Przygotowanie próbek do metabolomiki: metoda przygotowania próbek komórek do profilowania metabolitów

Metabolomika to badanie mające na celu identyfikację i ilościowe określenie metabolitów obecnych w komórkach. Aby przygotować próbkę, zacznij od wysiewu komórek raka piersi wraz z pożywką wzrostową na dwóch płytkach oznaczonych jako test i kontrola. Inkubować przez trzy dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Teraz usuń pożywkę i dodaj świeżą pożywkę z estradiolem na płytce testowej i zwykłą pożywkę na płytce kontrolnej.

Estradiol wiąże się z receptorem estrogenowym alfa w komórkach raka piersi w celu wywołania pewnych ekspresji, powodując zmianę składu metabolitów. Inkubuj płytki przez żądany czas. Zastąp pożywkę lodowatym roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanem lub PBS, aby umyć komórki, a następnie dodaj lodowaty aceton. Lodowate odczynniki zatrzymują działanie proteaz, a tym samym zapobiegają degradacji białek.

Teraz użyj skrobaka, aby oderwać komórki od płytek i przenieś je do probówek za pomocą pipety. Weź 20 mikrolitrów tej zawiesiny komórek na hemocytometr i policz liczbę komórek. Próbki należy przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do czasu wykorzystania ich do dalszej analizy. W poniższym protokole przygotowujemy próbki z komórek MCF-7 do chromatografii gazowej i spektrometrii mas.

Używając komórek MCF-7 hodowanych zgodnie z protokołem tekstowym, dodaj do płytki pięć mililitrów lodowatego 1x PBS. Następnie przechyl płytkę kilka razy przed wyjęciem PBS. Powtórz jeszcze dwa razy, usuwając jak najwięcej PBS po ostatnim praniu. Dodaj 750 mikrolitrów wstępnie schłodzonego acetonu do każdej płytki i zeskrob komórki, a następnie połącz komórki z dwóch płytek w dwumililitrową probówkę na lodzie.

Aby policzyć komórki do normalizacji, dla każdego zabiegu użyj dwóch dodatkowych płytek do ilościowego oznaczania komórek. Następnie, aby odłączyć komórki od płytek, dodać 2 mililitry buforu HE i inkubować przez pięć minut. Dokładnie wymieszać komórki, pipetując do buforu HE.

Następnie użyj 20 mikrolitrów roztworu komórkowego w hemocytometrze, aby policzyć liczbę komórek pod mikroskopem. Próbki należy przechowywać w temperaturze ujemnej 80 stopni Celsjusza przed zastosowaniem chromatografii gazowej i spektrometrii mas w celu identyfikacji i ilościowego określenia metabolitów. Wykonaj analizę integracyjną zgodnie z protokołem tekstowym.