Name: Gradientowe urządzenie mikroprzepływowe do biologii komórki (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-08-30T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 5 s
Description: Poznaj mikrofabrykację gradientowego urządzenia mikroprzepływowego do badań migracji komórek i procesów biologicznych. Protokół obejmuje obróbkę PDMS, plazmę tlenową oraz generowanie gradientów chemicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

A. Mikrofabrykacja mikrofluidycznego urządzenia do generowania gradientu
<ol>
<li>Podłoże krzemowe (Si) poddaje się działaniu reaktywnej plazmy tlenowej (5 min przy 30W, Harrick Scientific, NY).</li>
<li>Negatywowy fotorezyst (SU-8 50, Microchem, MA) nanosi się metodą spin-coatingu na podłoże Si przy 1000 rpm przez 1 min.</li>
<li>Podłoże poddaje się wstępnemu wygrzewaniu (soft bake) na płycie grzewczej w temperaturze 65°C przez 10 min, a następnie w 95°C przez 30 min.</li>
<li>Podłoże naświetla się światłem UV (200W) przez 3 min przez maskę z przezroczystej folii o minimalnym rozmiarze wzoru 30 µm.</li>
<li>Podłoże poddaje się wygrzewaniu po naświetlaniu (post bake) w temperaturze 65°C przez 1 min oraz 95°C przez 10 min.</li>
<li>Krzemowa forma matrycowa z kanałami o grubości 100 µm jest wywoływana przy użyciu wywoływacza do fotorezystu SU-8.</li>
<li>Podłoże zawierające mikrokanały umieszcza się w szalce Petriego.</li>
<li>Formy z polidimetylosiloksanu (PDMS) (Sylgard 184) wykonuje się poprzez zmieszanie elastomeru silikonowego z utwardzaczem (stosunek 10:1).</li>
<li>Mieszaninę PDMS wlewa się na krzemową formę matrycową.</li>
<li>Krzemową formę matrycową umieszcza się w desykatorze próżniowym na 10 min w celu usunięcia pęcherzyków powietrza.</li>
<li>PDMS utwardza się w temperaturze 70°C przez 1~2 godziny.</li>
<li>Formy PDMS odkleja się od krzemowej formy matrycowej.</li>
</ol>
B. Układ eksperymentalny
<ol>
<li>Wloty i wyloty dla komórek oraz wloty infuzyjne urządzenia mikrofluidycznego opartego na PDMS są przygotowywane za pomocą ostrych wycinaków.</li>
<li>Urządzenie i szkiełko przedmiotowe (2×3 cale) są nieodwracalnie łączone za pomocą reaktywnej plazmy tlenowej (5 min przy 30W, Harrick Scientific, NY).</li>
<li>Rurki polietylenowe (PE 20, Becton Dickinon, MD) są wprowadzane do wlotów infuzyjnych urządzenia mikrofluidycznego, a następnie podłączane do pompy strzykawkowej.</li>
<li>Dekstran znakowany izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC)-dextran (MW=10kD, 10 µM, Sigma) oraz bufor (PBS, Invitrogen, CA) są wprowadzane do urządzenia mikrofluidycznego w celu potwierdzenia stabilności gradientów wewnątrz układu.</li>
<li>Wnętrze urządzenia mikrofluidycznego jest powlekane macierzą zewnątrzkomórkową (ECM) (tj. fibronektyną) przez 1 godzinę w inkubatorze (37°C).</li>
<li>Komórki fibroblastów NIH 3T3 są trypsynizowane i dysocjowane.</li>
<li>Dysocjowane komórki są wprowadzane do urządzenia mikrofluidycznego (szerokość 800 µm) przy gęstości komórek 2×106 komórek/ml.</li>
<li>2 ml pożywki oraz 50 ng/ml czynnika wzrostu naskórka (EGF) są wprowadzane do urządzenia mikrofluidycznego za pomocą pompy strzykawkowej (0,05 µl/min) w celu wytworzenia gradientów rozpuszczalnych.</li>
<li>Komórki są monitorowane w czasie rzeczywistym co 5 min przy użyciu mikroskopu odwróconego (Nikon TE 2000).</li>
</ol>
&nbsp;

