Name: Platforma mikroprzepływowa do pomiaru chemotaksji neutrofili z nieprzetworzonej krwi pełnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
Description: Poznaj mikroprzepływową platformę do pomiaru chemotaksji neutrofili z nieprzetworzonej krwi pełnej. Ta metoda umożliwia szybką, ilościową analizę migracji komórek bez konieczności ich izolacji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wsparcie ze strony National Institutes of Health (granty GM092804, DE019938) i Shriners Burns Hospital.

1. Produkcja urządzeń mikroprzepływowych
<ol>
	<li>Korzystając ze standardowych technik fotolitograficznych, wyprodukuj płytkę wzorcową w czystym pomieszczeniu klasy 1,000. Ułóż wzór pierwszej warstwy ujemnego fotorezystu na bazie żywicy epoksydowej o grubości 3 μm, aby zdefiniować kanały migracji zgodnie z instrukcjami producenta. Ułóż wzór drugiej warstwy o grubości 50 μm, aby zdefiniować komory ładowania komórek i chemokin.</li>
	<li>Użyj wzorzystej płytki do odlewania urządzeń z polidimetylosiloksanu (PDMS). Energicznie mieszaj PDMS (20 g) z inicjatorem (2 g) przez 5 minut za pomocą plastikowego widelca w dużej plastikowej wadze wagowej.</li>
	<li>Ostrożnie wlej PDMS na formę.</li>
	<li>Odgazowanie PDMS poprzez umieszczenie formy z wylanym PDMS w eksykatorze próżniowym na 1 godzinę.</li>
	<li>Piecz i utwardzaj urządzenia mikroprzepływowe PDMS przez co najmniej 3 godziny w piekarniku ustawionym na 65 °C.</li>
	<li>Wytnij środkowe WBLC za pomocą dziurkacza o średnicy końcówki 1,5 mm.</li>
	<li>Wykrawaj całe urządzenia w kształcie pączków za pomocą dziurkacza o średnicy końcówki 5,0 mm.</li>
	<li>Usuń cząstki z urządzeń do pączków za pomocą taśmy klejącej.</li>
	<li>Opłucz 12-dołkową płytkę wodą dejonizowaną, a następnie osusz azotem. Wstaw talerz do piekarnika o temperaturze 60 °C na 5 minut.</li>
	<li>Plazma tlenowa potraktuj 12-dołkową płytkę dwukrotnie; raz samodzielnie przez 35 sekund, a następnie ponownie za pomocą urządzeń do pączków przez kolejne 35 sekund.</li>
	<li>Ostrożnie umieść urządzenia w dołkach płyty za pomocą pęsety.</li>
	<li>Piec blachę z połączonymi urządzeniami na płycie grzejnej ustawionej na 80 °C przez 10 minut.</li>
</ol>
2. Przygotowanie testu mikroprzepływowego
<ol>
	<li>Urządzenia mikroprzepływowe należy zalać natychmiast po obróbce plazmą tlenową, gdy urządzenie jest hydrofilowe, a efekty kapilarne mogą sprzyjać zalewaniu małych kanałów w urządzeniu.</li>
	<li>Stworzyć roztwór chemoatraktantu, mieszając 5 μl fMLP [roztwór podstawowy 10 μM] z 5 μl fibronektyny [roztwór podstawowy 1 mg/ml] i 490 μl HBSS.</li>
	<li>Powoli pipetować roztwór chemoatraktantu do WBLC za pomocą końcówki do napełniania żelem (Rysunek 1A). Odpipetować dodatkowe 20 μl chemoatraktantu na zewnątrz urządzenia.</li>
	<li>Umieścić płytkę w eksykatorze na 15 minut. Poprzez zastosowanie podciśnienia do urządzenia, roztwór jest wkraplany do bocznych kanałów urządzenia, a wyparte powietrze jest rozpraszane przez PDMS.</li>
	<li>Wyjąć płytkę z eksykatora i potwierdzić zwilżenie kanału urządzenia pod mikroskopem. Obserwuj, jak pęcherzyk zmniejsza się, gdy roztwór chemoatraktantu dostaje się do komory. Po obróbce próżniowej w urządzeniu nie powinny znajdować się pęcherzyki.</li>
	<li>Dokładnie umyj WBLC i zewnętrzną część urządzenia, aby usunąć nadmiar roztworu chemoatraktantu. Ten krok generuje gradient chemoatraktantu z każdej z ogniskowych komór chemotaktycznych (FCC) do centrum urządzenia.
	<ol>
		<li>Napełnić strzykawkę o pojemności 1 ml PBS, dodać do strzykawki końcówkę igły o stężeniu 30 g. Delikatnie włożyć końcówkę igły strzykawki w środek otworu na pączek. Delikatnie wepchnij 100 μl PBS do otworu, tak aby na górze urządzenia utworzyła się kropla PBS.</li>
