Lokalne i globalne metody oceny nocycepcji termicznej u larw Drosophila

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest zbadanie nocycepcji termicznej u larw Drosophila. Osiąga się to poprzez zbieranie larw Drosophila, aby następnie wystawić je na szkodliwe bodźce termiczne jako opcjonalny drugi etap Larwy mogą być naświetlane promieniowaniem UV, co powoduje uszkodzenie tkanek i uczulenie termiczne nocyceptywne. Następnie larwy mogą być badane lokalnie za pomocą sondy cieplnej lub globalnie za pomocą płytki grzewczej w celu sprowokowania reakcji nocyceptywnych, które można zmierzyć ilościowo.

Sonda ciepła pokazuje, że larwy mają pułap nocyceptywnej odpowiedzi na ciepło i zaskakujący związek między temperaturą wejściową a amplitudą sprowokowanej reakcji. Test płytki cieplnej pokazuje, że larwy wykazują stereotypową sekwencję zachowań nocyceptywnych, które zależą od temperatury otaczającej wody i aktywności nocyceptywnych neuronów czuciowych. Opisane tutaj metody mogą pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie nocycepcji termicznej, takie jak to, czy zwierzęta reagują inaczej na szkodliwe bodźce termiczne, które są prezentowane lokalnie lub globalnie.

Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w teście sondy cieplnej, będą miały trudności, ponieważ opanowanie testu wymaga praktyki, aby zminimalizować zmiany ciśnienia, lokalizacji i kąta przewodzenia zastosowanej sondy Wizualna demonstracja testu płyty grzewczej ma kluczowe znaczenie. Ponieważ zachowania wywoływane wraz ze wzrostem temperatury muszą być postrzegane, aby były jak najlepiej doceniane. Aby uzyskać wystarczającą liczbę larw potomnych o określonym genotypie będącym przedmiotem zainteresowania, należy bezpośrednio wyhodować pożądane stado lub założyć krzyżówki w butelkach zawierających pokarm dla much, używając 20 do 30 dziewiczych samic i 15 do 20 samców pięć dni po zbiorze jaj i oczyścić larwy we wczesnym stadium rozwoju trzeciego stadium poprzez nabieranie papkowatego pokarmu dla much i przecedzenie delikatnie bieżącą wodą przez siatkę o wielkości porów o wielkości 630 mikronów, przenieś wczesne larwy trzeciego stadium rozwojowego do mała, wilgotna podkładka z jedzeniem, aby zapobiec głodowi i wysuszeniu.

Po skonstruowaniu komory autoryzacji za pomocą kleszczy lub pędzla delikatnie umieść 10 larw wczesnego trzeciego stadium wzdłuż wewnętrznej strony pokrywy i zamknij. Pracując w dygestorium, umieścił komorę autoryzacji w słoiku sprzęgającym zawierającym 10-mililitrową zlewkę z wacikiem nasączonym 1,5 mililitra eteru dathylu. Zakręć nakrętkę słoika coplan, aby wystawić larwy na działanie oparów eteru przez dwie do 2,5 minuty.

Po autoryzacji e wyjmij komorę autoryzacji e ze słoika Coplan i daj jej kilka sekund w kapturze, aby wszelkie resztki oparów eteru rozproszyły się. Użyj butelki ze spryskiwaczem wody, aby delikatnie spłukać larwy z komory autoryzacji na małą szalkę Petriego. Osusz znieczulone larwy, a następnie delikatnie przymocuj je grzbietem do góry na pasku dwustronnej taśmy klejącej, przymocuj do szklanego szkiełka mikroskopowego o wymiarach trzy cale na jeden cal.

Umieść szkiełko na dolnej powierzchni komory naświetlającej promieniami UV i wystaw larwy na działanie światła UV przez sześć sekund z intensywnością 20 milidżuli na centymetr kwadratowy. Po napromieniowaniu zanurz szkiełko w wodzie, aby delikatnie usunąć larwy z dwustronnej taśmy klejącej. Za pomocą kleszczy lub pędzla delikatnie umieść napromieniowane larwy w odległości 15 na 45 milimetrów.

