Name: Lokalne i globalne metody oceny nocycepcji termicznej u larw Drosophila (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: Poznaj metody lokalnej i globalnej stymulacji termicznej do badania nocycepcji u larw Drosophila. Techniki te pozwalają kwantyfikować zachowania obronne i analizować przetwarzanie sensoryczne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Christianowi Landry’emu za projekt sondy termicznej, Danielowi Babcockowi za opracowanie testu sondy termicznej dla larw, Seanowi Sweeneyowi za zasugerowanie testu z płytą grzewczą, Bloomington Drosophila Stock Center za udostępnienie szczepów muszek oraz członkom laboratorium Galko za krytyczną lekturę manuskryptu. Praca ta była wspierana przez NIH R01 NS069828 dla MJG oraz grant szkoleniowy NIH MARC U-STAR (T34GM079088 dla University of Houston-Downtown Scholars Academy) w zakresie dostępu mniejszości do karier badawczych (AVG).

<ol><li>Babcock, D. T., Landry, C., Galko, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine+signaling+mediates+UV-induced+nociceptive+sensitization+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytokine signaling mediates UV-induced nociceptive sensitization in Drosophila larvae.</a> Curr. Biol. 19, 799-806 (2009).</li>
<li>Tracey, W. D., Wilson, R. I., Laurent, G., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((painless%2C+a+Drosophila+gene+essential+for+nociception%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">painless, a Drosophila gene essential for nociception.</a> Cell. 113, 261-273 (2003).</li>
<li>Oswald, M., Rymarczyk, B., Chatters, A., Sweeney, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+thermosensitive+escape+behavior+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Fly+%28Austin%29%22%5BJournal%5D)">A novel thermosensitive escape behavior in Drosophila larvae.</a> Fly (Austin). 5, 17810(2011).</li>
<li>Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tiling+of+the+Drosophila+epidermis+by+multidendritic+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons.</a> Development. 129, 2867-2878 (2002).</li>
<li>Moore, A. W., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((hamlet%2C+a+binary+genetic+switch+between+single-+and+multiple-+dendrite+neuron+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">hamlet, a binary genetic switch between single- and multiple- dendrite neuron morphology.</a> Science. 297, 1355-1358 (2002).</li>
<li>Gao, F. B., Brenman, J. E., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+regulating+dendritic+outgrowth%2C+branching%2C+and+routing+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Genes regulating dendritic outgrowth, branching, and routing in Drosophila.</a> Genes Dev. 13, 2549-2561 (1999).</li>
<li>Walters, E. T., Illich, P. A., Weeks, J. C., Lewin, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defensive+responses+of+larval+Manduca+sexta+and+their+sensitization+by+noxious+stimuli+in+the+laboratory+and+field%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Defensive responses of larval Manduca sexta and their sensitization by noxious stimuli in the laboratory and field.</a> J. Exp. Biol. 204, 457-469 (2001).</li>
<li>Woolf, C. J., Ma, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nociceptors--noxious+stimulus+detectors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Nociceptors--noxious stimulus detectors.</a> Neuron. 55, 353-364 (2007).</li>
<li>Hwang, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nociceptive+neurons+protect+Drosophila+larvae+from+parasitoid+wasps%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Nociceptive neurons protect Drosophila larvae from parasitoid wasps.</a> Curr. Biol. 17, 2105-2116 (2007).</li>
<li>Xiang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-avoidance-mediating+photoreceptors+tile+the+Drosophila+larval+body+wall%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall.</a> Nature. 468, 921-926 (2010).</li>
<li>Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projections+of+Drosophila+multidendritic+neurons+in+the+central+nervous+system%3A+links+with+peripheral+dendrite+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology.</a> Development. 134, 55-64 (2007).</li>
<li>Sweeney, N. T., Li, W., Gao, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+manipulation+of+single+neurons+in+vivo+reveals+specific+roles+of+flamingo+in+neuronal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic manipulation of single neurons in vivo reveals specific roles of flamingo in neuronal morphogenesis.</a> Dev. Biol. 247, 76-88 (2002).</li>
<li>Kernan, M., Cowan, D., Zuker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+dissection+of+mechanosensory+transduction%3A+mechanoreception-defective+mutations+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Genetic dissection of mechanosensory transduction: mechanoreception-defective mutations of Drosophila.</a> Neuron. 12, 1195-1206 (1994).</li>
<li>Nitabach, M. N., Blau, J., Holmes, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+silencing+of+Drosophila+pacemaker+neurons+stops+the+free-running+circadian+clock%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Electrical silencing of Drosophila pacemaker neurons stops the free-running circadian clock.</a> Cell. 109, 485-495 (2002).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Opisane tutaj testy mogą być wykorzystane do jakościowej i ilościowej oceny reaktywności larw różnych genotypów na szkodliwe bodźce termiczne. Główną cechą testu z sondą grzewczą jest to, że bodziec jest przykładany tylko w jednym miejscu. Prawdopodobnie prowadzi to do aktywacji jedynie niewielkiej grupy neuronów klasy IV – tych znajdujących się w segmencie kontaktu z sondą oraz być może w segmentach bezpośrednio sąsiednich11. Ze względu na lokalną stymulację, test z sondą grzewczą naśladuje powszechne doświadczenie sensoryczne wykrywania szkodliwego bodźca zlokalizowanego w konkretnym regionie ciała – na przykład kontaktu dłoni z gorącą kuchenką. Wadą testu z sondą grzewczą jest pewna zmienność zależna od operatora, którą można prawdopodobnie przypisać trzem czynnikom: i) naciskowi, z jakim operator przykładuje sondę do larwy, ii) precyzyjnej lokalizacji sondy na larwie względem leżących poniżej neuronów nocyceptywnych oraz iii) dokładnemu kątowi, pod którym sonda styka się z powierzchnią larwy.