		<li>Przechylić płytkę i odpipetować 1 ml PBS wokół urządzenia, tak aby płyn zebrał się na dnie studzienki. Zassać ciecz i powtórzyć proces w sumie 3 razy przy użyciu świeżego roztworu buforowego (użyj pożywki zamiast buforu, jeśli oddzielone neutrofile zostaną załadowane do pożywki)9.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Napełnij każdą studzienkę mediami, aż górne części urządzeń zostaną zanurzone w płynie. Pozostaw urządzenia na 15 minut, aby umożliwić ustabilizowanie się gradientu. Wyniki eksperymentalne i dane teoretyczne z symulacji elementów skończonych pokazują, że gradienty w tych urządzeniach są stabilne do 24 godzin dla małych cząsteczek (np. fMLP) i do kilku dni dla większych mas cząsteczkowych (np. IL8).</li>
	<li>Używając końcówek do ładowania żelem, powoli pipetuj 2 μl krwi (lub wyizolowanych neutrofili) do każdej komory ładowania krwi pełnej (WBLC) (Rysunek 1A).</li>
</ol>
3. Przygotowanie próbki
Ludzkie neutrofile z krwi włośniczkowej
<ol>
	<li>Pobrać krew włośniczkową z nakłucia palca zdrowego ochotnika, który nie przyjmuje leków immunosupresyjnych. Wszystkie próbki pacjentów zostały pobrane za pisemną świadomą zgodą i za pomocą procedur zatwierdzonych przez MGH i Shriners Institutional Review Board.
	<ol>
		<li>W celu pobrania krwi z nakłucia palca umyj ręce wodą z mydłem i osusz skórę. Przygotować roztwór podstawowy antykoagulantu/barwnika, dodając 1 ml HBSS + 0,2% HSA i 10 μl barwnika Hoechst (32,4 μM) do probówki do pobierania krwi heparyny (1,65 USP/50 μl krwi). Nakłuć palec za pomocą bezpiecznego lancetu SurgiLance (głębokość 2,2 mm, 22 G), zetrzeć pierwszą kroplę krwi i zebrać 50 μl krwi do probówki Eppendorf zawierającej podstawowy antykoagulant i fluorescencyjny roztwór plamy Hoechst (10 μl) i delikatnie wymieszać.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubować krew i barwnik Hoechst przez 10 minut, aby umożliwić barwienie fluorescencyjne jądra. Uruchom próbkę w ciągu 1 godziny od pobrania krwi.</li>
</ol>
Ludzkie neutrofile z krwi żylnej
<ol start="3">
	<li>Pobrać 10 ml obwodowej krwi żylnej do probówek zawierających 33 heparynę USP.</li>
	<li>Dodać 50 μl krwi żylnej do pożywki i zabarwić metodą Hoechsta, jak opisano wcześniej. Inkubować krew i barwnik Hoechst przez 10 minut, aby umożliwić barwienie fluorescencyjne jądra. Uruchom próbkę w ciągu 1 godziny od pobrania krwi.</li>
</ol>
Oddzielenie neutrofili od krwi pełnej - kontrola pozytywna
<ol start="5">
	<li>Aby oddzielić neutrofile, należy użyć sterylnych technik do wyizolowania neutrofili z 10 ml próbki krwi pełnej żylnej przy użyciu gradientu gęstości hetaskrobi (6% w/v), a następnie zestawu do izolacji kulek magnetycznych o negatywnej selekcji zgodnie z protokołem producenta.</li>
	<li>Zawiesiła końcową podwielokrotność neutrofili w stężeniu 4 000 komórek/μl w 1X HBSS + 0,2% albumina surowicy ludzkiej. Utrzymuj komórki w temperaturze 37 °C do czasu przygotowania do przeprowadzenia eksperymentu.</li>
</ol>
4. Mikroskopia i analiza obrazu do pomiarów chemotaksji neutrofili
<ol>
	<li>Ustaw temperaturę biokomory na 37 °C, wilgotność na 80%, a CO2 na 5%.</li>
	<li>Natychmiast rozpocznij obrazowanie, korzystając z obrazowania poklatkowego pod mikroskopem (powiększenie 10x lub większe).</li>
</ol>
5. Analiza statystyczna
<ol>
	<li>Ręcznie śledź co najmniej 50 neutrofili w każdej próbce.</li>
	<li>Policz komórki wchodzące do FCC w czasie (Rysunek 2).</li>
	<li>Oblicz prędkości neutrofili w kanale między WBLC i FCC za pomocą ImageJ (NIH) (rysunek 2).</li>
	<li>Określ ilościowo kierunkowość neutrofili, licząc liczbę komórek, które przechodzą przez bifurkację i obliczając stosunek między liczbą komórek, które zwracają się w kierunku FCC, a komórkami, które opuszczają urządzenie. Komórki, które nie są kierunkowe, nie podążają za gradientem chemotaktycznym i dlatego migrują w równych ilościach w kierunku FCC i kanału wyjściowego (ryc. 2).</li>
</ol>

