Wieloetapowa technika przygotowania do odzyskiwania wielu klas związków metabolitów w celu dogłębnej i pouczającej analizy metabolomicznej

Ogólnym celem tej procedury jest zademonstrowanie skutecznego sposobu frakcjonowania metabolitów w złożonych płynach biologicznych w celu uzyskania uproszczonych próbek w celu lepszego pokrycia metabolomu. Osiąga się to poprzez uprzednie nasycenie każdej próbki wewnętrznymi wzorcami w celu monitorowania odtwarzalności przygotowania próbki i warunków urządzenia. Drugim krokiem jest dodanie lodowatego metanolu do każdej próbki w celu wytrącenia białek, które w przeciwnym razie mogłyby zakłócać późniejszą chromatografię i analizę za pomocą spektrometrii mas.

Następnie etap ekstrakcji cieczy cieczy oddziela metabolity hydrofilowe od hydrofobowych. Ostatnim etapem jest ekstrakcja do fazy stałej w celu dalszej frakcjonowania metabolitów lipidowych na fosfolipidy, kwasy tłuszczowe i obojętne lipidy. Ostatecznie, ta połączona, wieloetapowa metoda została wykorzystana do wykazania skutecznej separacji, doskonałej odtwarzalności i lepszego pokrycia metabolomu osocza.

Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak prosta ekstrakcja metanolem, jest to, że uzyskujemy lepsze pokrycie metabolitami, zwłaszcza lipidów, co jest ważne podczas wykonywania badań profilowania metabolomicznego lub gdy lipidy są szczególnie interesujące. Przed wytrąceniem białek należy najpierw przygotować próbki, rozmrozić je do temperatury pokojowej. Następnie należy nakłuć próbki wewnętrznymi wzorcami ISTD, które zostały wcześniej przygotowane.

Wszystkie standardowe stężenia zostały dostosowane w razie potrzeby w oparciu o czułość zastosowanego oprzyrządowania MS i HPLC. Do analizy należy dodać do każdej próbki 10 mikrolitrów. Każdy z hydrofilowych i hydrofobowych roztworów wzorcowych wzbogaca każdą próbkę o 10 mikrolitrów jednego x dwa x lub czterech x roztworu kontroli pozytywnej.

Po tym, jak wszystkie próbki zostaną wzbogacone wewnętrznymi wzorcami i roztworami kontroli pozytywnej, każdą próbkę należy wirować przez 10 sekund. Aby rozpocząć wytrącanie białka, dodaj 400 mikrolitrów lodowatego metanolu do każdej próbki. Wirować przez 10 sekund na probówkę w temperaturze zero stopni Celsjusza przez 15 minut po 18 000 razy.

G, Na dnie probówki powinien uformować się osad białka. Po odwirowaniu przenieść cały supernatant do nowej szklanej probówki hodowlanej, a następnie wysuszyć pod azotem. Ta wysuszona pozostałość zostanie później poddana ekstrakcji cieczą.

W celu analizy frakcji osadów białkowych dodaj jeden mililitr eteru metylowego chrząszcza turt lub MTBE do wiru białych lub białawych granulek białkowych na 30 sekund na probówkę i wiruj w temperaturze zero stopni Celsjusza przez 15 minut 18 000 razy. G zdekantować warstwę MTBE do nowej szklanej probówki hodowlanej. Ponieważ wielkość osadu będzie się różnić w zależności od próbki, ważne jest, aby konsekwentnie zasysać tę samą ilość MTBE dla wszystkich próbek.

Na przykład, jeśli można zdekantować tylko 900 mikrolitrów dla próbki z najmniejszą ilością supernatantu, to zdekantować 900 mikrolitrów. W przypadku wszystkich próbek dodaj kolejny mililitr MTBE do wiru granulek białkowych przez 30 sekund, a następnie odwiruj w temperaturze zero stopni Celsjusza lub 15 minut. Dodać 18 000 razy G jak poprzednio, odessać warstwę MTBE i dodać do przygotowanych wcześniej szklanych probówek hodowlanych.

Wysuszyć próbki przez przepływ azotu i ponownie zawiesić w 200 mikrolitrach metanolu chloroformowego jeden do jednego. Przenieś każdą próbkę do probówki wirówkowej i wiruj w temperaturze zero stopni Celsjusza przez 15 minut w temperaturze 18 000 razy G. Następnie użyj szklanych pipet, aby przenieść supernatant do fiolek z zakrętką próbnika automatycznego. Aby rozpocząć tę procedurę, użyj szklanej pipety, aby dodać trzy mililitry MTBE do przygotowanej wcześniej wysuszonej pozostałości metanolu i wirować przez 30 sekund.

Następnie dodaj 750 mikrolitrów wody do każdej probówki i wiruj przez 10 sekund. Wirować przy około 200 razy G przez 10 minut w temperaturze pokojowej, widoczne są dwie wyraźne warstwy Po odwirowaniu ostrożnie zassać 2,5 mililitra górnej warstwy MTBE bez pipetowania warstwy wodnej poniżej i przenieść do czystej kultury szklanej. Dwa. Dodać trzy mililitry MTBE do pozostałej części wodnej każdej próbki.

I wirować 10 sekund na wirówkę probówkową około 200 razy G przez 10 minut. W temperaturze pokojowej odessać trzy mililitry MTBE bez pobierania wody i połączyć z poprzednią rurką MTBE. Ta frakcja MTBE zostanie później poddana ekstrakcji do fazy stałej.