<ol><li>Jeon, N. L., Baskaran, H., Dertinger, S. K. W., Whitesides, G. M., Van de Water, L., Toner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+chemotaxis+in+linear+and+complex+gradients+of+interleukin-8+formed+in+a+microfabricated+device%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Neutrophil chemotaxis in linear and complex gradients of interleukin-8 formed in a microfabricated device.</a> Nat. Biotechnol. 20, 826-830 (2002).</li>
<li>Lin, F., Nguyen, C. M., Wang, S. J., Saadi, W., Gross, S. P., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+neutrophil+chemotaxis+is+strongly+influenced+by+mean+IL-8+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Effective neutrophil chemotaxis is strongly influenced by mean IL-8 concentration.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 319, 576-581 (2004).</li>
<li>Chung, B. G., Flanagan, L. A., Rhee, S. W., Schwartz, P. H., Lee, A. P., Monuki, E. S., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+neural+stem+cell+growth+and+differentiation+in+a+gradient-generating+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Human neural stem cell growth and differentiation in a gradient-generating microfluidic device.</a> Lab Chip. 5, 401-406 (2005).</li>
<li>Saadi, W., Wang, S. J., Lin, F., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+parallel-gradient+microfluidic+chamber+for+quantitative+analysis+of+breast+cancer+cell+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Microdevices%22%5BJournal%5D)">A parallel-gradient microfluidic chamber for quantitative analysis of breast cancer cell chemotaxis.</a> Biomed. Microdevices. 8, 109-118 (2007).</li>
<li>Chung, B. G., Park, J. W., Hu, J. S., Huang, C., Monuki, E. S., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hybrid+microfluidic-vacuum+device+for+interfacing+with+conventional+cell+culture+platform%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A hybrid microfluidic-vacuum device for interfacing with conventional cell culture platform.</a> BMC Biotechnol. 7, (2007).</li>
</ol>

Komórki poddane działaniu stabilnych gradientów stężeń EGF w urządzeniu mikroprzepływowym migrowały w stronę wyższych stężeń. Kierunkowość migracji komórek, indeks chemotaktyczny oraz ruchliwość migrujących komórek zostały zbadane za pomocą analizy śledzenia komórek. W związku z tym ta mikroprzepływowa platforma do generowania gradientów może być użyteczna w badaniach nad przerzutowaniem nowotworów, embriogenezą oraz prowadzeniem aksonów.

<table><tbody><tr><td>dekstran-FITC</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FD10S</td><td>dekstran (10kD) znakowany izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC)</td></tr><tr><td>hr-EGF</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>13247-051</td><td>rekombinowany ludzki czynnik wzrostu naskórka </td></tr><tr><td>PDMS</td><td></td><td>K.R. Anderson Co.</td><td>2065622</td><td>Poli(dimetylosiloksan) (PDMS), Dow Corning Sylgard 184 (8,6 lb)</td></tr><tr><td>Negatywowy fotorezyst </td><td></td><td>MicroChem Corp.</td><td>SU-8 50</td><td></td></tr><tr><td>wafer krzemowy</td><td></td><td></td><td></td><td>wafer krzemowy, 4 cale</td></tr><tr><td>Szalki Petriego</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rurki polietylenowe </td><td></td><td>BD Biosciences</td><td>PE 20</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fibonektyna</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NIH 3T3 </td><td>linia komórkowa</td><td></td><td></td><td>komórki fibroblastów</td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony</td><td></td><td>Nikon Instruments</td><td>TE 2000</td><td></td></tr></tbody></table>