<ol><li>Hansson, G. K., Robertson, A. K., Soderberg-Naucler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+and+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+pathology%22%5BJournal%5D)">Inflammation and atherosclerosis.</a> Annual review of pathology. 1, 297-329 (2006).</li>
<li>Phillipson, M., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neutrophil+in+vascular+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">The neutrophil in vascular inflammation.</a> Nature medicine. 17, 1381-1390 (2011).</li>
<li>Butler, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burn+injury+reduces+neutrophil+directional+migration+speed+in+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Burn injury reduces neutrophil directional migration speed in microfluidic devices.</a> PloS one. 5, (2010).</li>
<li>Lavrentieva, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+markers+in+patients+with+severe+burn+injury.+What+is+the+best+indicator+of+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Burns+%3A+journal+of+the+International+Society+for+Burn+Injuries%22%5BJournal%5D)">Inflammatory markers in patients with severe burn injury. What is the best indicator of sepsis.</a> Burns : journal of the International Society for Burn Injuries. 33, 189-194 (2007).</li>
<li>De Filippo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mast+cell+and+macrophage+chemokines+CXCL1%2FCXCL2+control+the+early+stage+of+neutrophil+recruitment+during+tissue+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Mast cell and macrophage chemokines CXCL1/CXCL2 control the early stage of neutrophil recruitment during tissue inflammation.</a> Blood. 121, 4930-4937 (2013).</li>
<li>Mankovich, A. R., Lee, C. Y., Heinrich, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+serum+heat+treatment+on+chemotaxis+and+phagocytosis+by+human+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Differential effects of serum heat treatment on chemotaxis and phagocytosis by human neutrophils.</a> PloS one. 8, (2013).</li>
<li>Palabrica, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+accumulation+promoting+fibrin+deposition+is+mediated+in+vivo+by+P-selectin+on+adherent+platelets%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Leukocyte accumulation promoting fibrin deposition is mediated in vivo by P-selectin on adherent platelets.</a> Nature. 359, 848-851 (1992).</li>
<li>Sackmann, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+kit-on-a-lid%3A+a+versatile+platform+for+neutrophil+chemotaxis+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Microfluidic kit-on-a-lid: a versatile platform for neutrophil chemotaxis assays.</a> Blood. 120, (2012).</li>
<li>Jones, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+chambers+for+monitoring+leukocyte+trafficking+and+humanized+nano-proresolving+medicines+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Microfluidic chambers for monitoring leukocyte trafficking and humanized nano-proresolving medicines interactions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 20560-20565 (2012).</li>
<li>Nauseef, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+human+neutrophils+from+venous+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of human neutrophils from venous blood.</a> Methods Mol Biol. 412, 15-20 (2007).</li>
<li>Lyons, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+analysis+of+human+leucocyte+subsets%3A+the+advantages+of+positive+selection+and+rapid+purification%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+genomics%22%5BJournal%5D)">Microarray analysis of human leucocyte subsets: the advantages of positive selection and rapid purification.</a> BMC genomics. 8, (2007).</li>
<li>Hasenberg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+immunomagnetic+negative+enrichment+of+neutrophil+granulocytes+from+murine+bone+marrow+for+functional+studies+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Rapid immunomagnetic negative enrichment of neutrophil granulocytes from murine bone marrow for functional studies in vitro and in vivo.</a> PloS one. 6, (2011).</li>
<li>Agrawal, N., Toner, M., Irimia, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+migration+assay+from+a+drop+of+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+chip%22%5BJournal%5D)">Neutrophil migration assay from a drop of blood.</a> Lab on a chip. 8, 2054-2061 (2008).</li>
<li>Hoang, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+neutrophil+speed+and+directionality+during+chemotaxis%2C+directly+from+a+droplet+of+whole+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Technology%22%5BJournal%5D)">Measuring neutrophil speed and directionality during chemotaxis, directly from a droplet of whole blood.</a> Technology. 0, 1-9 (2013).</li>
<li>Kurihara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolvin+D2+restores+neutrophil+directionality+and+improves+survival+after+burns%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+journal+%3A+official+publication+of+the+Federation+of+American+Societies+for+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Resolvin D2 restores neutrophil directionality and improves survival after burns.</a> FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. , (2013).</li>
<li>Buffone, V., Meakins, J. L., Christou, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+function+in+surgical+patients.+Relationship+to+adequate+bacterial+defenses%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Surg%22%5BJournal%5D)">Neutrophil function in surgical patients. Relationship to adequate bacterial defenses.</a> Arch Surg. 119, 39-43 (1984).</li>
<li>Malawista, S. E., de Boisfleury Chevance, A., van Damme, J., Serhan, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tonic+inhibition+of+chemotaxis+in+human+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Tonic inhibition of chemotaxis in human plasma.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 17949-17954 (2008).</li>
</ol>

