Platforma mikroprzepływowa do pomiaru chemotaksji neutrofili z nieprzetworzonej krwi pełnej

Ten protokół szczegółowo opisuje test przeznaczony do pomiaru chemotaksji ludzkich neutrofili z jednej kropli krwi pełnej z solidną powtarzalnością. Takie podejście pozwala obejść potrzebę separacji neutrofili i wymaga tylko kilku minut czasu na przygotowanie testu. Chip mikroprzepływowy umożliwia wielokrotny pomiar chemotaksji neutrofili w czasie u niemowląt lub małych ssaków, gdzie objętość próbki jest ograniczona.

Ta technologia mikroprzepływowa ma na celu pomiar funkcjonalności ludzkich neutrofili bezpośrednio z jednej kropli krwi na platformie, która może być multipleksowana. Centralna komora załadowcza służy jako źródło krwi pełnej, a także działa jako zlew dla gradientów atraktantu chemioterapii, które tworzą się z 16 ogniskowych komór chemotaktycznych. Unikalna filtracja mechaniczna czerwonych krwinek umożliwia badanie funkcji neutrofili w naturalnym kontekście krwi, składników komórkowych i biochemicznych.

Rozwidlenie między kanałem prowadzącym do ogniskowej komory chemotaktycznej a kanałem wychodzącym z urządzenia umożliwia kwantyfikację i modulację kierunkowości migrujących neutrofili. W ten sposób wyniki mogą pokazać, jak aktywnie migrujące neutrofile łatwo migrują obok uwięzionych czerwonych krwinek i gromadzą się w dużej liczbie w czasie. Jedną z unikalnych cech naszych urządzeń mikroprzepływowych jest to, że są one bardzo łatwe w produkcji i konfiguracji.

Składają się z warstwy PDMS odlanej na mikro sfabrykowaną płytkę, którą spajamy na szklanym dnie, płytce jedno lub wielodołkowej. Główną zaletą tej techniki jest to, że wymaga tylko kropli krwi pełnej. Urządzenia mogą być używane ze standardowymi pipetami, nie mają ruchomych części, nie wymagają przewodów ani zewnętrznych pomp strzykawkowych.

Implikacje tej techniki rozciągają się na zastosowania kliniczne w porównaniu z naszymi, które są wymagane przy użyciu tradycyjnych technik. Nasze podejście zajmuje kilka minut od momentu pobrania krwi do testów migracji neutrofili. Nowatorskie grzebienie filtrujące czerwone krwinki zapobiegają blokowaniu aktywnej migracji neutrofili przez erytrocyty czerwone i odróżniają tę metodę od innych metod mikroprzepływowych.

Wymaga to usunięcia krwi przed wykonaniem testów chemioterapii. Mechaniczne zagłuszanie czerwonych krwinek i kanałów wyróżnia naszą technologię i umożliwia badanie neutrofili w naszym fizjologicznym środowisku krwi pełnej, w tym w surowicy i płytkach krwi. Tak więc technologia jest precyzyjna i łatwa w użyciu, a także może znacznie poszerzyć naszą wiedzę na temat roli neutrofili i wrodzonego układu odpornościowego C w zdrowiu i chorobie.

Wykonaj płytkę wzorcową, aby zdefiniować kanały migracji zgodnie z instrukcjami producenta Pierwszy wzór. Pierwsza trzymikronowa ujemna warstwa fotorezystu na bazie żywicy epoksydowej, a następnie tworzy wzór drugiej warstwy 50 mikronów, aby zdefiniować komory obciążenia komórek i chemokiny. Teraz do odlewu Urządzenia z polimetylu soanu energicznie mieszaj 20 gramów PDMS z dwoma gramami inicjatora przez pięć minut.

Ostrożnie wylej PDMS na wzorzystą płytkę i odgazuj w próżniowym osuszaniu przez godzinę. Następnie piecz i utwardzaj urządzenia mikroprzepływowe PDMS w piekarniku o temperaturze 65 stopni Celsjusza przez co najmniej trzy godziny. Aby upewnić się, że PDMS jest pieczony w odpowiedniej temperaturze, należy monitorować temperaturę wewnętrzną piekarnika za pomocą termometru.

Wybij środkowe komory ładowania krwi pełnej o średnicy 1,5 milimetra. Wybij również całe urządzenia w kształcie pączków o średnicy 5,0 milimetrów. Usuń cząstki z urządzeń do pączków za pomocą taśmy klejącej.

Następnie opłucz płytkę wielodołkową wodą dejonizowaną i osusz azotem po umieszczeniu płytki w piekarniku o temperaturze 60 stopni Celsjusza na pięć minut. Leczenie plazmą tlenową przez 35 sekund. Następnie dodaj urządzenia do pączków i plazmę tlenową.

Traktuj ponownie przez kolejne 35 sekund. Ostrożnie przenieś urządzenia do dołków płyty i piecz za pomocą połączonych urządzeń na płycie grzejnej o temperaturze 80 stopni Celsjusza przez 10 minut. Po obróbce plazmą tlenową urządzenie jest hydrofilowe, a efekty kapilarne mogą sprzyjać zalewaniu małych kanałów w urządzeniu.