Jedna szklana fiolka hodowlana zawierająca jeden mililitr pokarmu dla much, aby odzyskać siły przez osiem do 24 godzin w temperaturze 25 stopni Celsjusza lub pożądanej temperaturze hodowli przed ponownym umieszczeniem ich w domu. W przypadku testów nocycepcji termicznej najpierw ustaw temperaturę sondy termicznej na żądaną wartość zadaną. Za pomocą pędzla lub kleszczy delikatnie przenieś pojedyncze larwy na płaską platformę, upewniając się, że larwy są pokryte cienką warstwą wody.

Aby zminimalizować wahania ciśnienia, a także zapewnić prawidłowe położenie i kąt sondy ciepła, praktyka czyni mistrza. Delikatnie dociśnij końcówkę sondy do larw w segmencie A czwartym, lekko naciskając końcówką pod kątem około 45 stopni między sondą a powierzchnią larw. Nacisk powinien spowodować niewielkie wgłębienie na powierzchni larw i zwykle będzie wystarczający, aby zapobiec poruszaniu się.

Kontynuuj stymulację larw aż do wystąpienia reakcji odstawienia lub do osiągnięcia 22. punktu odcięcia. Reagujące larwy zazwyczaj najpierw wykazują wstępne zachowanie polegające na podnoszeniu głowy i ogona, a następnie wycofaniu się polegającym na przetaczaniu się o co najmniej 360 stopni. Po zainicjowaniu zachowania związanego z wycofaniem zwolnij kontakt z sondą i zarejestruj opóźnienie lub czas potrzebny do wycofania.

Jeśli w ciągu 20 sekund nie zostanie zaobserwowane żadne zachowanie związane z wycofaniem, oznacza to, że larwy nie reagują. Ustaw światłowody światłowodowe, aby zapewnić odpowiednie oświetlenie o wysokim kontraście. Aby obejrzeć larwy, umieść blok grzewczy na płycie grzewczej płaską powierzchnią do góry, a następnie umieść płytę grzewczą na podstawie mikroskopu.

Włącz płytę grzewczą na wysokie ustawienie i odczekaj około 15 minut, aż temperatura ustabilizuje się na poziomie 95 stopni Celsjusza. Odmierz 80 mikrolitrów wody destylowanej i umieść kroplę wody na środku polistyrenowej szalki Petriego o wymiarach 60 na 15 milimetrów za pomocą mikropipetera. Użyj kleszczy, aby delikatnie umieścić czyste larwy w środkowym trzecim stadium rozwojowym w środku kropli wody, wprowadzając jak najmniej dodatkowej wody.

Delikatnie umieść szalkę Petriego na solidnym bloku grzewczym na płycie grzewczej. Szybko dostosuj położenie naczynia tak, aby widoczne były całe larwy i kropla wody. Uruchom minutnik.

W tej chwili szalka Petriego jest umieszczana na stałym bloku grzewczym płyty grzewczej i rejestruje czas wystąpienia każdego zachowania. Pięć. Stereotypowe zachowania lokomotywy obserwuje się po przeniesieniu larwy zanurzonej w wodzie na płytę grzewczą. Normalne zachowanie przy braku ciepła polega na poruszaniu się parasolem, któremu towarzyszą poszukujące ruchy głowy.

Zachowanie rzucania głową może wystąpić następnie, gdy larwa szybko porusza głową do przodu lub na boki. Ruch ten jest podobny do ich normalnego poruszania się w wodzie, ale występuje bardziej gwałtownie i uporczywie się toczy. Zachowanie występuje, gdy larwy przetaczają się na boki o co najmniej pełne 360 stopni.