Nie ma żadnych konfliktów interesów, które można by ujawnić.

W ramach tej pracy opracowaliśmy platformę mikroprzepływową do pomiaru chemotaksji neutrofili z kropli krwi (2 μl). Wbudowana w układ mechaniczny filtracja erytrocytów z aktywnie migrujących neutrofili pozwala uniknąć konieczności stosowania kłopotliwych metod separacji komórek, takich jak gradienty gęstości10, selekcja pozytywna11 lub selekcja ujemna12, które są podatne na wprowadzanie artefaktów poprzez aktywację neutrofili. Mechaniczna filtracja erytrocytów odróżnia naszą technologię o...

Handel neutrofilami odgrywa kluczową rolę w określaniu postępu i rozwiązania wielu stanów zapalnych, w tym miażdżycy1, infekcji bakteryjnej lub sepsy2 i oparzeń3. Ze względu na ich duży wpływ na zdrowie i stany chorobowe, liczba neutrofili jest częścią standardowej analizy krwi, często rozważanej w laboratoriach klinicznych i badawczych. Jednak pomimo tego, że jest to jeden z najbardziej wszechobecnych testów, wartość liczby neutrofili w diagnostyce infekcji i sepsy jest często kwestionowana4. Na przykład jedno z badań neutrofili u pacjentów z oparzeniami wykazało, że liczba neutrofili i funkcja migracji neutrofili nie są ze sobą powiązane; Oznacza to, że sama liczba granulocytów obojętnochłonnych nie jest dokładnym wskaźnikiem stanu immunologicznego3. Chociaż trudniejsza do zmierzenia, kompetencja funkcjonalna neutrofili została zaproponowana jako bardziej wartościowa w szerokim zakresie warunków.
Co ważne, wiele defektów neutrofili jest przejściowych i nie są wywoływane przez trwałe wady genetyczne, rozróżnienie, które do niedawna było w dużej mierze pomijane w klinice. W kontekście oparzeń migracja neutrofili może być monitorowana w trakcie leczenia pacjenta jako wskaźnik stanu zapalnego lub infekcji3. Tradycyjne testy migracji stosowane obecnie w laboratorium (komora Boydena, komora Dunna, test mikropipet) nie mogą być przełożone na warunki kliniczne, ponieważ wymagają dużych objętości krwi i kłopotliwych, czasochłonnych technik izolacji neutrofili (Tabela 1). Testy te nie mogą być również wykorzystywane do monitorowania przejściowych zmian w chemotaksji neutrofili u małych zwierząt laboratoryjnych, takich jak myszy, ponieważ objętość krwi potrzebna do izolacji neutrofili pozwala na pobranie tylko jednej próbki, a często wymaga nawet zebrania krwi od wielu zwierząt w jednym teście. Na przykład badanie obejmujące wiele schorzeń i metod leczenia w wielu punktach czasowych może potencjalnie wymagać tysięcy myszy przy użyciu obecnych testów chemotaksji. Ogranicza to podstawowe badania biologiczne, które można przeprowadzić, aby zrozumieć złożoną dynamikę funkcji immunologicznej w kontekście urazu, infekcji lub oparzenia, często badanych w modelach mysich5.
Aby zaspokoić potrzebę szybkiego i solidnego testu funkcjonalnego neutrofili, a jednocześnie wymagającego minimalnej objętości krwi, opracowaliśmy urządzenie mikroprzepływowe, które mierzy chemotaksję neutrofili bezpośrednio z małej kropli krwi pełnej. Wiadomo, że wiele czynników we krwi pełnej, w tym surowica6 i płytki krwi7, wpływa na czynność neutrofili. Dlatego korzystne jest, że test mikroprzepływowy krwi pełnej minimalizuje przetwarzanie próbki w celu utrzymania mikrośrodowiska in vivo neutrofili podczas pomiaru zmian chemotaksji za pomocą testu in vitro 8. Takie podejście skraca czas od pobrania krwi do testów migracji neutrofili z godzin przy użyciu tradycyjnych technik do zaledwie minut (Tabela 1). Platforma mikroprzepływowa całej krwi wytwarza stabilny liniowy gradient chemoatraktantu przez cały czas trwania eksperymentu, nie ma ruchomych części i nie wymaga zewnętrznego źródła ciśnienia (np. pompy strzykawkowej). Kluczową cechą konstrukcji urządzenia mikroprzepływowego do krwi pełnej jest włączenie grzebienia filtracyjnego do czerwonych krwinek (RBC), który mechanicznie filtruje krwinki czerwone przed wejściem do kanału migracyjnego urządzenia. Prawe zwoje tego grzebienia filtracyjnego zapobiegają potrzebie filtracji wykluczającej rozmiar, która prawdopodobnie zostałaby zatkana przez erytrocyty, a tym samym blokuje gradient chemoatraktantu przed dotarciem do aktywnie migrujących neutrofili w WB. Włączenie urządzenia mikroprzepływowego do krwi pełnej w 12- lub 24-dołkowej płytce ułatwia jednoczesne badanie przesiewowe wielu mediatorów chemotaksji neutrofili ludzkich lub mysich.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Device Fabrication</td></tr><tr><td>SU-8</td><td>Microchem</td><td>Y131273</td><td></td></tr><tr><td>Polidimethylsiloxane (PDMS)</td><td>Ellsworth Adhesives</td><td>Sylgard 184 1,1 funta Zestaw</td><td></td></tr><tr><td>Standardowe prowadnice</td><td>szklane Fisher Scientific</td><td></td><td>125495 1 X 3 cale</td></tr><tr><td>Płyta ze szklanym dnem</td><td>MatTek</td><td>P12G-1.5-14-F</td><td></td></tr><tr><td>Harris Uni-Core, średnica końcówki 5,0 mm</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>15081</td><td></td></tr><tr><td>- Harris Uni-Core - Średnica końcówki 1,5 mm</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>15072</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Przygotowanie i analiza testów mikroprzepływowych</td></tr><tr><td>Końcówka do pipety ładującej żel</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-139</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka</td><td>Fisher Scientfic</td><td>309602</td><td></td></tr><tr><td>Igła z końcówką, 30 G &frac12; in.</td><td>Brico Medical Supply</td><td>BN3005</td><td></td></tr><tr><td>Vacutainer, Heparyna</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy ludzkiej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5843-5G</td><td>0,2% stężenie końcowe w HBSS</td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0895-1MG</td><td></td></tr><tr><td>fMLP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3506-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Nakłuwacz bezpieczny SurgiLance, głębokość 2,2 mm, 22 G</td><td></td><td>SLN240</td><td></td></tr><tr><td>Hoescht stain</td><td>Life Technologies</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Positive Control</td></tr><tr><td>HetaSep</td><td>STEMCELL Technologies Inc.</td><td>7906</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do wzbogacania ludzkich neutrofili EasySep STEMCELL</td><td>Technologies Inc.</td><td>19257</td><td></td></tr><tr><td>Plasma Asher</td><td>March Instruments</td><td>P-250</td><td></td></tr><tr><td>Lindberg/Blue M Piekarnik</td><td>Thermo Scientific</td><td>13-258-30C</td><td></td></tr><tr><td>Precyzyjna pęseta ze stali nierdzewnej</td><td>Narzędzie techniczne</td><td>758TW458</td><td></td></tr><tr><td>Bel-Art Scienceware Odporny na chemikalia eksykator próżniowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-594-15A Tabliczka</td><td></td></tr><tr><td>znamionowa Cyfrowa płyta grzejna</td>Mikroskop odwrócony <td>Alpha Multiservices</td><td>PMC 720</td><td></td></tr><tr><td>Nikon TiE</td><td>Nikon - Micro Video Instruments Inc.</td><td></td><td></td>MEA53100</tr><tr><td>CFI Plan Fluor DL 10X NA 15.2 wd Obiektyw</td><td>Nikon - Micro Video Instruments Inc.</td><td></td><td></td>MRH20101</tr><tr><td>Lumen 200 z 2-metrowym światłowodem do Nikon</td><td>Nikon - Micro Video Instruments Inc.</td><td>500-L200NI2</td><td></td></tr><tr><td>Wzbudnice wąskopasmowe DAPI/Hoechst/AMCA 32 mm - Emitery 25 mm</td><td>Chroma - Micro Video Instruments Inc.</td><td>31013v2</td><td></td></tr><tr><td>Chłodzona kamera CCD Retiga R 2000 1,600 x 1,200 pikseli</td><td>Qimaging - Micro Video Instruments Inc.</td><td>RET-2000R-F-M-12-C</td><td></td></tr></tbody></table>