Wcześniej opisaliśmy ilościową strategię kategoryzacji larw na nieodpowiadające, wolno odpowiadające i szybko odpowiadające w oparciu o czas latencji wycofania w odpowiedzi na określoną temperaturę1. W niniejszej pracy raportujemy reakcję larw na jeszcze wyższe temperatury. Co ciekawe, odkryliśmy, że istnieje górna granica termicznych odpowiedzi nocyceptywnych u larw i że granica ta znajduje się między 52 a 54 °C. Może to wskazywać, że larwy nie posiadają kanału potencjału przejściowego (TRP) zdolnego do otwierania się w temperaturach wyższych niż 52 °C. Alternatywnie może to sugerować, że neurony lub mięśnie wykorzystywane do inicjowania lub wykonywania odpowiedzi motorycznej ulegają uszkodzeniu, zanim zdołają one funkcjonować w mechanizmie unikowym wycofania. Przedstawiamy również inną analizę amplitudy odpowiedzi wycofania, wykorzystując liczbę obrotów jako wskaźnik „siły” reakcji. Intuicyjnie można by oczekiwać, że parametry te będą rosły wraz ze wzrostem temperatury lub czasu stymulacji. Zaskakujące jest to, że tak nie jest. Larwy stymulowane przez dłuższy czas w temperaturze z dolnego zakresu szkodliwego (42 °C) wykonują więcej obrotów i spędzają więcej czasu na rolowaniu niż larwy badane w wyższych temperaturach (48-52 °C). Sugeruje to, że w obrębie okna temperatur szkodliwych to przede wszystkim czas ekspozycji determinuje amplitudę odpowiedzi. Ponieważ larwy poddane bardzo szkodliwym temperaturom (48-52 °C) reagują średnio bardzo szybko, nie wykonują tak wielu obrotów jak larwy poddane mniej szkodliwej temperaturze przez dłuższy czas. Opisana tutaj analiza amplitudy odpowiedzi dodaje kolejny wymiar ilościowy, w ramach którego można porównywać różne genotypy lub manipulacje środowiskowe.
Główną cechą testu na płytce grzewczej jest to, że wiąże się on z globalną ekspozycją na szkodliwe ciepło. W związku z tym jest on bardziej zbliżony do sytuacji, w której zwierzę znajduje się w rozgrzanym kotle, niż do dotknięcia gorącej kuchenki. Chociaż nie jest jasne, kiedy larwa może doświadczyć globalnego bodźca szkodliwego w naturze, w warunkach laboratoryjnych reakcje behawioralne na taką globalną ekspozycję są bardziej złożone niż te obserwowane podczas stymulacji miejscowej. Atutem testu na płytce grzewczej, zauważony również przez innych autorów3, jest niewielka zmienność między użytkownikami, ponieważ dotykanie larwy nie jest elementem protokołu. Jedyną istotną zmienną wydaje się być definiowanie momentu rozpoczęcia każdego zachowania, co można zminimalizować poprzez wielokrotną obserwację i oswojenie się z procedurą. Interesującą różnicą między testami są temperatury, przy których rozpoczynają się zachowania awersyjne. Są one znacznie niższe w teście na płytce grzewczej niż w przypadku sondy grzewczej. Wstępne zachowanie wykazywane przez larwy w kontakcie z sondą grzewczą (podnoszenie głowy i ogona) może być korelatem gwałtownych ruchów głową obserwowanych w temperaturze ok. 27 °C w teście na płytce grzewczej. Możliwe, że reakcja ta odzwierciedla raczej „dyskomfort” niż „ból”. W teście z sondą grzewczą nie zaobserwowaliśmy korelatów smagania, drgawek i paraliżu nawet w wysokich temperaturach (do 48 °C); może to oznaczać, że do wywołania tych zachowań niezbędna jest krytyczna masa wyładowań neuronów sensorycznych z więcej niż jednego regionu ciała. Co ciekawe, zachowania takie jak drgawki i paraliż obserwuje się w temperaturach (~34 – 37 °C) poniżej dolnej granicy progu nocyceptywnego odnotowanego przy użyciu sondy grzewczej, co wskazuje, że stymulacja globalna może wiązać się z sumowaniem odpowiedzi neuronalnych, które są niewystarczające do wywołania zachowania przy miejscowym zastosowaniu sondy grzewczej. Fakt, że temperatury te są rzeczywiście odczuwane przez larwy jako szkodliwe, potwierdza obserwacja, że larwy, u których rozpoczyna się paraliż, a następnie pozostawia się je do regeneracji na pożywce dla much, w większości przypadków nie przeżywają (Rysunek 5C). Argument, że test na płytce grzewczej odczytuje odpowiedzi nocyceptywne, wspiera również fakt, że blokowanie przekazywania synaptycznego w znanych nocyceptywnych neuronach sensorycznych zwiększa latencję większości obserwowanych zachowań (Rysunek 6). Obserwacja, że w przypadku zachowania smagania w wyższych temperaturach nie następuje zwiększenie latencji, sugeruje, że do tego zachowania mogą być wymagane inne neurony sensoryczne, które nie wykazują ekspresji md-Gal4.
Podsumowując, oba testy polegają na poddaniu pojedynczej larwy szkodliwemu bodźcom termicznym o określonej temperaturze – w teście lokalnym jest to gorący czubek małej metalowej sondy, a w teście globalnym zanurzenie w kropli szybko nagrzewanej wody. Za pomocą tych testów można badać i kwantyfikować odpowiedzi behawioralne larw Drosophila o różnych podłożach genetycznych i/lub wystawionych na różne warunki środowiskowe (na przykład z uszkodzeniem tkanek lub bez niego). Ostatecznie wyniki tych badań pomogą nam lepiej zrozumieć sieci genetyczne kontrolujące nocycepcję u Drosophila oraz innych pokrewnych gatunków.

