Test gradientu temperatury: metoda badania preferencji temperatury u larw Drosophila

- Aby przetestować preferencję temperaturową larw Drosophila, utwórz gradient temperatury, podgrzewając jedną stronę aluminiowej płytki testowej i schładzając drugą. Aluminium ma wysoką przewodność cieplną, co oznacza, że ciepło jest efektywnie przenoszone, tworząc stabilny liniowy gradient temperatury. Po zrównoważeniu systemu zapisz temperatury na płytce w strefach temperaturowych tej samej wielkości, a następnie załaduj środek płytki czystymi larwami.

Zakryj cały system, aby wyeliminować zakłócenia spowodowane jasnym światłem i rozpocznij próbę. Larwy rozprzestrzeniają się w gradiencie, unikając stref awersyjnych, które są zbyt ciepłe lub zbyt zimne, i osiadają w strefach o korzystnych temperaturach. Takie zachowanie nazywa się termotaksją. Aby ocenić preferencje temperaturowe larw, zapisz liczbę zwierząt w każdej strefie temperaturowej.

W przykładowym protokole zobaczymy, jak ustawić jednokierunkowy gradient temperatury w zakresie od 18 do 28 stopni Celsjusza oraz jak obchodzi się z larwami podczas testu.

- Aby przygotować gradient jednokierunkowy, najpierw należy utworzyć wilgotne środowisko otoczenia dla testu. Umieść dwa aluminiowe klocki połączone z oddzielnymi kąpielami wodnymi na mokrych ręcznikach papierowych w odległości 10 centymetrów od siebie. Kąpiele wodne należy wcześniej rozgrzać. Następnie przygotuj 100 mililitrów 1% agarozy i dodaj 25 mililitrów do każdej płytki testowej na równej powierzchni. Gdy agaroza zastygnie, delikatnie przetrzyj powierzchnię gąbką melaminową, aby powierzchnia była lekko szorstka.

Następnie, aby zapewnić wydajny transfer temperatury, wypełnij wszelkie szczeliny między aluminiowymi blokami w płytkach testowych wodą dostarczaną z butelki z rozpylaczem. Teraz umieść płytki testowe na aluminiowych blokach i upewnij się, że rozgraniczenia znajdują się 2 centymetry od dowolnej krawędzi, aby dokładnie pasowały do krawędzi aluminiowych bloków.

Następnie spryskaj powierzchnię płytek warstwą wody, aby żele nie wyschły. Następnie przykryj system kartonowym pudełkiem, aby zmniejszyć parowanie i pomóc ustabilizować temperaturę powierzchni żelu. Odczekaj od 5 do 10 minut, aby temperatura się zrównoważyła. Następnie sprawdź temperaturę powierzchni na płycie w co najmniej 12 miejscach, aby upewnić się, że temperatura jest równomierna w całym tekście, podając lub odejmując 2 stopnie Celsjusza. Następnie załóż pokrywę pudełka do czasu wykonania testu.

Najpierw wyjmij karton z żelu i szybko sprawdź temperaturę powierzchni żelu. Jeśli powierzchnia jest sucha, spryskaj ją niewielką ilością wody. Jeśli żel jest dobry, załaduj od 100 do 200 larw na środek każdej płytki za pomocą małego pędzla. Następnie umieść pokrywkę na każdej płytce testowej, aby uwięzić larwy i przykryj zestaw kartonowym pudełkiem, aby zapobiec ekspozycji na światło. Test jest obecnie w toku.

Po 10 do 30 minutach wyjmij pudełko tekturowe i pokrywkę z mikropłytką. Następnie sfotografuj płytki z góry, aby zarejestrować położenie larw. Umieść pudełko nad aparatem, aby uniknąć odbicia na powierzchni żelu. Aby oczyścić płytkę, odessaj wszystkie larwy w miejscu, w którym mogły się rozproszyć.

Teraz oblicz procentowy rozkład larw w każdej strefie za pomocą oprogramowania do analizy obrazu. Wykonuj linie co 2 centymetry na podstawie rozgraniczeń na płytce testowej i policz liczbę larw w każdej strefie.

- Podczas liczenia ignoruj larwy rozmieszczone w regionach 0,5 centymetra od każdej krawędzi. Warunki grubości żelu i temperatury nie są jednakowe w pobliżu krawędzi.