Lokalne i globalne metody oceny nocycepcji termicznej u larw Drosophila

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest ocena nocycepcji termicznej u larw drozofili. Jest to realizowane poprzez pobranie larw drozofili, a następnie poddanie ich szkodliwym bodźcom termicznym. W opcjonalnym drugim kroku larwy mogą zostać poddane naświetlaniu promieniowaniem UV, co powoduje uszkodzenie tkanek i uwrażliwienie nocyceptywne termicznie. Następnie larwy można badać lokalnie za pomocą sondy grzewczej lub globalnie, stosując płytkę grzejną, aby wywołać reakcje nocyceptywne, które można zmierzyć ilościowo.

Sonda termiczna wykazuje, że larwy mają określny górny limit odpowiedzi nocyceptywnej na ciepło oraz zaskakującą zależność między temperaturą bodźca a amplitudą wywołanej odpowiedzi. Test z płytką grzewczą pokazuje, że larwy wykazują stereotypową sekwencję zachowań nocyceptywnych, które zależą od temperatury otaczającej wody i aktywności nocyceptywnych neuronów sensorycznych. Opisane tutaj metody mogą pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie nocycepcji termicznej, takie jak to, czy zwierzęta reagują inaczej na szkodliwe bodźce termiczne podawane lokalnie lub globalnie.

Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z testem sondy cieplnej napotykają trudności, ponieważ opanowanie tej metody wymaga praktyki w celu zminimalizowania różnic w nacisku, lokalizacji oraz kącie prowadzenia przykładanej sondy. Wizualna demonstracja testu płyty grzejnej jest kluczowa, gdyż zachowania wywoływane przez rosnącą temperaturę muszą zostać zaobserwowane, aby można było je w pełni ocenić. Aby uzyskać odpowiednią liczbę larw potomstwa o określonym genotypie, należy hodować pożądany szczep bezpośrednio lub przeprowadzić krzyżówki w butelkach z pożywką dla muszek, wykorzystując od 20 do 30 dziewiczych samic oraz od 15 do 20 samców. Pięć dni po złożeniu jaj należy zebrać i oczyścić wczesne larwy trzeciego stadium, usuwając miękką pożywkę i płucząc je pod delikatnym strumieniem bieżącej wody przez sito o rozmiarze oczek 630 micron. Następnie należy przenieść wczesne larwy trzeciego stadium na małą, wilgotną porcję pożywki, aby zapobiec głodowaniu i wysychaniu.

Po przygotowaniu komory anestezji, za pomocą pęsety lub pędzelka ostrożnie umieść 10 wczesnych larw trzeciego stadium wzdłuż wewnętrznej strony pokrywki i zamknij ją. Pracując w dygestorium, umieść komorę anestezji wewnątrz słoika łączącego, w którym znajduje się zlewka o pojemności 10 ml zawierająca kuleczkę waty nasączoną 1,5 ml eteru datylu. Zakręć nakrętkę słoika łączącego, aby poddać larwy działaniu oparów eteru przez okres od 2 do 2,5 minuty.

Po przeprowadzeniu znieczulenia wyjmij komorę do znieczulania z naczynia Coplana i odczekaj kilka sekund w dygestorium, aż rozproszą się pozostałości oparów eteru. Za pomocą butelki z wodą ostrożnie wypłucz larwy z komory do małej szalki Petriego. Osusz znieczulone larwy za pomocą bibuły, a następnie ostrożnie przymocuj je stroną grzbietową do góry do paska dwustronnej taśmy klejącej przyklejonej do szkiełka przedmiotowego o wymiarach trzech na jeden cal.

Umieść preparat na dolnej powierzchni komory naświetlania UV i naświetlaj larwy światłem UV przez sześć sekund przy intensywności 20 millijoules per centimeter squared. Po naświetlaniu zanurz preparat w wodzie, aby delikatnie oddzielić larwy od dwustronnej taśmy klejącej. Za pomocą pęsety lub pędzla delikatnie przenieś naświetlone larwy do naczynia o wymiarach 15 by 45 millimeter.