Zagęścić pozostałą warstwę wodną, susząc pod azotem. Zawiesić pozostałość w 100 mikrolitrach jednego i dodać 400 mikrolitrów lodowatego metanolu do każdego wiru probówki, a następnie przenieść do mikroprobówki wirówkowej. Pozostaw w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza na 20 do 30 minut, aby pozostałe białko mogło wytrącić się w metanolu.

Następnie wirować w temperaturze zero stopni Celsjusza przez 15 minut w temperaturze 18 000 razy G, wzdłuż boku probówki powinien pojawić się osad po odwirowaniu, zassać 450 mikrolitrów supernatantu bez zasysania osadu i przenieść do czystej probówki do mikrowirówki. Całkowicie wysuszyć w próżniowym koncentratorze odśrodkowym w temperaturze nie wyższej niż 45 stopni Celsjusza przez około jedną do dwóch godzin. Zawiesić wysuszony supernatant w 200 mikrolitrach 5% acetylowo-nitrylowej wody i odwirować.

Na krótko przenieś próbki do automatów, próbnika, fiolek i zamroź w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Aby rozpocząć procedurę ekstrakcji do fazy stałej, należy wysuszyć uzyskaną wcześniej frakcję MTBE pod dobrym przepływem azotu w temperaturze od 35 do stopni Celsjusza przez 10 do 15 minut. Gdy frakcje MTBE są całkowicie suche, zatrzymaj przepływ azotu i szybko ponownie zawieś każdą próbkę w jednym mililitrze chloroformu za pomocą wiru szklanej pipety.

Krótko umyć i kondycjonować ekstrakcję do fazy stałej lub wkład SPE dwukrotnie 400 mikrolitrami heksanu. Wyrzuć odpady i zastąp je nową szklaną rurką do zbierania. Dodać próbkę do kolumny SPE, zastosować próżnię i zebrać przepływ.

Za pomocą szklanej pipety dodać jeden mililitr alkoholu izopropylowego chloroformu do jednego do jednego do kolumny SPE i zebrać przepływ w tych samych szklanych probówkach. To jest frakcja neutralna. Suszyć frakcję obojętną pod azotem przez 10 do 15 minut.

Aby zminimalizować utlenianie za pomocą szklanej pipety, dodaj jeden mililitr 5% kwasu octowego w eterze etylowym do kolumny SPE i zbierz przepływ. Jest to frakcja kwasów tłuszczowych. Suszyć frakcję kwasów tłuszczowych pod azotem przez 10 do 15 minut, aby zminimalizować utlenianie za pomocą plastikowych końcówek.

Dodaj 800 mikrolitrów metanolu do wkładu SPE i zbierz przepływ przez W 15-mililitrowych plastikowych stożkowych rurkach jest to frakcja fosfolipidowa. Przenieś frakcję fosfolipidową do 1,5 mililitrowych probówek wirówkowych, wysusz próbki próżniowym koncentratorem odśrodkowym w temperaturze 45 stopni Celsjusza przez około jedną do 1,5 godziny. Na koniec ponownie zawiesić każdą z próbek z trzech frakcji w 200 mikrolitrach 100% metanolu przenieść do automatów, próbnika, fiolek i przechowywać w zamrażarce o temperaturze ujemnej 80 stopni Celsjusza.

Wykazano skuteczność metody M-T-B-E-S-P-E w ekstrakcji zarówno wzorców lipidowych, jak i endogennych metabolitów, ogólnie uzyskano lepszą ekstrakcję i pokrycie metabolitów w porównaniu z innymi metodami, takimi jak ekstrakcja metanolem lub ekstrakcja tylko MTBE, gdy liczbę cech porównano przy użyciu oprogramowania jakościowego i ilościowego. Po analizie lc MS porównanie frakcji M-T-B-E-S-P-E wykazało minimalne nakładanie się trzech frakcji następujących po SPE, co świadczy o skuteczności w rozdzielaniu metabolitów hydrofobowych na odpowiednie klasy chemiczne w celu pewniejszej identyfikacji metabolitów. Ponadto odzysk wzorców wewnętrznych we frakcjach metodą M-T-B-E-S-P-E, NR. 12 wykazał, że wzorce wewnętrzne zostały odniesione do frakcji odnoszącej się do ich klasy chemicznej.

Aby ocenić chromatograficzną odtwarzalność danych, preparat próbek przeprowadzono na trzech oddzielnych zbiorczych próbkach kontroli jakości osocza, a każdą próbkę wstrzyknięto w trzech egzemplarzach na przyrząd LCM MSS. Konsekwentne nakładanie się na siebie świadczy o odtwarzalności przygotowania przyrządu i próbki. Wzrost szumu chemicznego obserwowany dla ujemnego trybu jonizacji frakcji kwasów tłuszczowych może być spowodowany zanieczyszczeniami w rozpuszczalnikach LCM S.

W związku z tym analizowano tylko metabolity, które nawiązywały przed dziewięcioma minutami. Nie zapominaj, że praca z chloroformem, MTBE, eterem etylowym, a nawet bardziej powszechnymi odczynnikami stosowanymi w tej metodzie może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak noszenie fartucha laboratoryjnego, rękawic i ochrony oczu oraz przygotowywanie próbki w dygestorium.