platforma mikroprzepływowa do pomiaru chemotaksji neutrofili z nieprzetworzonej krwi pełnej

Microfluidic Platform for Measuring Neutrophil Chemotaxis from Unprocessed Whole Blood

Neutrofile odgrywają istotną rolę w ochronie przed infekcjami, a ich liczba we krwi jest często mierzona w klinice. Wyższa liczba granulocytów obojętnochłonnych we krwi jest zwykle wskaźnikiem trwających infekcji, podczas gdy niska liczba neutrofili jest znakiem ostrzegawczym dla większego ryzyka infekcji. Aby spełniać swoje funkcje, neutrofile muszą również być w stanie skutecznie przemieszczać się z krwi, w której spędzają większość swojego życia, do tkanek, w których dochodzi do infekcji. W związku z tym wszelkie defekty w zdolności neutrofili do migracji mogą zwiększać ryzyko infekcji, nawet jeśli neutrofile są obecne we krwi w odpowiedniej liczbie. Jednak pomiar zdolności migracji neutrofili w klinice jest trudnym zadaniem, które jest czasochłonne, wymaga dużej objętości krwi i wiedzy specjalistycznej. Aby rozwiązać te problemy, zaprojektowaliśmy solidne testy mikroprzepływowe do migracji neutrofili, które wymagają pojedynczej kropli nieprzetworzonej krwi, omijają potrzebę separacji neutrofili i są łatwe do ilościowego określenia pod prostym mikroskopem. W tym teście neutrofile migrują bezpośrednio z kropelki krwi, małymi kanałami, w kierunku źródła chemoatraktantu. Aby zapobiec ziarnistemu przepływowi czerwonych krwinek przez te same kanały, zastosowaliśmy filtry mechaniczne ze zwojami pod kątem prostym, które selektywnie blokują postęp czerwonych krwinek. Zwalidowaliśmy test, porównując migrację neutrofili z kropelek krwi pobranych z nakłucia palca i krwi żylnej. Porównaliśmy również te źródła krwi pełnej (WB) z migracją neutrofili z próbek oczyszczonych neutrofili i stwierdziliśmy stałą prędkość i kierunkowość między trzema źródłami. Ta platforma mikroprzepływowa umożliwi badanie migracji neutrofili u ludzi w warunkach klinicznych i badawczych, aby pomóc w lepszym zrozumieniu funkcji neutrofili w zdrowiu i chorobie.

Test chemotaksji neutrofili w krwi pełnej (WB) został zwalidowany poprzez pomiar akumulacji neutrofili w kierunku gradientu fMLP (Movie S1). Wyniki potwierdzają, że erytrocy są zatrzymywane przez grzebień filtracyjny, podczas gdy neutrofile (kolor niebieski) są w stanie aktywnie migrować z krwi pełnej (Rycina 3A oraz Movie S1). Stabilny liniowy gradient chemoatraktanta (kolor zielony) utworzony przez mikroprzepływowe urządzenie do krwi pełnej został potwierdzony przy uży...

Ten protokół szczegółowo opisuje test przeznaczony do pomiaru chemotaksji ludzkich neutrofili z jednej kropli krwi pełnej z solidną powtarzalnością. Takie podejście pozwala obejść potrzebę separacji neutrofili i wymaga tylko kilku minut czasu na przygotowanie testu. Chip mikroprzepływowy umożliwia wielokrotny pomiar chemotaksji neutrofili w czasie u niemowląt lub małych ssaków, gdzie objętość próbki jest ograniczona.

Platforma mikroprzepływowa do pomiaru chemotaksji neutrofili z nieprzetworzonej krwi pełnej

Neutrophils play an essential role in protection against infections and their numbers in the blood are frequently measured in the clinic. Higher ...