<table><tbody><tr><td>Sonda termiczna</td><td>Pro-Dev Engineering</td><td>Budowa na zamówienie</td><td>Informacje kontaktowe dostępne na żądanie</td></tr><tr><td>Inkubator z suchą kąpielą</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-718</td><td>1 jednolity blok grzewczy i 1 blok grzewczy z otworami 16mm</td></tr><tr><td>Kamera kolorowa Leica DFC290 12v/400mA</td><td>Leica Microsystems</td><td>12730080</td><td>Można użyć dowolnej równoważnej&lt;br/&gt; kamery.</td></tr><tr><td>Mikroskop Leica MZ6</td><td>Leica Microsystems</td><td>Numer katalogowy korpusu zoom MZ6 (nośnik optyki) to 10445614</td><td></td></tr><tr><td>Jednostka Modulamp Schott Ace</td><td>Schott AG</td><td>A20500</td><td></td></tr><tr><td>Podwójny gęsi szyja 23-calowy światłowodowy przewód światłowodowy Schott</td><td>Schott AG</td><td>Schott A08575</td><td></td></tr><tr><td>Jednostka kontroli termicznej</td><td>TSCI corp.</td><td>Budowa na zamówienie</td><td>Szczegóły dostępne na żądanie</td></tr><tr><td>Mikroskop Zeiss Stemi 2000</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>NT55-605</td><td>Można użyć dowolnego równoważnego&lt;br/&gt; mikroskopu.</td></tr><tr><td>Pęseta</td><td>Fine Science Tools</td><td>FS-1670</td><td></td></tr><tr><td>Sito o oczkach 1mm</td><td>Genesee Scientific</td><td>57-101</td><td></td></tr><tr><td>Pędzel</td><td>Blick Art Materials</td><td>06762-1002</td><td></td></tr><tr><td>Crosslinker UV</td><td>Fisher Scientific</td><td>1199289</td><td></td></tr><tr><td>Słoiki Coplin</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-816</td><td></td></tr><tr><td>Zlewka 10ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-540C</td><td></td></tr><tr><td>Eter dietylowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>E138-500</td><td></td></tr><tr><td>Polistyrenowa szalka Petri 35 X 10 mm</td><td>Falcon BD</td><td>351008</td><td>Nie testowaliśmy&lt;br/&gt; alternatywnych szalek.</td></tr><tr><td>Szkiełko mikroskopowe</td><td>Corning</td><td>26003</td><td></td></tr><tr><td>Termopara</td><td>Omega Engineering, Inc.</td><td>HH802U</td><td></td></tr><tr><td>Kawałek winylu</td><td>Office Depot</td><td>480009</td><td></td></tr><tr><td>Probówka do mikrocentryfugi</td><td>Denville Scientific</td><td>C-2170</td><td></td></tr></tbody></table>

