Urządzenie mikroprzepływowe do ilościowego określania chemotaksji bakteryjnej w stabilnych gradientach stężeń

Bakterie E Coli RP 4 37 są wprowadzane do urządzenia do chemotaksji, gdzie są poddawane określonej koncentracji przestrzennej. Gradienty Komórki wchodzące do komory napotykają punkt środkowy gradientu stężenia. W zależności od tego, czy sygnał jest odbierany jako atraktant, czy odstraszacz, bakterie szybko przemieszczają się w górę lub w dół gradientu stężeń.

Cześć, nazywam się Derek Engler i pracuję w Laboratorium Biotechnologii Systemów Molekularnych oraz na Wydziale Inżynierii Chemicznej Uniwersytetu w Teksasie. Dzisiaj pokażemy Ci procedurę badającą podatki od chemii bakteryjnej w urządzeniu mikroprzepływowym. Stosujemy tę procedurę w naszych laboratoriach do zbadania, w jaki sposób e. coli RP 4 37 migruje w gradiencie stężeń siarczanu niklu.

Więc zacznijmy. Warstwa płynowa i warstwa kontrolna są wytwarzane przez formowanie repliki z polimetylu SUBOXANE lub PDMS z ósmego mistrza SU. Aby rozpocząć tę procedurę, wymieszaj prepolimer PDMS i środek sieciujący w stosunku wagowym 10 do jednego.

Odgazuj mieszaninę w adiuplecie przez godzinę, aż pęcherzyki powietrza zostaną usunięte. Gdy mieszanina PDMS jest gotowa, umieść ósemkę SU na szalce Petriego i ostrożnie wylej mieszaninę na wierzch pompy SU ósemka do żądanej grubości Ciepło. Szalka Petriego zawierająca PDMS i SU osiem główna forma w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez dwie godziny w celu utwardzenia PDMS.

Po dwóch godzinach wyjmij utwardzony SSU eight master pokryty PDMS z płyty grzejnej i oderwij formę PDMS od SU eight master. Pożądana struktura zostanie osadzona w formie PDMS za pomocą igły o grubości 20 mm, końcówki, czterech otworów w formie PDMS do rurki do generatora gradientu, wlotu i wylotu ogniwa. Teraz jesteśmy gotowi do montażu urządzenia PDMS w celu połączenia urządzenia PDMS.

Najpierw wyczyść szklane szkiełko mikroskopowe izopropanolem i wypróbuj go za pomocą Airstream. Następnie wystawić formę PDMS i szkiełko na działanie plazmy tlenowej w wytrawiaczu plazmowym przez około 30 sekund. Doprowadź formę PDMS do kontaktu ze szklanym szkiełkiem Podgrzej styk szkiełka i formę PDMS do 65 stopni Celsjusza na płycie grzejnej przez 15 minut.

Aby zmontować urządzenie PDMS, użyj żyletki, aby przyciąć rurki pod kątem 45 stopni do odpowiedniej długości wymaganej w zależności od konfiguracji mikroskopu. Następnie za pomocą kleszczy. Włóż jeden koniec rurki do jednego z czterech otworów wybitych w urządzeniu.

Włóż piastę igły o rozmiarze 30 do drugiego końca rurki. Powtórz wkładanie rurki i piasty igły do wszystkich pozostałych otworów. Załaduj jeden mililitr podatków od chemii, bufora lub CB do trzymililitrowej strzykawki.

Ostrożnie, aby usunąć powietrze ze strzykawki. Dodaj CB do piasty igły wylotowej za pomocą pipety i postukaj w piastę igły, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza. Wypchnij trochę CB z końcówki trzymililitrowej strzykawki i podłącz strzykawkę do piasty igły Bez zatrzymywania powietrza.

Przepchnij CB przez urządzenie, aż wszystkie pozostałe piasty igieł zostaną wypełnione cb. Powinno to usunąć większość pęcherzyków powietrza. Następnie napełnij dwie strzykawki o pojemności 500 mikrolitrów CB zawierającym odpowiednie stężenia badanego efektora chemii.

Wyeliminuj tworzenie się pęcherzyków powietrza, wypychając niewielką kroplę zawartości strzykawki i dotykając kropli płynu w piaście igły i mocując strzykawkę w celu przygotowania wysoce ruchliwych bakterii. W eksperymencie chemotaksji należy wyhodować przez noc kulturę E coli RP 4 37 z ekspresją GFP, plazmidem w bulionie tryptonowym lub gruźlicą w temperaturze 32 stopni Celsjusza z potrząsaniem następnego dnia. Użyj hodowli nocnej, aby zaszczepić 20-mililitrową kulturę gruźlicy w 250-mililitrowej kolbie Erlenmeyera do gęstości optycznej przy 600 nanometrach około 0,05.

Hoduj kulturę w temperaturze 32 stopni Celsjusza z potrząsaniem, gdy komórki mają OD 600 około 0,35 do 0,45. Zbierz je przez wirowanie z niską prędkością, resus zawiesił komórki do OD 600 około 0,35 w CB zawierającym efektor chemioterapii w stężeniu oczekiwanym w środku kanału. Na koniec dodaj martwe komórki oznaczone znakiem RFP przy nr D 600 wynoszącym około 0,35 do GFP wyrażających żywe komórki.