Niniejsza technologia mikroprzepływowa ma na celu pomiar funkcjonalności ludzkich neutrofilów bezpośrednio z jednej kropli krwi na platformie, która może być wykorzystana do analiz wieloparametrowych. Centralna komora załadowcza służy jako źródło krwi pełnej oraz pełni rolę ujścia dla gradientów chemoatraktantów, które tworzą się w 16 ogniskowych komorach chemotaktycznych. Unikalna mechaniczna filtracja erytrocytów umożliwia badanie funkcji neutrofilów w naturalnym kontekście komponentów krwi, komórkowych i biochemicznych.Rozwidlenie między kanałem prowadzącym do ogniskowej komory chemotaktycznej a kanałem wyjściowym urządzenia pozwala na ilościowe określenie i modulację kierunkowości migrujących neutrofili. W ten sposób wyniki mogą wykazać, że aktywnie migrujące neutrofile z łatwością omijają uwięzione erytrocyty i z czasem gromadzą się w zwiększonej liczbie. Jedną z wyjątkowych cech naszych urządzeń mikroprzepływowych jest to, że są one bardzo łatwe w produkcji i konfiguracji.Składają się one z warstwy PDMS odlewanej na mikrofabrykowanej płytce, którą przytwierdzamy do szklanego dna płytki jednodobowej lub wielodobowej. Główną zaletą tej techniki jest to, że wymaga ona jedynie kropli krwi pełnej. Urządzenia te mogą być używane ze standardowymi pipetami, nie posiadają ruchomych części oraz nie wymagają zastosowania rurek ani zewnętrznych pomp strzykawkowych.Wnioski płynące z zastosowania tej techniki mają szersze implikacje kliniczne w porównaniu z wymaganiami tradycyjnych metod. Nasze podejście skraca czas od momentu pobrania krwi do przeprowadzenia testów migracji neutrofili do zaledwie kilku minut. Nowoczesne grzebienie filtrujące erytrocy zapobiegają blokowaniu aktywnej migracji neutrofili przez RBC, co odróżnia tę metodę od innych technik mikroprzepływowych.Wymaga to usunięcia krwi przed wykonaniem analiz chemiotaktycznych. Mechaniczne blokowanie erytrocytów i kanałów wyróżnia naszą technologię i umożliwia badanie neutrofili w fizjologicznym środowisku krwi pełnej, w tym surowicy i płytek krwi. Dzięki temu technologia jest precyzyjna i łatwa w obsłudze, co może znacząco poszerzyć naszą wiedzę na temat roli neutrofili oraz wrodzonego układu odpornościowego w zdrowiu i chorobach.Wykonaj wafelek matrycy głównej w celu zdefiniowania kanałów migracyjnych zgodnie z instrukcjami producenta First pattern. Pierwsza warstwa negatywowego fotorezystu epoksydowego o grubości trzech mikronów, a następnie wzoruj drugą warstwę o grubości 50 mikronów, aby zdefiniować komory załadunkowe komórek i komory chemokin. Następnie, aby odlać urządzenia z polidimetylosiloksanu, energicznie mieszaj 20 g PDMS z dwiema gramami inicjatora przez pięć minut.Ostrożnie wlej PDMS na wzorowany wafer i odgazuj w deskryptywie próżniowym przez jedną godzinę. Następnie wypiecz i utwardź mikroprzepływowe urządzenia z PDMS w piekarniku o temperaturze 65 °C przez co najmniej trzy godziny. Aby upewnić się, że PDMS jest wypiekany w odpowiedniej temperaturze, należy monitorować wewnętrzną temperaturę piekarnika za pomocą termometru.Wybij centralne komory do ładowania krwi pełnej o średnicy 1,5 mm. Wybij również całe urządzenia w kształcie pierścienia o średnicy 5,0 mm. Usuń cząstki z urządzeń pierścieniowatych za pomocą taśmy klejącej.Następnie wypłucz płytkę wielodołkową wodą dejonizowaną i osusz azotem po umieszczeniu płytki w piekarniku w temperaturze 60 °C przez pięć minut. Przeprowadź obróbkę plazmą tlenową przez 35 sekund. Następnie dodaj urządzenia typu donut oraz plazmę tlenową.Poddaj ponownej obróbce przez kolejne 35 sekund. Ostrożnie przenieś urządzenia do dołków płytki i wygrzewaj z połączonymi urządzeniami na płycie grzejnej o temperaturze 80 °C przez 10 minut. Po obróbce plazmą tlenową urządzenie staje się hydrofilowe, a efekty kapilarne mogą wspomóc napełnianie małych kanałów w urządzeniu.Aby przygotować roztwór chemoatraktanta, zmieszaj 5 µL 10 µM FMLP z 5 µL fibronektyny w stężeniu 1 mg/mL oraz 490 µL HBSS. Powoli nawiń roztwór chemoatraktanta do pipety komory do ładowania krwi pełnej, a następnie nanieś dodatkowe 20 µL chemoatraktanta wokół zewnętrznej części urządzenia. Umieść płytkę w eksykatorze