mikroprzepływowe urządzenie do generowania gradientów w biologii komórki

A Gradient-generating Microfluidic Device for Cell Biology

Opisano wykonanie i działanie mikroprzepływowego urządzenia do generowania gradientów, służącego do badania zachowania komórek. Platforma mikroprzepływowa jest pomocnym narzędziem eksperymentalnym, ponieważ pozwala na precyzyjne manipulowanie przepływami płynów, umożliwia przeprowadzanie eksperymentów wysokoprzepustowych oraz generowanie stabilnych gradientów stężeń substancji rozpuszczalnych. W porównaniu z konwencjonalnymi generatorami gradientów, urządzenia mikroprzepływowe oparte na poli(dimetylosiloksanie) (PDMS) mogą generować stabilne gradienty stężeń czynników wzrostu o ściśle określonych profilach. W niniejszej pracy opracowano proste mikroprzepływowe urządzenia do generowania gradientów z trzema oddzielnymi wlotami. Trzy mikrokanały łączą się w jeden mikrokanał w celu wytworzenia gradientów stężeń. Stabilność i kształt gradientów czynników wzrostu potwierdzono za pomocą dekstranu znakowanego izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC) o masie cząsteczkowej zbliżonej do epidermalnego czynnika wzrostu (EGF). Wykorzystując to urządzenie mikroprzepływowe, wykazano, że fibroblasty poddane działaniu gradientów stężeń EGF migrowały w kierunku wyższych stężeń. Kierunkowość migracji komórek oraz ruchliwość migrujących komórek oceniono ilościowo za pomocą analizy śledzenia komórek. Tym samym to mikroprzepływowe urządzenie do generowania gradientów może być przydatne do badania i analizy zachowania migrujących komórek.

Opisujemy protokół mikrofabrykacji mikroprzepływowego urządzenia do generowania gradientów, które umożliwia tworzenie przestrzennych i czasowych gradientów w ściśle określonym mikrośrodowisku. W tym podejściu mikroprzepływowe urządzenie do generowania gradientów może być wykorzystane do badania kierunkowej migracji komórek, embriogenezy, gojenia ran oraz przerzutów nowotworowych.

Mikroprzepływowe urządzenie do generowania gradientów w biologii komórki

Opisano wykonanie i działanie mikrofluidycznego urządzenia do generowania gradientu, służącego do badania zachowania komórek. Platforma mikrofluidyczna jest...

Nazywam się Jiang. Jestem stypendystą w ramach programu posterowego w Harvard and MIT Health, science and Technology. a ja nazywam się Amir Manchi i jestem studentem studiów licencjackich w laboratorium profesora ha SANE w Harvard, MIT, division of Health Sciences and Technology.Ten slajd przedstawia schemat procesu wykonania urządzenia: najpierw na powierzchnię silikonu naniesiono warstwę SU-8 metodą spin coatingu, następnie na wierzch nałożono maskę, po czym przeprowadzono ekspozycję na promieniowanie UV i wywołanie. W ten sposób uzyskaliśmy elektrody na powierzchni silikonu. Następnie odlano PDMS, który po utwardzeniu i wypalaniu został poddany niewielkiemu przebiciu, a następnie złączono urządzenie z PDMS z podłożem szklanym za pomocą plazmy tlenowej.Znajdujemy się teraz w pracowni mikrofabrykacji w laboratorium i zaczniemy od przygotowania warstw PDMS. Przez PDMS rozumiem polidimetylosiloksan, który jest polimerem organicznym. Jest to najszerzej stosowany organiczny polimer na bazie krzemu.W rzeczywistości jest to mieszanina dwóch różnych składników: bazy elastomeru silikonowego oraz utwardzacza elastomeru silikonowego. Stosunek wynosi 10 części bazy do jednej części utwardzac

a-gradient-generating-microfluidic-device-for-cell-biology

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Urządzenie mikrofluidyczne do generowania gradientu w biologii komórki

Opisujemy protokół wytwarzania urządzeń mikrofluidycznych, które umożliwiają wychwytywanie i hodowlę komórek. W tym podejściu wykorzystuje się ustrukturyzowane mikrostruktury, takie jak rowki wewnątrz kanałów mikrofluidycznych, aby stworzyć obszary o niskim naprężeniu ścinającym, w których komórki mogą zostać unieruchomione.

Urządzenie mikrofluidyczne z wzorami rowków do badania zachowania komórek

Niniejszy protokół opisuje opracowanie urządzenia mikroprzepływowego do badania chemotaksji bakteryjnej w stabilnych gradientach stężeń chemoefektorów.