Szklana fiolka hodowlana o pojemności jednej dramy zawierająca jeden mililitr pożywki dla muszek, w której larwy powinny przebywać od 8 do 24 godzin w temperaturze 25°C lub pożądanej temperaturze hodowli przed ponownym przeniesieniem do gospodarza. W przypadku testów nocycepcji termicznej najpierw ustaw temperaturę sondy termicznej na pożądany punkt nastawy. Używając pędzla lub pęsety, ostrożnie przenieś pojedynczą larwę na płaską platformę, upewniając się, że larwa jest pokryta cienką warstwą wody.

Aby zminimalizować zmienność ciśnienia oraz zapewnić prawidłowe umieszczenie i kąt wprowadzenia sondy termicznej, niezbędna jest praktyka. Delikatnie przyciśnij końcówkę sondy do larwy na wysokości segmentu A4, wywierając lekki nacisk pod kątem około 45 stopni między sondą a powierzchnią larwy. Nacisk ten powinien spowodować niewielkie wgłębienie na powierzchni ciała larwy i zazwyczaj będzie wystarczający do zahamowania jej ruchu.

Kontynuuj stymulację larw aż do wystąpienia reakcji wycofania lub do osiągnięcia 22. limitu czasu. Larwy reagujące zazwyczaj wykazują najpierw wstępne zachowanie polegające na uniesieniu głowy i ogona, po którym następuje zachowanie wycofania w postaci obrócenia się o co najmniej 360 stopni. Po zainicjowaniu zachowania wycofania przerwij kontakt z sondą i zapisz latencję lub czas potrzebny na wycofanie.

Jeśli w ciągu 20 sekund nie zaobserwuje się zachowania wycofania, larwa jest uznawana za osobnika nieodpowiadającego. Ustaw światłowodowe przewodniki światła tak, aby zapewnić odpowiednie oświetlenie o wysokim kontraście. Aby obejrzeć larwy, umieść blok grzewczy w płycie grzewczej płaską powierzchnią do góry, a następnie ustaw płytę grzewczą na podstawie mikroskopu.

Włącz płytę grzejną na wysoką temperaturę i odczekaj około 15 minut, aż temperatura ustabilizuje się na poziomie 95 °C. Odmierz 80 µL wody destylowanej i za pomocą mikropipety nanieś kroplę wody na środek polistyrenowej szalki Petriego o wymiarach 60 by 15 mm. Używając pincety, ostrożnie umieść czystą larwę w połowie trzeciego stadium rozwojowego (L3) na środku kropli wody, wprowadzając jak najmniej dodatkowej wody.

Ostrożnie umieść szalkę Petriego na stałym bloku grzewczym na płycie grzejnej. Szybko skoryguj położenie szalki tak, aby cała larwa i kropla wody były widoczne. Uruchom stoper.

W tym momencie szalkę Petriego umieszcza się na stałym bloku grzejnym płyty grzewczej i zapisuje czas wystąpienia każdego zachowania. Po przeniesieniu larwy zanurzonej w wodzie na płytę grzewczą obserwuje się stereotypowe zachowania lokomocyjne. Normalne zachowanie w temperaturze pokojowej obejmuje lokomocję parasolową, której towarzyszą ruchy głowy charakterystyczne dla poszukiwania.

Następnie może wystąpić zachowanie polegające na gwałtownym rzucaniu głową, podczas którego larwa szybko porusza głową do przodu lub na boki. Ruch ten jest podobny do ich normalnego przemieszczania się w wodzie, jednak przebiega bardziej szarpanie i z uporczywym toczeniem się. Zachowanie to stwierdza się, gdy larwa wykona co najmniej pełny obrót o 360 stopni w płaszczyźnie bocznej.

Może to wystąpić dowolną liczbę razy i czasami obejmować niepełne obroty. W celu oceny tego zachowania należy liczyć wyłącznie pełne obroty o 360 stopni. Zachowanie to jest najbardziej zbliżone do sceny z lokalnym przykładaniem sondy termicznej podczas zachowania typu whip.