Może się to zdarzyć różną liczbę razy, a czasami wiąże się z niekompletnymi rolkami. Na potrzeby punktacji zachowania liczone są tylko pełne rzuty 360 stopni. To zachowanie jest najbardziej podobne do tej sceny z lokalnym zastosowaniem sondy ciepła podczas zachowania bata.

Larwa wykazuje szybkie ruchy zwalniające skurcz wzdłuż tylnej osi antio, które bardzo krótko zbliżają głowę do ogona Biczowanie często obserwuje się w krótkich odstępach czasu, dwa lub w tym samym czasie, co toczenie. Wreszcie, larwa będzie wykazywać zachowania napadowe, po których często następuje paraliż. Podczas napadu larwa rozciąga się wzdłuż tylnej osi międzyoperacyjnej i wykazuje wysoką częstotliwość na całym ciele.

Drżenie bez paraliżu zginającego występuje, gdy larwy przestają się poruszać U niektórych larw jest to trwałe, podczas gdy inne wykazują wtedy ruch pulsacyjny o niskiej częstotliwości. Na tym wykresie procentu respondentów należących do każdej kategorii znajduje się górny pułap odpowiedzi termicznej nocycepcji larw. W teście sondy cieplnej 100% larw szybko reaguje do temperatury sondy 52 stopni Celsjusza.

Jednak w temperaturze 54 stopni Celsjusza i wyższej 90% lub więcej larw nie reaguje nawet po 20 sekundach kontaktu. Chociaż larwy te nadal się poruszają po 22. odcięciu, można również zmierzyć i wykreślić liczbę rolek lub czas spędzony na zachowaniu odstawienia awersji. Co zaskakujące, wydaje się, że istnieje odwrotna zależność między temperaturą wejściową sondy a solidnością odpowiedzi, ponieważ niższe temperatury wydają się prowokować większą liczbę rolek.

Obserwuje się pięć stereotypowych zachowań lokomotywy po przeniesieniu larwy zanurzonej w wodzie na płytę grzewczą. Średnie opóźnienia, przy których obserwuje się te zachowania, są pokazane tutaj, podobnie jak średnie temperatury kropli wody mierzone dla każdego opóźnienia w optymalnych warunkach testowych przedstawionych tutaj, odsetek larw wykazujących każde odrębne zachowanie wahał się od 77 do 100%, chociaż czasami zachowania toczenia i biczowania są pomijane, nakładają się na siebie lub występują w odwrotnej kolejności, Procent larw, które przeżyły po zainicjowaniu paraliżu w teście płytki cieplnej, pokazano tutaj. Larwy podgrzewano aż do paraliżu, a następnie przeniesiono do standardowych warunków hodowli w celu wyzdrowienia.

Pozorowane larwy poddane działaniu preparatu otrzymały równoważne traktowanie, z wyjątkiem ekspozycji na ciepło, a tworzenie się PPE u zdolnych do życia dorosłych było ilościowe w dniach od 7 do 13. W tym przypadku MD G four napędza ekspresję transgenów regulowanych przez UAS we wszystkich czterech klasach wielodendrytycznych obwodowych neuronów czuciowych. UAS lub jedna delta C wyraża zmodyfikowaną wersję otwartego kanału potasowego prostownika drosophila wymaganego do transmisji synaptycznej, a UAS lub jedna delta NC wyraża dalej zmodyfikowaną wersję tego samego kanału, która nie zakłóca transmisji synaptycznej.

Należy zauważyć, że tylko larwy posiadające zarówno sterownik MD GALF four, jak i transgen UAS ORC one delta C wykazują zwiększone opóźnienia dla czterech z pięciu obserwowanych zachowań. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak mierzyć zarówno lokalne, jak i globalne reakcje larw podrobów GE na szkodliwe bodźce termiczne. Procedury te można łączyć z innymi metodami, takimi jak analiza genetyczna w celu identyfikacji genów wymaganych do nocycepcji termicznej Podczas próby wykonania testu sondy ciepła należy pamiętać o zminimalizowaniu zmienności i ciśnienia, lokalizacji i kąta zwilżania sondy.