W przypadku roztworu atraktantu chemioterapii wymieszaj pięć mikrolitrów 10 mikromolowych FMLP z pięcioma mikrolitrami jednego miligrama na mililitr fibronektyny i 490 mikrolitrami HBSS. Powoli odpipetować roztwór atraktantu chemioterapii do pełnej komory ładowania krwi, pipety i dodatkowych 20 mikrolitrów atraktantu chemioterapii na zewnątrz urządzenia. Umieść talerz w suchym nasyceniu na 15 minut.

Zastosuj podciśnienie do urządzenia, aby zalać je roztworem atraktantu do chemioterapii. Wyjąć płytkę z osuszacza i potwierdzić zwilżenie kanału urządzenia poprzez stopniowe zmniejszanie wielkości pęcherzyka powietrza. Następnie dokładnie umyj całą komorę ładowania krwi i zewnętrzną część urządzenia, aby usunąć nadmiar roztworu atraktantu chemioterapii.

Następnie należy wygenerować gradient atraktantu chemioterapii z każdej z ogniskowych komór chemotaktycznych do centrum urządzenia. Delikatnie wstrzyknij 100 mikrolitrów PBS do otworu, aby na górze urządzenia utworzyła się kropla PBS. Przechyl płytkę i odpipetuj jeden mililitr PBS wokół urządzenia, aby zebrać na dnie studzienki, zassać płyn i powtórzyć płukanie PBS trzy razy.

Następnie napełnij każdą studzienkę mediami, aby zanurzyć urządzenia i odczekaj 15 minut, aż gradient się ustabilizuje. Następnie powoli odpipetuj dwa mikrolitry krwi pełnej do każdej komory ładowania krwi pełnej. W celu pobrania krwi z nakłucia palca umyj ręce wodą z mydłem.

Osusz skórę jako przeciwzakrzepowy roztwór plamy. Dodaj jeden mililitr 0,2% HSA i 10 mikrolitrów 32,4 mikromolowych haków. Zabarwić probówkę do pobierania krwi z heparyną, nakłuć palec zdrowego dawcy i zetrzeć pierwszą kroplę krwi.

Zbierz 50 mikrolitrów krwi do roztworu barwnika przeciwzakrzepowego i delikatnie wymieszaj. Ustaw biokomorę na 37 stopni Celsjusza, 80% wilgotności i 5% CO2. Natychmiast rozpocznij obrazowanie poklatkowe przy powiększeniu 10x lub większym, aby uzyskać sensowną analizę statystyczną Ręcznie śledź co najmniej 50 neutrofili w każdej próbce.

Policz komórki wchodzące do komór ogniskowej chemotaksji w czasie. Następnie korzystając z obrazu J, oblicz prędkości neutrofili w kanale między WBLC a FCC. Następnie, aby określić ilościowo kierunkowość neutrofili, policz liczbę komórek, które przechodzą przez bifurkację i oblicz stosunek między liczbą komórek, które obracają się w kierunku ogniskowych komór chemotaksji, a komórkami, które opuszczają urządzenie.

Komórki, które nie są kierunkowe, nie podążają za gradientem chemotaktycznym i dlatego migrują w równych ilościach w kierunku FCC i kanału wyjściowego. W tym eksperymencie test chemotaksji neutrofili we krwi pełnej został zwalidowany poprzez pomiar akumulacji neutrofili w kierunku gradientu FMLP. Wyniki potwierdzają, że czerwone krwinki są wychwytywane przez grzebień filtracyjny, podczas gdy neutrofile są w stanie aktywnie migrować z krwi pełnej.

Stabilny liniowy gradient atraktantu chemioterapii utworzony przez urządzenie mikroprzepływowe z całą krwią został potwierdzony za pomocą dekstranu znakowanego FSE, a poziomy fluorescencji zmierzono w czasie. Wyniki uzyskane przy użyciu nowatorskiej platformy WB Chemotaxis pokazują, że neutrofile ze wszystkich źródeł krwi migrują ze stałą prędkością i z podobną całkowitą liczbą komórek migrujących. Co ważne, system ten pozwala na ilościowe określenie liczby neutrofili, a tym samym odróżnia chemotaksję od kinezy chemioterapii Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w mniej niż 10 minut, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.

Umieszczenie naszego urządzenia w płytce 12- lub 24-dołkowej przy użyciu standardowych technik pomieszczenia czystego, urządzeń, badań przesiewowych w wielu warunkach jednocześnie. Za pomocą tej techniki jesteśmy w stanie zmierzyć prędkość i kierunkowość neutrofili na poziomie pojedynczej komórki. W przeciwieństwie do tradycyjnych metod, które mierzą masową migrację komórek punktu końcowego, należy pamiętać, aby ostrożnie zalać urządzenie mikroprzepływowe i powoli ładować obie próbki, aby erytrocyty nie zostały wypchnięte poza com urządzenia.

Opisany protokół jest szczególnie przydatny do pomiaru przejściowych niedoborów chemotaktycznych neutrofili, umożliwiając wielokrotne pobieranie próbek w wielu punktach czasowych, ale może być również dostosowany do pomiaru migracji innych typów komórek z różnych organizmów modelowych. Metoda ta może dostarczyć informacji na temat tymczasowych zmian w funkcjonalności neutrofili u pacjentów z różnymi schorzeniami związanymi z częstszą częstością występowania infekcji, w tym u pacjentów po urazach, pacjentów po poważnych operacjach chirurgicznych i pacjentów z rakiem otrzymujących chemioterapię.