxygen+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol%22%5BJournal%5D)">Assessment of GFP fluorescence in cells of Streptococcus gordonii under conditions of low pH and low oxygen concentration.</a> Microbiol. 147, 1383-1391 (2001).</li>
<li>Englert, D. L., Manson, M. D., Jayaraman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Flow-Based+Microfluidic+Device+for+Quantifying+Bacterial+Chemotaxis+in+Stable%2C+Competing+Gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A Flow-Based Microfluidic Device for Quantifying Bacterial Chemotaxis in Stable, Competing Gradients.</a> Appl Environ Microbiol. 75, 4557-4564 (2009).</li>
<li>Englert, D. L., Jayaraman, A., Manson, M. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEnglert%2C+DL+%22Microfluidic+techniques+for+the+analysis+of+bacterial+chemotaxis%22">Microfluidic techniques for the analysis of bacterial chemotaxis</a>. , Humana press. (2009).</li>
<li>Mao, H., Cremer, P. S., &amp, M. anson <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive%2C+versatile+microfluidic+assay+for+bacterial+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">A sensitive, versatile microfluidic assay for bacterial chemotaxis.</a> PNAS. 100 (9), 5449-5454 (2003).</li>
</ol>

Współczynnik podziału chemotaksji (CPC) oraz współczynnik migracji chemotaktycznej (CMC) można obliczyć zgodnie z opisem Mao et al5. Jeśli komórka zostanie wykryta po stronie wysokiego stężenia, przypisuje się jej wartość +1, natomiast komórce wykrytej po stronie niskiego stężenia przypisuje się wartość -1. Wartości te są sumowane i dzielone przez całkowitą liczbę komórek w celu wyznaczenia CPC. Znak CPC (dodatni lub ujemny) wskazuje kierunek migracji (w stronę sygnału lub od niego). Chociaż CPC wska...

urządzenie mikroprzepływowe do ilościowego oznaczania chemotaksji bakteryjnej w stabilnych gradientach stężeń

A Microfluidic Device for Quantifying Bacterial Chemotaxis in Stable Concentration Gradients

Chemotaksja pozwala bakteriom zbliżać się do źródeł substancji przyciągających lub unikać źródeł substancji odpychających. Bakterie nieustannie monitorują stężenie konkretnych chemoefektorów, porównując aktualne stężenie ze stężeniem wykrytym kilka sekund wcześniej. Porównanie to determinuje wypadkowy kierunek ruchu. Chociaż w naturze często współistnieją liczne, konkurujące ze sobą gradienty, konwencjonalne podejścia do badania chemotaksji bakteryjnej są suboptimalne w kontekście ilościowego określania migracji w odpowiedzi na gradienty stężeń substancji przyciągających i odpychających. W niniejszej pracy opisujemy opracowanie mikrofluidycznego modelu chemotaksji służącego do prezentowania bakteriom precyzyjnych i stabilnych gradientów stężeń chemoefektorów oraz ilościowego badania ich odpowiedzi na zastosowany gradient. Urządzenie jest wszechstronne, ponieważ dzięki mieszaniu dyfuzyjnemu można w nim łatwo generować gradienty stężeń o dowolnej pożądanej wartości bezwzględnej i sile gradientu. Działanie urządzenia zademonstrowano, wykorzystując odpowiedźEscherichia coli RP437 do gradientów aminokwasów i jonów niklu.

Niniejszy protokół opisuje opracowanie urządzenia mikroprzepływowego do badania chemotaksji bakteryjnej w stabilnych gradientach stężeń chemoefektorów.

Urządzenie mikroprzepływowe do ilościowego oznaczania chemotaksji bakteryjnej w stabilnych gradientach stężeń

Chemotaksja pozwala bakteriom zbliżać się do źródeł substancji przyciągających (atraktantów) lub unikać źródeł substancji odpychających (repelentów). Bakterie nieustannie monitorują...

Komórki E Coli RP 4 37 są wprowadzane do urządzenia do chemotaksji, w którym są poddawane działaniu określonych przestrzennych gradientów stężeń. Komórki wnikające do komory napotykają punkt środkowy gradientu stężeń. W zależności od tego, czy sygnał jest odbierany jako atraktant, czy repelent, bakterie szybko przemieszczają się w górę lub w dół gradientu stężeń.Witam, nazywam się Derek Engler i reprezentuję Laboratorium Biotechnologii Systemów Molekularnych oraz Katedrę Inżynierii Chemicznej na Texas A&amp;M University. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę badającą chemotaksję bakteryjną w urządzeniu mikrofluidycznym. W naszych laboratoriach wykorzystujemy tę procedurę do badania sposobu, w jaki szczep E. coli RP 437 migruje w gradiencie stężeń siarczanu niklu.Zacznijmy zatem. Warstwa fluidyczna i warstwa sterująca są wytwarzane metodą odlewania replikacyjnego polimetylosiloksanu (PDMS) z matrycy SU-8. Aby rozpocząć tę procedurę, wymieszaj prepolimer PDMS i utwardzacz w stosunku wagowym 10:1.Odgazuj mieszaninę w eksyكاته przez jedną godzinę, aż do całkowitego usunięcia pęcherzyków powietrza. Po przygotowaniu mieszaniny PDMS, umieść matrycę SU-8 w szalce Petriego i ostrożnie wlej mieszanin

a-microfluidic-device-for-quantifying-bacterial-chemotaxis-stable

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Urządzenie mikrofluidyczne do ilościowego określania chemotaksy bakteryjnej w stabilnych gradientach stężeń

Opisano proces wytwarzania kanałów mikroprzepływowych oraz ich zastosowanie w eksperymentach służących do badania zachowań chemotaktycznych morskich drobnoustrojów w niejednorodnym środowisku nutrientowym (patchy nutrient seascape) oraz zachowań pływackich bakterii w przepływie ścinającym.