Te martwe komórki będą stanowić kontrolę wewnętrzną, aby zapewnić, że jakakolwiek migracja nie jest spowodowana efektami przepływu. Zawiesina komórkowa jest teraz gotowa do załadowania do urządzenia mikroprzepływowego w celu przeprowadzenia eksperymentu chemotaksji. Aby rozpocząć eksperyment z chemotaksją, usuń część CB z wkładu piasty igły wlotu komórki z zawiesiną komórki.

Delikatnie napełnij strzykawkę o pojemności 50 mikrolitrów zawieszonymi komórkami. Rób to powoli, ponieważ wici mogą zostać ścięte, co zmniejszy ruchliwość. Podłącz strzykawkę o pojemności 50 mikrolitrów do piasty igły wlotowej, jak pokazano wcześniej, wypychając niewielką kroplę zawartości strzykawki i dotykając kropli płynu w piaście igły i mocując strzykawkę, ustaw urządzenie na stoliku mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w szybką kamerę do akwizycji obrazu.

Umieścić obie strzykawki wlotowe w pompie strzykawkowej i zainicjować przepływ w taki sposób, aby powstał gradient i komórki przepływały przez rurkę. Gdy komórki trafią do komory chemopodatkowej, odczekaj około 20 minut, aż system się ustabilizuje. Przed obrazowaniem należy zebrać żywe obrazy fluorescencji zielonej i martwej czerwieni w różnych miejscach na całej długości komory.

Zazwyczaj zbieramy 100 obrazów w każdej lokalizacji w trzysekundowych odstępach. Uzyskane obrazy fluorescencyjne mogą być analizowane za pomocą dowolnego dostępnego na rynku programu do analizy obrazów, takiego jak Image J lub metamorph, lub za pomocą prostych kodów napisanych w matlabie. W tym przykładzie użyjemy kodów MATLAB.

Zacznij od usunięcia pikseli tła na obrazie za pomocą tej ustawionej progowej intensywności pikseli i usuń wszystkie piksele, których intensywność jest mniejsza niż próg. Minimalizuje to hałas. W analizie użyj położenia martwych komórek, aby określić środek obrazu.

Reprezentuje to pozycję, w której komórki weszły do komory chemotaksji i gdzie zostałyby wykryte w przypadku braku jakiejkolwiek migracji. Następnie zlokalizuj żywe komórki na obrazie, podziel obraz na kanały i określ liczbę żywych komórek w każdym kanale. W naszej poprzedniej pracy komora chemioterapii o szerokości 10 50 mikrometrów została podzielona na 64 kanały, z których każdy miał około 16 mikrometrów szerokości.

Po powtórzeniu tych kroków dla wszystkich obrazów, niektóre z całkowitych komórek są zliczane dla każdego kanału na wszystkich obrazach. Daje to całkowitą liczbę komórek wykrytych na każdym kanale w czasie trwania eksperymentu. Oblicz podatki od chemii, współczynnik podziału lub CPC, który reprezentuje kierunek migracji.

Wykonując poniższe kroki, przypisz mnożnik plus jeden i minus jeden do każdej komórki znajdującej się odpowiednio w wysokim stężeniu lub prawym i niskim stężeniu lub lewej stronie martwych komórek. Zsumuj wszystkie pomnożone wartości i znormalizuj do całkowitej liczby wykrytych komórek. Oblicz podatki od chemii, współczynnik migracji lub CMC, który waży migrację komórek przez przebytą odległość.

Komórka, która przesuwa się do najdalszej pozycji o wysokim stężeniu kanału 64, otrzymuje współczynnik wagowy plus jeden, podczas gdy komórka, która przesuwa się do połowy strony o wyższym stężeniu, otrzymuje współczynnik wagi plus 0,5 i komórkę. Przejście do najdalszej pozycji o niskim stężeniu jest ważone minus jeden. Niektóre ze wszystkich ważonych komórek zliczają się i są znormalizowane do liczby komórek do wygenerowania CMC.

Ten wykres przedstawia liniowy gradient lub profil stężenia utworzony w urządzeniu mikroprzepływowym przy użyciu izotiocyjanianu fluoresceiny. Tworzenie gradientu stężeń pokazano na tym rysunku przy użyciu barwników w kolorze niebieskim i żółtym. Wlot do komórki był CA, więc nie było przez niego przepływu i można zauważyć, że tworzy się zakres kolorów od niebieskiego do żółtego.

Oto pseudokolorowe obrazy z reprezentatywnego eksperymentu chemotaksji, w którym E coli RP 4 37 wystawiono na działanie gradientu od zera do 100 mikromolowych L asparaginianu lub od zera do 225 mikromolowych siarczanów niklu w urządzeniu. Migrację żywych zielonych bakterii w kierunku al asparaginianu lub z dala od niklu obrazowano co 2,5 sekundy przez 30 minut. Martwe bakterie pokazane na czerwono służyły jako kontrola efektów przepływu w urządzeniu.

Rozkład przestrzenny RP 4 37 w urządzeniu mikroprzepływowym przy braku gradientu przedstawiono na tym wykresie w porównaniu z jego reakcją na gradient asparaginianu i gradient siarczanu niklu. Właśnie pokazaliśmy, jak monitorować podatki od chemioterapii E coli RP 4 37 w gradiencie siarczanu niklu. Wykonując tę procedurę, należy pamiętać o zminimalizowaniu wirowania komórek, aby można było zastosować subpopulację o wysokiej ruchliwości.

Więc to wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.