lokalne i globalne metody oceny nocycepcji termicznej u larw drosophila

Local and Global Methods of Assessing Thermal Nociception in Drosophila Larvae

W niniejszym artykule przedstawiamy testy służące do badania nocycepcji termicznej u larw Drosophila. Pierwszy test polega na stymulacji lokalnej (przestrzenie ograniczonej) nocyceptorów termicznych1,2, natomiast drugi polega na aktywacji globalnej większości lub wszystkich takich neuronów3. Wspólnie techniki te umożliwiają wizualizację i kwantyfikację funkcji behawioralnych nocyceptywnych neuronów sensorycznych Drosophila.
Larwa Drosophila jest uznanym systemem modelowym do badania nocycepcji termicznej, czyli reakcji sensorycznej na potencjalnie szkodliwe temperatury, która jest konserwatywna ewolucyjnie u wielu gatunków1,2. Zaletą wykorzystania Drosophila w takich badaniach jest relatywna prostota jej układu nerwowego oraz zaawansowanie technik genetycznych, które można zastosować do analizy molekularnych podstaw związanych z tą biologią4-6. U Drosophila, podobnie jak u wszystkich metazoa, odpowiedź na szkodliwe bodźce termiczne objawia się zazwyczaj „nocyfensywnym”, awersyjnym wycofaniem się od prezentowanego bodźca7. Bodźce te są wykrywane przez wolne zakończenia nerwowe lub nocyceptory, a amplituda reakcji organizmu zależy od liczby nocyceptorów odbierających szkodliwy bodziec8. U Drosophila to neurony sensoryczne klasy IV o rozgałęzionym drzewie dendrytycznym wykrywają szkodliwe bodźce termiczne i mechaniczne9, poza ich niedawno odkrytą rolą jako fotoreceptorów10. Neurony te, bardzo dokładnie zbadane na poziomie rozwojowym, rozgałęziają się nad barierowym arkuszem epidermy i nawiązują kontakty z niemal wszystkimi komórkami epidermy11,12. Pojedynczy akson każdego neuronu klasy IV projekuje do brzusznego sznura nerwowego ośrodkowego układu nerwowego11, gdzie mogą one łączyć się z neuronami drugiego rzędu, które projekują do mózgu.
W warunkach bazowych neurony sensoryczne nocyceptywne nie będą generować impulsów, dopóki nie zostanie osiągnięty stosunkowo wysoki próg pobudzenia. Opisane tutaj testy pozwalają badaczowi na ilościowe określenie bazowych odpowiedzi behawioralnych lub, prawdopodobnie, uwrażliwienia, które następuje po uszkodzeniu tkanki. Każdy test wywołuje odmienne, ale powiązane reakcje behawioralne w zakresie lokomocji w odpowiedzi na szkodliwe bodźce termiczne, umożliwiając badaczowi wizualizację i kwantyfikację różnych aspektów nocycepcji termicznej u larw Drosophila. Testy te można zastosować u larw o pożądanych genotypach lub u larw hodowanych w różnych warunkach środowiskowych, które mogą wpływać na nocycepcję. Ponieważ nocycepcja termiczna jest konserwatywna między gatunkami, wnioski płynące z analizy genetycznej u Drosophila prawdopodobnie przyczynią się do zrozumienia nocycepcji termicznej u innych gatunków, w tym u kręgowców.