na 15 minut.Zastosuj podciśnienie w urządzeniu, aby nasycić je roztworem chemoatraktanta. Wyjmij płytkę z deskryktora i potwierdź zwilżenie kanału urządzenia, obserwując stopniowe zmniejszanie się pęcherzyka powietrza. Następnie dokładnie wypłucz komorę do załadunku krwi pełnej oraz zewnętrzną stronę urządzenia, aby usunąć nadmiar roztworu chemoatraktanta.Następnie należy wytworzyć gradient chemoatraktanta z każdej z ogniskowych komór chemotaktycznych do centrum urządzenia. Ostrożnie wstrzyknij 100 µL PBS do otworu, tak aby na górze urządzenia utworzyła się kropla PBS. Przechyl płytkę i pipetuj 1 mL PBS wokół urządzenia, aby zebrać go na dnie dołka, następnie odessać ciecz i powtórzyć przemywanie PBS trzy razy.Następnie napełnij każdą studzienkę pożywką, aby zanurzyć urządzenia, i odczekaj 15 minut, aż gradient się ustabilizuje. Następnie powoli pipetuj 2 µL krwi pełnej do każdej komory ładowania krwi pełnej. W przypadku pobierania krwi z nakłucia palca, umyj ręce mydłem i wodą.Osusz skórę jako roztwór barwiący przeciwkrzepliwy. Dodaj 1 mL 0,2% HSA oraz 10 µL 32,4 µM hooks. Do probówki do pobierania krwi z heparyną nakłuj palec zdrowego dawcy i wytrzyj pierwszą kroplę krwi.Pobrać 50 µL krwi do roztworu barwiącego z antykoagulantem i delikatnie wymieszać. Ustawić biokomorę na 37 °C, 80% wilgotności i 5% CO2. Natychmiast rozpocząć obrazowanie time-lapse przy powiększeniu 10x lub większym; w celu przeprowadzenia istotnej analizy statystycznej ręcznie śledzić co najmniej 50 neutrofili w każdej próbce.Policz komórki wnikające do komór chemotaksji ogniskowej w czasie. Następnie, korzystając z programu ImageJ, oblicz prędkości neutrofili w kanale pomiędzy WBLC a FCC. Aby określić kierunkowość neutrofili, policz liczbę komórek, które mijają rozgałęzienie, i oblicz stosunek liczby komórek skręcających w stronę komór chemotaksji ogniskowej do liczby komórek opuszczających urządzenie.Komórki, które nie wykazują kierunkowości, nie podążają za gradientem chemotaktycznym, w związku z czym migrują w równych liczbach w stronę FCC oraz kanału wylotowego. W niniejszym doświadczeniu test chemotaksji neutrofili z krwi pełnej został zwalidowany poprzez pomiar gromadzenia się neutrofili w kierunku gradientu FMLP. Wyniki potwierdzają, że erytrocyty są zatrzymywane przez grzebień filtrujący, podczas gdy neutrofile są w stanie aktywnie migrować z krwi pełnej.Stabilny liniowy gradient chemoatraktanta utworzony przez mikrofluidyczne urządzenie do krwi pełnej został potwierdzony przy użyciu dekstranu znakowanego FSE, a poziomy fluorescencji mierzono w czasie. Wyniki uzyskane za pomocą nowej platformy WB Chemotaxis wykazują, że neutrofile ze wszystkich źródeł krwi migrują z powtarzalną prędkością i przy podobnej całkowitej liczbie komórek migrujących. Co istotne, system ten pozwala na kwantyfikację neutrofili, dzięki czemu odróżnia chemotaksję od chemokinezy. Po opanowaniu techniki, przy jej prawidłowym wykonaniu, procedura ta zajmuje mniej niż 10 minut.Wbudowanie naszego urządzenia w płytkę 12- lub 24-dołkową przy użyciu standardowych technik i zaplecza czystego pomieszczenia umożliwia jednoczesne przesiewanie wielu warunków. Dzięki zastosowaniu tej techniki jesteśmy w stanie mierzyć prędkość i kierunkowość neutrofili na poziomie pojedynczych komórek. W przeciwieństwie do tradycyjnych metod, które mierzą końcową migrację populacyjną komórek, należy pamiętać o dokładnym przygotowaniu urządzenia mikroprzepływowego oraz powolnym ładowaniu obu próbek, aby erytrocycie nie zostały przepchnięte poza obszar roboczy urządzenia.Opisany protokół jest szczególnie użyteczny do pomiaru przejściowych niedoborów chemotaktycznych neutrofili, umożliwiając wielokrotne pobieranie próbek w wielu punktach czasowych, lecz może zostać również dostosowany do pomiaru migracji innych typów komórek z różnych organizmów modelowych. Metoda ta może dostarczyć informacji na temat tymczasowych zmian funkcjonalności neutrofili u pacjentów z różnymi schorzeniami wiążącymi się z wyższą zapadalnością na infekcje, w tym u pacjentów po urazach, pacjentów po rozległych operacjach oraz pacjentów onkologicznych otrzymujących chemioterapię.