Urządzenie mikroprzepływowe do ilościowego oznaczania chemotaksji bakteryjnej w stabilnych gradientach stężeń

Przedstawiamy prostą metodę wytwarzania urządzeń mikrofluidycznych zdolnych do stosowania podobnych warunków dynamicznych w odniesieniu do wielu odrębnych szczepów, bez konieczności korzystania z pomieszczeń typu clean room lub litografii miękkiej.

Urządzenie mikroprzepływowe do badania wielu odrębnych szczepów

Opisano metodę montażu adhezyjnych i rozpuszczalnych gradientów w komorze mikroskopowej do badań migracji żywych komórek. Zaprojektowane środowisko łączy powierzchnie przeciwporostowe i ścieżki adhezyjne z gradientami roztworu, a tym samym pozwala określić względne znaczenie wskazówek naprowadzających.

Tworzenie adhezyjnych i rozpuszczalnych gradientów do obrazowania migracji komórek za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Ten artykuł przedstawia proste podejście do dostarczania nieciągłych gradientowych naprężeń statycznych na koncentrycznym hydrożelu wypełnionym komórkami w celu regulacji wyrównania komórek w inżynierii tkankowej.

Gradient Strain Chip do stymulowania zachowań komórkowych w hydrożelu z komórkami

Ten protokół szczegółowo opisuje konfigurowalną metodę pomiaru migracji komórek w odpowiedzi na chemoatraktanty, które mogą być również użyte do określenia szybkości dyfuzji leku z matrycy polimerowej.

Konfigurowalna komora do pomiaru migracji komórek

Kontrola gradientów chemicznych i tlenu jest niezbędna dla hodowli komórkowych. W artykule opisano urządzenie mikroprzepływowe z polidimetylosiloksanu i poliwęglanu (PDMS-PC) zdolne do niezawodnego generowania kombinacji gradientów chemicznych i tlenowych do badań migracji komórek, które można praktycznie wykorzystać w laboratoriach biologicznych bez wyrafinowanego oprzyrządowania.

Urządzenia mikroprzepływowe z polidimetylosiloksanu i poliwęglanu do badań migracji komórek w prostopadłych gradientach chemicznych i tlenu

Prezentujemy mikroprzepływowy model raka na chipie, technologię "Akcelerator Ewolucji", która zapewnia kontrolowaną platformę do długoterminowych badań ilościowych dynamiki raka w czasie rzeczywistym w dobrze zdefiniowanych warunkach środowiskowych na poziomie pojedynczej komórki. Oczekuje się, że technologia ta sprawdzi się jako model in vitro do badań podstawowych lub przedklinicznego opracowywania leków.

Generowanie heterogenicznych gradientów leków w różnych populacjach nowotworów w akceleratorze ewolucji mikroprzepływowej do obserwacji w czasie rzeczywistym

Zbiorowa migracja komórek w procesie rozwoju, gojenia ran i przerzutów nowotworowych jest często kierowana przez gradienty czynników wzrostu lub cząsteczek sygnałowych. Opisano tutaj eksperymentalny system łączący mikroskopię trakcyjną z układem mikroprzepływowym oraz demonstrację sposobu ilościowego określania mechaniki migracji zbiorowej w warunkach gradientu biochemicznego.

Mikroskopia trakcyjna zintegrowana z mikrofluidyką do chemotaktycznej migracji zbiorowej

Ten protokół szczegółowo opisuje projekt i wykonanie urządzenia mikroprzepływowego odpowiedniego do badania mechaniki polimerów mikrotubul. Synteza technik mikrowytwarzania, zautomatyzowanej kontroli przepływu i modelowania obliczeniowego umożliwia stworzenie elastycznego systemu idealnie nadającego się do sondowania cytoszkieletu komórkowego in vitro.

Opracowanie opartego na mikrofluidyce podejścia do badania mechaniki polimerów mikrotubul

Poznaj mikrofabrykację gradientowego urządzenia mikroprzepływowego do badań migracji komórek i procesów biologicznych. Protokół obejmuje obróbkę PDMS, plazmę tlenową oraz generowanie gradientów chemicznych.

Mikroprzepływowe urządzenie do generowania gradientów w biologii komórki

Przeglądaj więcej filmów