Odpowiedź chemotaktyczna mikroorganizmów morskich na mikroskalowe warstwy składników odżywczych

Badania nad chemotaksją bakteryjną z wykorzystaniem mikroprzepływów – wywiad

Opisujemy protokół mikrofabrykacji mikroprzepływowego urządzenia do generowania gradientów, które umożliwia tworzenie przestrzennych i czasowych gradientów w ściśle określonym mikrośrodowisku. W tym podejściu mikroprzepływowe urządzenie do generowania gradientów może być wykorzystane do badania kierunkowej migracji komórek, embriogenezy, gojenia ran oraz przerzutów nowotworowych.

Mikroprzepływowe urządzenie do generowania gradientów w biologii komórki

Źródło: Scheidweiler, D. i in. Łączenie urządzeń płynowych z mikroskopią i cytometrią przepływową do badania transportu mikroorganizmów w ośrodkach porowatych na skalach przestrzennych. J. Vis. Exp. (2020).Ten film demonstruje użycie urządzenia mikrofluidycznego do ilościowego określania ruchliwości bakterii poprzez porowatą matrycę złożoną z losowo ułożonych filarów. Do urządzenia wprowadzane są fluorescencyjnie znakowane bakterie, obrazowane mikroskopią podczas przemieszczania się przez...

Ocena ruchliwości bakteryjnej za pomocą urządzenia mikrofluidycznego

Ten film demonstruje test chemotaksji neutrofili przy użyciu metody all-on-chip. Metoda ta pozwala na bezpośrednią izolację neutrofili z krwi pełnej poprzez immunomagnetyczną selekcję ujemną, a następnie test chemotaksji na chipie mikroprzepływowym.

Mikroprzepływowa metoda oparta na chipie do szybkiej analizy chemotaksji neutrofili przy użyciu krwi pełnej

Ten protokół szczegółowo opisuje test przeznaczony do pomiaru chemotaksji ludzkich neutrofili z jednej kropli krwi pełnej z solidną powtarzalnością. Takie podejście pozwala obejść potrzebę separacji neutrofili i wymaga tylko kilku minut czasu na przygotowanie testu. Chip mikroprzepływowy umożliwia wielokrotny pomiar chemotaksji neutrofili w czasie u niemowląt lub małych ssaków, gdzie objętość próbki jest ograniczona.

Platforma mikroprzepływowa do pomiaru chemotaksji neutrofili z nieprzetworzonej krwi pełnej

Ten protokół szczegółowo opisuje konfigurowalną metodę pomiaru migracji komórek w odpowiedzi na chemoatraktanty, które mogą być również użyte do określenia szybkości dyfuzji leku z matrycy polimerowej.

Konfigurowalna komora do pomiaru migracji komórek

Ten artykuł przedstawia szczegółową metodę przeprowadzania szybkiego testu chemotaksji neutrofili poprzez integrację wbudowanej izolacji neutrofili z krwi pełnej oraz testu chemotaksji na pojedynczym chipie mikroprzepływowym.

Kompleksowa metoda do szybkiej analizy chemotaksji neutrofili bezpośrednio z kropli krwi

Zbiorowa migracja komórek w procesie rozwoju, gojenia ran i przerzutów nowotworowych jest często kierowana przez gradienty czynników wzrostu lub cząsteczek sygnałowych. Opisano tutaj eksperymentalny system łączący mikroskopię trakcyjną z układem mikroprzepływowym oraz demonstrację sposobu ilościowego określania mechaniki migracji zbiorowej w warunkach gradientu biochemicznego.

Mikroskopia trakcyjna zintegrowana z mikrofluidyką do chemotaktycznej migracji zbiorowej

Przedstawiono protokół do generowania dynamicznych krajobrazów chemicznych przez fotolizę w układach mikroprzepływowych i milifluidowych. Metodologia ta jest odpowiednia do badania różnych procesów biologicznych, w tym zachowania ruchliwego, pobierania składników odżywczych lub adaptacji mikroorganizmów do substancji chemicznych, zarówno na poziomie pojedynczej komórki, jak i populacji.

Generowanie kontrolowanych, dynamicznych krajobrazów chemicznych w celu badania zachowania mikroorganizmów

Prezentowany jest tutaj protokół testu chemotaksji in situ, niedawno opracowanego urządzenia mikroprzepływowego, które umożliwia badanie zachowania mikroorganizmów bezpośrednio w środowisku.

Test chemotaksji in situ w celu zbadania zachowania mikroorganizmów w ekosystemach wodnych

Poznaj mikroprzepływową metodę badania chemotaksji bakterii E. coli RP 4 37 w stabilnych gradientach stężeń. To podejście umożliwia precyzyjną analizę ruchu komórek w odpowiedzi na sygnały chemiczne.

Urządzenie mikroprzepływowe do ilościowego oznaczania chemotaksji bakteryjnej w stabilnych gradientach stężeń

Przeglądaj więcej filmów