W niniejszym artykule przedstawiamy testy służące do badania nocycepcji termicznej u larw Drosophila. Jeden z testów polega na stymulacji ograniczonej przestrzennie (lokalnej) nocyceptorów termicznych1,2, natomiast drugi obejmuje całkowitą (globalną) aktywację większości lub wszystkich takich neuronów3. Wspólnie techniki te umożliwiają wizualizację i kwantyfikację funkcji behawioralnych neuronów sensorycznych nocyceptywnych Drosophila.

Lokalne i globalne metody oceny nocycepcji termicznej u larw Drosophila

W niniejszym artykule prezentujemy testy służące do badania nocycepcji termicznej u larw Drosophila. Jeden z testów polega na przestrzennie ograniczonej (lokalnej) stymulacji...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest ocena nocycepcji termicznej u larw Drosophila. Osiąga się to poprzez pobranie larw Drosophila, a następnie poddanie ich szkodliwym bodźcom termicznym; w opcjonalnym drugim kroku larwy mogą zostać poddane naświetlaniu promieniami UV, co powoduje uszkodzenie tkanek i uwrażliwienie nocyceptywne na temperaturę. Następnie larwy można badać lokalnie za pomocą sondy grzewczej lub globalnie przy użyciu płyty grzejnej, aby wywołać reakcje nocyceptywne, które można zmierzyć ilościowo.Sonda termiczna wykazuje, że larwy mają górny limit odpowiedzi nocyceptywnej na ciepło oraz zaskakującą zależność między temperaturą bodźca a amplitudą wywołanej odpowiedzi. Test na płycie grzejnej pokazuje, że larwy wykazują stereotypową sekwencję zachowań nocyceptywnych, które zależą od temperatury otaczającej wody i aktywności nocyceptywnych neuronów sensorycznych. Opisane tutaj metody mogą pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie nocycepcji termicznej, takie jak to, czy zwierzęta reagują inaczej na szkodliwe bodźce termiczne prezentowane lokalnie lub globalnie.Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z testem sondy termicznej napotykają trudności, ponieważ opanowanie tej metody wymaga praktyki w celu zminimalizowania zmienności nacisku, miejsca przyłożenia oraz kąta prowadzenia sondy. Wizualna demonstracja testu płyty grzewczej jest kluczowa, ponieważ zachowania wywołane rosnącą temperaturą najlepiej ocenić poprzez bezpośrednią obserwację. Aby uzyskać wystarczającą liczbę larw potomstwa o określonym genotypie, należy hodować pożądany szczep bezpośrednio lub przeprowadzić krzyżówki w butelkach z pożywką dla muszek, używając 20 do 30 dziewiczych samic i 15 do 20 samców. Pięć dni po zniesieniu jaj należy zebrać i oczyścić wczesne larwy trzeciego stadium, usuwając rozmokłą pożywkę i przemywając je delikatnie bieżącą wodą przez sito o rozmiarze oczek 630 micron. Wczesne larwy trzeciego stadium należy przenieść na małą, wilgotną porcję pożywki, aby zapobiec ich głodowaniu i wysychaniu.Po przygotowaniu komory anestezji, za pomocą pęsety lub pędzelka ostrożnie umieść 10 larw z wczesnego trzeciego stadium rozwojowego wzdłuż wewnętrznej strony pokrywy i zamknij ją. Pracując w dygestorium, umieść komorę anestezji w słoiku sprzęgającym, w którym znajduje się zlewka o pojemności 10 mililitrów z kulką waty nasączoną 1,5 mililitrami eteru etylowego. Zakręć nakrętkę słoika sprzęgającego, aby poddać larwy działaniu oparów eteru przez 2 do 2,5 minuty.Po znieczuleniu wyjmij komorę do znieczulania z naczynia Coplana i odczekaj kilka sekund w dygestorium, aż resztki oparów eteru ulotnią się. Za pomocą butelki z wodą ostrożnie wypłucz larwy z komory do małej szalki Petriego. Osusz znieczulone larwy za pomocą papierowego ręcznika, a następnie delikatnie przymocuj je grzbietem do góry na pasku dwustronnej taśmy klejącej przyklejonej do szkiełka przedmiotowego