Larwa wykazuje szybkie ruchy skurczu i rozkurczu wzdłuż osi przednio-tylnej, które sprawiają, że głowa na bardzo krótką chwilę zbliża się do ogona. Ruchy smagania często obserwuje się w szybkim następstwie po sobie lub jednocześnie z toczeniem. Na koniec larwa wykazuje zachowanie drgawkowe, po którym często następuje paraliż. Podczas zachowania drgawkowego larwa wyciąga się wzdłuż osi przednio-tylnej i wykazuje wysoką częstotliwość drgań całego ciała.

Zachowanie drżące bez paraliżu zgięciowego występuje, gdy larwy przestają się poruszać. U niektórych larw stan ten jest trwały, podczas gdy inne wykazują następnie ruchy pulsacyjne o niskiej częstotliwości. Na tym wykresie procentowych odpowiedzi należących do każdej kategorii widoczny jest limit reakcji nocycepcyjnej larw na ciepło. W teście z sondą termiczną 100% larw wykazuje szybką odpowiedź aż do temperatury sondy 52 °C.

Jednak w temperaturze 54°C i wyższej 90% lub więcej larw nie reaguje nawet po 20 sekundach kontaktu. Choć larwy te nadal poruszają się po 22. odcięciu, można również zmierzyć i nanieść na wykres liczbę obrotów lub czas spędzony na zachowaniu wycofania w reakcji na niekorzystny bodziec. Co zaskakujące, wydaje się istnieć odwrotna zależność między temperaturą sondy a intensywnością odpowiedzi, ponieważ niższe temperatury zdają się wywoływać większą liczbę obrotów.

Po przeniesieniu larwy zanurzonej w wodzie na płytkę grzewczą obserwuje się pięć stereotypowych zachowań lokomozyjnych. Przedstawiono tutaj średnie czasy utajenia, przy których obserwuje się te zachowania, a także średnie temperatury kropli wody zmierzone dla każdego czasu utajenia w optymalnych warunkach testowych opisanych w niniejszej procedurze; odsetek larw wykazujących każde z tych odrębnych zachowań wynosił od 77 do 100%, choć sporadycznie zachowania toczenia i smagania są pomijane, nakładają się na siebie lub występują w odwrotnej kolejności. Przedstawiono tutaj odsetek larw, które przeżyły po wystąpieniu zachowania paraliżu w teście na płytce grzewczej. Larwy podgrzewano aż do wystąpienia paraliżu, a następnie przeniesiono do standardowych warunków hodowli w celu rekonwalescencji.

Larwy z grupy kontrolnej poddano analogicznym zabiegom z wyjątkiem ekspozycji na ciepło, a tworzenie PPE u żyjących osobników dorosłych ilościowo oceniano od siódmego do trzynastego dnia. W tym układzie MD G four napędza ekspresję transgenów regulowanych przez UAS we wszystkich czterech klasach wielodendrytycznych obwodowych neuronów sensorycznych. UAS or one delta C wykazuje zmodyfikowaną wersję kanału potasowego typu open rectifier u drosophila, niezbędną do przekazywania sygnałów synaptycznych, natomiast UAS orrc one delta NC wykazuje dalszą wersję modyfikowaną tego samego kanału, która nie zakłóca transmisji synaptycznej.

Należy zauważyć, że tylko larwy posiadające zarówno driver MD GALF, jak i transgen UAS ORC delta C wykazują zwiększone opóźnienia w czterech z pięciu obserwowanych zachowań. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak mierzyć zarówno lokalne, jak i globalne reakcje larw Drosophila na szkodliwe bodźce termiczne. Procedury te można łączyć z innymi metodami, takimi jak analiza genetyczna, aby zidentyfikować geny niezbędne do nocycepcji termicznej. Podczas przeprowadzania testu z sondą termiczną ważne jest, aby pamiętać o minimalizowaniu zmienności nacisku, lokalizacji oraz kąta styku sondy.