microfluidic-platform-for-measuring-neutrophil-chemotaxis-from

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Platforma mikrofluidyczna do pomiaru chemotaksji neutrofili z nieprzetworzonej pełnej krwi

Niniejszy protokół opisuje opracowanie urządzenia mikroprzepływowego do badania chemotaksji bakteryjnej w stabilnych gradientach stężeń chemoefektorów.

Urządzenie mikroprzepływowe do ilościowego oznaczania chemotaksji bakteryjnej w stabilnych gradientach stężeń

Opisujemy protokół mikroskopii intravitalnej w świetle jasnym do pomiaru dynamicznych oddziaływań między neutrofilami a komórkami śródbłonka podczas rekrutacji neutrofili w odpowiedzi na źródło chemoatraktanta dla neutrofili in vivo. Pełzanie neutrofili wewnątrz naczyniowych, migracja transendotelialna oraz chemotaksja w tkance mięśnia kroczo ścięgnistego myszy są wizualizowane za pomocą fotografii wideo z odstępami czasu i śledzone przy użyciu programu ImageJ.

Śledzenie pełzania wewnątrznaczyniowego, migracji transendotelialnej i chemotaksji neutrofili w tkankach za pomocą intravitalnej wideomikroskopii

Ten film demonstruje test chemotaksji neutrofili przy użyciu metody all-on-chip. Metoda ta pozwala na bezpośrednią izolację neutrofili z krwi pełnej poprzez immunomagnetyczną selekcję ujemną, a następnie test chemotaksji na chipie mikroprzepływowym.

Mikroprzepływowa metoda oparta na chipie do szybkiej analizy chemotaksji neutrofili przy użyciu krwi pełnej

Przyleganie neutrofili do aktywowanego śródbłonka w miejscach infekcji jest integralnym składnikiem odpowiedzi zapalnej gospodarza. W niniejszym raporcie opisano test wiązania neutrofili, który pozwala na ilościowe określenie in vitro pierwotnego wiązania ludzkich neutrofili z komórkami śródbłonka aktywowanymi przez mediatory stanu zapalnego w warunkach statycznych.

Ilościowy test in vitro do pomiaru adhezji neutrofili do aktywowanych pierwotnych ludzkich komórek śródbłonka mikronaczyniowego w warunkach statycznych

Leukocyty przenikają przez monowarstwę śródbłonka drogą parakomórkową lub transkomórkową. Opracowaliśmy prosty test do śledzenia rozkładu endogennej złączowej VE-kadheryny i PECAM-1 podczas transśródbłonkowej migracji leukocytów pod przepływem fizjologicznym, aby rozróżnić dwie drogi transmigracji.

Obrazowanie w czasie rzeczywistym połączeń komórka-komórka śródbłonka podczas transmigracji neutrofili pod wpływem przepływu fizjologicznego

Wizualne testy chemotaksji są niezbędne do lepszego zrozumienia, w jaki sposób komórki eukariotyczne kontrolują kierunkową migrację komórek za pośrednictwem chemoatraktantu. W tym miejscu opisujemy szczegółowe metody dla: 1) monitorowania w czasie rzeczywistym w wysokiej rozdzielczości wielu testów chemotaksji oraz 2) jednoczesnej wizualizacji gradientu chemoatraktantu i czasoprzestrzennej dynamiki zdarzeń sygnalizacyjnych w neutrofilopodobnych komórkach HL60.

Obrazowanie chemotaksji sprzężonej z białkiem G i jej zdarzeń sygnalizacyjnych w neutrofilowych komórkach HL60

Ten artykuł przedstawia szczegółową metodę przeprowadzania szybkiego testu chemotaksji neutrofili poprzez integrację wbudowanej izolacji neutrofili z krwi pełnej oraz testu chemotaksji na pojedynczym chipie mikroprzepływowym.

Kompleksowa metoda do szybkiej analizy chemotaksji neutrofili bezpośrednio z kropli krwi

Protokoły ilościowej oceny chemotaksji i migracji limfocytów są ważnymi narzędziami do badań immunologicznych. Opisano w nim protokół in vitro, który umożliwia multipleksowaną ocenę migracji komórek w czasie rzeczywistym, a także komplementarną technikę in vivo umożliwiającą śledzenie komórek natywnych do śledziony.

Kwantyfikacja chemotaksji ludzkich monocytów in vitro i handlu mysimi limfocytami in vivo

W tym badaniu demonstrujemy metodę separacji neutrofili bez znaczników z klinicznych wydzielin dróg oddechowych przy użyciu zamkniętej pętli spiralnej inercyjnej mikrofluidyki. Proponowana metoda rozszerzyłaby kliniczne testy in vitro dla różnych chorób układu oddechowego.

Bezznacznikowe wzbogacanie neutrofili z wydzielania przez pacjenta z dróg oddechowych przy użyciu mikrofluidyki inercyjnej w pętli zamkniętej

Ten protokół generuje mikromatryce biocząstek, które zapewniają przestrzennie kontrolowane rojenie neutrofili. Zapewnia łatwy dostęp do mediatorów, które uwalniają neutrofile podczas migracji i pozwala na ilościową analizę obrazową.

Mikromacierze biocząstek do chemotaktycznej i molekularnej analizy roju ludzkich neutrofili in vitro

W tym protokole, do badania interakcji między komórkami leukocytów w chorobie zapalnej stosuje się biomimetyczne badanie mikropłynów, które może odtworzyć fizjologicznie istotne środowisko mikrokrążenia i odtworzyć całą kaskadę adhezji/migracji leukocytów.

System mikrofizjologiczny do badania interakcji między leukocytami a komórkami śródbłonka podczas stanu zapalnego

Poznaj mikroprzepływową platformę do pomiaru chemotaksji neutrofili z nieprzetworzonej krwi pełnej. Ta metoda umożliwia szybką, ilościową analizę migracji komórek bez konieczności ich izolacji.

Platforma mikroprzepływowa do pomiaru chemotaksji neutrofili z nieprzetworzonej krwi pełnej

Przeglądaj więcej filmów