o wymiarach trzech na jeden cal.Umieść preparas na dolnej powierzchni komory do naświetlania UV i poddaj larwy działaniu światła UV przez sześć sekund przy natężeniu 20 millijoules per centimeter squared. Po naświetlaniu zanurz preparas w wodzie, aby delikatnie oddzielić larwy od dwustronnej taśmy klejącej. Za pomocą pęsety lub pędzla ostrożnie przenieś naświetlone larwy do naczynia o wymiarach 15 by 45 millimeter.Szklana fiolka hodowlana o pojemności jednej dramy zawierająca jeden mililitr pożywki dla much, w której larwy powinny regenerować się od ośmiu do 24 godzin w temperaturze 25 °C lub pożądanej temperaturze hodowli przed ponownym przeniesieniem. W przypadku testów nocycepcji termicznej należy najpierw ustawić temperaturę sondy termicznej na pożądany punkt nastawy. Za pomocą pędzla lub pęsety należy delikatnie przenieść pojedynczą larwę na płaską platformę, upewniając się, że larwa jest pokryta cienką warstwą wody.Aby zminimalizować różnice w nacisku oraz zapewnić prawidłowe położenie i kąt wprowadzenia sondy termicznej, kluczowa jest wprawa. Delikatnie dociśnij końcówkę sondy do larwy na wysokości segmentu A4, wywierając lekki nacisk pod kątem około 45 stopni między sondą a powierzchnią ciała larwy. Nacisk ten powinien spowodować niewielkie wgłębienie na powierzchni larwy i zazwyczaj jest wystarczający, aby zapobiec jej poruszaniu się.Kontynuuj stymulację larw, aż do wystąpienia reakcji wycofania lub do momentu osiągnięcia 22. punktu odcięcia. Larwy reagujące zazwyczaj najpierw wykazują wstępne zachowanie polegające na unoszeniu głowy i ogona, po czym następuje zachowanie wycofania w postaci obrócenia się o co najmniej 360 stopni. Po zainicjowaniu zachowania wycofania przerwij kontakt z sondą i zarejestruj latencję lub czas potrzebny na wycofanie.Jeśli w ciągu 20 sekund nie zaobserwowano reakcji wycofania, larwa zostaje uznana za osobnika nieodpowiadającego. Ustaw światłowodowe przewodniki światła tak, aby zapewnić odpowiednie oświetlenie o wysokim kontraście. Aby obejrzeć larwy, umieść blok grzejny w płycie grzejnej płaską powierzchnią do góry, a następnie ustaw płytę grzejną na podstawie mikroskopu.Włącz płytkę grzejną na wysoką moc i odczekaj około 15 minut, aż temperatura ustabilizuje się na poziomie 95 stopni Celsjusza. Odmierz 80 µL wody destylowanej i za pomocą mikropipety nanieś kroplę wody na środek polistyrenowej szalki Petriego o wymiarach 60 na 15 mm. Używając pęsety, delikatnie umieść czystą larwę w połowie trzeciego stadium rozwojowego na środku kropli wody, wprowadzając jak najmniej dodatkowej wody.Ostrożnie umieść szalkę Petriego na stałym bloku grzewczym na płycie grzejnej. Szybko skoryguj położenie szalki tak, aby cała larwa i kropla wody były widoczne. Uruchom stoper.W tym momencie szalkę Petriego umieszcza się na stałym bloku grzejnym płyty grzewczej i odnotowuje czas wystąpienia każdego z zachowań. Obserwuje się stereotypowe zachowania lokomocyjne po przeniesieniu larwy zanurzonej w wodzie na płytę grzewczą. Normalne zachowanie w przypadku braku ciepła obejmuje lokomocję parasolowatą, której towarzyszą poszukujące ruchy głowy.Następnie może wystąpić zachowanie określane jako gwałtowne potrząsanie głową (head thrash), podczas którego larwa szybko porusza głową w kierunku przednim lub bocznym. Ruch ten jest podobny do ich normalnego przemieszczania się w wodzie, lecz odbywa się w sposób bardziej szarpany i z uporczywym obracaniem. Zachowanie to jest odnotowywane, gdy larwy obracają się bokiem o co najmniej pełne 360 stopni.Może to zdarzyć się różną liczbę razy, a czasami obejmuje niepełne obroty. W celu oceny tego zachowania należy liczyć wyłącznie pełne obroty o 360 stopni. Zachowanie to jest najbardziej zbliżone do sceny z lokalnym przykładaniem sondy termicznej podczas zachowania typu „whip”.Larwa wykazuje szybkie ruchy skurczowo-rozkurczowe wzdłuż osi przednio-tylnej, które sprawiają, że głowa bardzo krótko zbliża się do ogona. Ruchy smagające są często obserwowane w szybkiej sekwencji, dwiema seriami lub jednocześnie z toczeniem. Na koniec larwa wykazuje zachowania przypominające drgawki, po których często następuje paraliż. Podczas drgawek larwa wyciąga się wzdłuż osi przednio-tylnej i wykazuje wysoką częstotliwość drżeń całego ciała.Zachowanie polegające na drżeniu bez paraliżu z wygięciem występuje, gdy larwy przestają się poruszać. U niektórych larw jest to stan trwały, podczas gdy inne wykazują następnie ruch pulsacyjny o niskiej częstotliwości. Na tym wykresie procentu osobników odpowiadających w każdej kategorii widoczny jest limit odpowiedzi nocycepcyjnej larw na ciepło. W teście z sondą termiczną 100% larw reaguje szybko do temperatury sondy 52 °C.Jednak w temperaturze 54°C i wyższej 90% lub więcej larw nie reaguje nawet po 20 sekundach kontaktu. Choć larwy te nadal poruszają się po 22. odcięciu, można również zmierzyć i wykreślić liczbę obrotów lub czas trwania zachowania wycofania w reakcji na bodziec awersyjny. Co zaskakujące, wydaje się istnieć odwrotna zależność między temperaturą sondy a intensywnością reakcji, gdyż niższe temperatury zdają się wywoływać większą liczbę obrotów.Po przeniesieniu larwy zanurzonej w wodzie na płytkę grzejną obserwuje się pięć stereotypowych zachowań lokomocyjnych. Przedstawiono tutaj średnie czasy latencji, w których obserwuje się te zachowania, a także średnie temperatury kropli wody zmierzone dla każdej latencji w optymalnych warunkach testu opisanych w niniejszej pracy; odsetek larw wykazujących każde z tych charakterystycznych zachowań mieścił się w granicach od 77 do 100%, choć sporadycznie zachowania takie jak toczenie się (rolling) i smaganie (whipping) są pomijane, nakładają się na siebie lub występują w odwrotnej kolejności. Przedstawiono tutaj odsetek larw, które przeżyły po wystąpieniu paraliżu w teście na płytce grzejnej. Larwy były podgrzewane aż do momentu wystąpienia paraliżu, a następnie przeniesione do standardowych warunków hodowli w celu rekonwalescencji.Larwy z grupy kontrolnej (mock) poddano analogicznym zabiegom, z wyjątkiem ekspozycji na wysoką temperaturę, a tworzenie PPE u żyjących osobników dorosłych ilościowo oceniano między siódmym a trzynastym dniem. W tym układzie MD G four napędza ekspresję transgenów regulowanych przez UAS we wszystkich czterech klasach wielkodendrytycznych obwodowych neuronów sensorycznych. UAS or one delta C wykazuje ekspresję zmodyfikowanej wersji drosophila otwieranego potencjałowo kanału potasowego niezbędnego do transmisji synaptycznej, natomiast UAS orrc one delta NC wykazuje ekspresję dodatkowo zmodyfikowanej wersji tego samego kanału, która nie zakłóca transmisji synaptycznej.Należy zauważyć, że tylko larwy posiadające zarówno driver MD GAL4, jak i transgen UAS ORC delta C wykazują zwiększone opóźnienia w czterech z pięciu obserwowanych zachowań. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat pomiaru lokalnych i globalnych odpowiedzi larw Drosophila na szkodliwe bodźce termiczne. Procedury te można łączyć z innymi metodami, takimi jak analiza genetyczna, w celu zidentyfikowania genów niezbędnych do nocycepcji termicznej. Podczas przeprowadzania testu z sondą grzewczą ważne jest, aby dążyć do zminimalizowania zmienności w zakresie nacisku, lokalizacji oraz kąta kontaktu sondy.

local-global-methods-assessing-thermal-nociception-drosophila

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Lokalne i globalne metody oceny termicznej nocycepcji w Drosophila larw

W niniejszym opracowaniu opisujemy szybką, niezawodną i prostą procedurę określania najniższej temperatury, przy której szczury lub myszy wykazują zachowania nocyfencyjne, t. j. na próg termicznej nocycepcji (TNT). Metoda ta wykorzystuje powoli zwiększający się bodziec termiczny, co pozwala na precyzyjną i powtarzalną ocenę TNT przy minimalnym lub żadnym stresie dla zwierząt.

Szybkie oznaczanie progu termicznej nocycepcji u szczurów z cukrzycą

Larwy Drosophila mają dedykowane neurony czuciowe - nocyceptory - których reakcja na potencjalnie szkodliwe bodźce termiczne wyzwala u zwierzęcia zachowania awersyjne - lub tak zwane "nocyfensywne". Ten film opisuje metodę oceny nocycepcji termicznej poprzez rejestrowanie zachowania larw w odpowiedzi na miejscowe przyłożenie sondy ciepła do naskórka. Metoda ta jest zatem nazywana testem lokalnej sondy ciepła.

Test lokalnej sondy ciepła: metoda oceny nocyceptycji wysokich temperatur u larw Drosophila

Badania morfogenezy neuronów za pomocą neuronów dendrytycznych larw Drosophila korzystają z wizualizacji in situ białek neuronalnych i naskórkowych za pomocą immunofluorescencji. Opisujemy procedurę, która poprawia analizę immunofluorescencyjną neuronów da i otaczających komórek naskórka poprzez usunięcie tkanki mięśniowej ze ściany ciała larwy.

Usuwanie tkanki mięśniowej Drosophila z filetów larwalnych w celu analizy immunofluorescencyjnej neuronów czuciowych i komórek naskórka

Tutaj demonstrujemy nowatorski test do badania zimnej nocycepcji u larw Drosophila. Test ten wykorzystuje specjalnie skonstruowaną sondę Peltiera, zdolną do zastosowania ogniskowego szkodliwego bodźca zimna i skutkuje wymiernymi zachowaniami specyficznymi dla zimna. Technika ta pozwoli na dalszą komórkową i molekularną sekcję zimnej nocycepcji.

Nowy test na zimną nocycepcję u larw Drosophila

Tutaj prezentujemy protokół do określenia preferowanej temperatury środowiskowej larw Drosophila za pomocą ciągłego gradientu termicznego.

Test gradientu temperatury w celu określenia preferencji termicznych larw Drosophila

Tutaj prezentujemy protokół do automatycznego określania sprawności lokomotorycznej Drosophila przy zmieniających się temperaturach za pomocą programowalnej areny kontrolowanej temperaturą, która wytwarza szybkie i dokładne zmiany temperatury w czasie i przestrzeni.

Zautomatyzowana metoda określania wydajności Drosophila w odpowiedzi na zmiany temperatury w czasie i przestrzeni

Limity termiczne mogą przewidywać środowisko, które organizmy tolerują, co jest cenną informacją w obliczu gwałtownych zmian klimatycznych. Opisano tutaj wysokoprzepustowe protokoły do oceny krytycznych minimów termicznych i czasu wykańczania ciepła u owadów. Oba protokoły maksymalizują przepustowość i minimalizują koszt testów.

Wysokoprzepustowe testy krytycznych limitów termicznych u owadów

Celem tego protokołu jest pokazanie, jak przeprowadzić ulepszony test mechanicznej nocycepcji u larw Drosophila. Używamy tutaj testu, aby wykazać, że nadwrażliwość mechaniczna (allodynia i hiperalgezja) występuje u larw Drosophila.

Ulepszony test i narzędzia do pomiaru mechanicznej nocycepcji u larw Drosophila

Ocena i leczenie bólu u niemowląt jest trudne, ponieważ nie są one w stanie werbalnie zgłosić swoich odczuć. W tym filmie opisujemy ilościowe metody elektrofizjologiczne oraz techniki analizy, które mogą być wykorzystane do pomiaru reakcji układu nerwowego niemowlęcia na bodźce szkodliwe.

Pomiary elektrofizjologiczne i analiza nocycepcji u niemowląt

Drosophila melanogaster to genetycznie i behawioralnie podatny system modelowy, który od ponad wieku jest wykorzystywany do zrozumienia molekularnych i komórkowych podstaw wielu ważnych procesów biologicznych 1. Drosophila została szeroko wykorzystana w celu uzyskania wglądu w genetyczne podstawy zachowania much.

Metody oceny zachowania Drosophila

Poznaj metody lokalnej i globalnej stymulacji termicznej do badania nocycepcji u larw Drosophila. Techniki te pozwalają kwantyfikować zachowania obronne i analizować przetwarzanie sensoryczne.

Lokalne i globalne metody oceny nocycepcji termicznej u larw Drosophila

Przeglądaj więcej filmów