Przygotowanie próbek ekstraktów z Mycobacterium tuberculosis do badań metabolomicznych magnetycznego rezonansu jądrowego

Profil metabolomiczny Mycobacterium tuberculosis jest określany po wzroście w kulturach bulionowych. Warunki można zmieniać, aby przetestować wpływ suplementów diety, utleniaczy i środków przeciwgruźliczych na profil metaboliczny tego mikroorganizmu. Procedura przygotowania ekstraktu ma zastosowanie zarówno do analiz 1D ¹H, jak i 2D ^{1 H-13}C NMR.

Celem tej procedury jest analiza prątków gruźlicy, ekstraktów bezkomórkowych za pomocą pierwszej hodowli metabolomicznej NMR, oraz pobranie komórek na odpowiednim etapie wzrostu. Następnie lisa komórek i uzyskaj ekstrakty bezkomórkowe do analizy. Ponownie zawiesić liofilizowane ekstrakty w buforze do analizy NMR.

Na koniec zbierz dane NMR i przeanalizuj widma za pomocą oprogramowania w celu identyfikacji metabolitów. Ostatecznie analiza NMR prątków gruźlicy jest stosowana w celu wykazania zachowanych poziomów metabolitów po różnych zabiegach. Metabolomika NMR może być stosowana do kluczowych aspektów fizjologii prątków gruźlicy, takich jak ważne szlaki metaboliczne.

Wiedza ta ma kluczowe znaczenie dla wyjaśnienia mechanizmów działania i oporności leków oraz dla zidentyfikowania nowych celów projektowania leków. Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej metodzie miałyby trudności z powodu niemożności obsługi wszystkich próbek dokładnie tak samo, co wprowadziłoby niepotrzebne zmiany i wyniki z mojego laboratorium. Doktorant Steven Luka zademonstruje procedury postępowania z próbkami do przetwarzania NMR Z mojego laboratorium kierownik laboratorium badawczego i Robert Fenton, technik badawczy trzy, zademonstrują teraz procedury postępowania z kulturami prątków gruźlicy podczas przeprowadzania gruźlicy M.

Badania były prowadzone zgodnie z praktykami trzeciego poziomu bezpieczeństwa biologicznego, określonymi w wytycznych instytucjonalnych. Chociaż etykiety w tym filmie mówią o gruźlicy drobnoustrojowej ze względu na bezpieczeństwo biologiczne, w tej demonstracji wykorzystano niepatogenne prątki magmowe. Zacznij od rozmrożenia 50% glicerolu gruźlicy M na lodzie.

Zaszczepić 0,15 mililitra w 110 mililitrach bulionu M-A-D-C-T-W w 250-mililitrowym ER, a moja kolba hoduje kultury w temperaturze 37 stopni Celsjusza z wytrząsaniem przy 100 obr./min przez około sześć dni. Jeśli nie ma antybiotyków, potrzebne są alternatywne dodatki lub inne leczenie. Zbierz kultury dla kultur wymagających zabiegów.

Zarezerwuj 0,5 mililitra Eloqua na lodzie do hodowli, miareczkowania i kontroli jakości. Następnie wykonaj żądany zabieg i umieść kultury z powrotem w wytrząsarce po okresie leczenia. Usuń jeden mililitr i określ OD 600.

Zarezerwuj również próbkę o wielkości 0,5 mililitra do hodowli, miareczkowania i kontroli jakości. Utrzymuj komórki na lodzie przez cały pozostały protokół. Zbierz komórki w czterech 50-mililitrowych probówkach przez odwirowanie po umyciu 15 mililitrami lodowatej wody podwójnie destylowanej.

Reese zawiesił granulki w 10-mililitrowych porcjach. Wyciągnąć dwie porcje i osad przez odwirowanie, a następnie ponownie zawiesić osad komórkowy w końcowej objętości jednego mililitra podwójnie destylowanej wody. Jeśli pożądana jest zawiesina pojedynczej komórki wolna od zbrylania, przepuść komórki przez igłę o rozmiarze 27.

Trzy razy przystąp do przenoszenia jednomililitrowej zawiesiny komórek do dwumililitrowej nakrętki zawierającej matrycę lizy B. Umieść szybko przygotowany homogenizator do lizy 24 w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Umieść próbki w uchwycie na próbki, zabezpieczając płytkę szprychy mocującej. Następnie przetwarzaj przez 60 sekund z prędkością sześć metrów na sekundę.

Następnie odwiruj próbki, aby osadzać resztki komórek i nienaruszone komórki. Następnie przepuścić supinat przez filtr strzykawkowy o grubości 0,2 mikrona do sterylnej probówki, aby kontrolować brak żywych komórek. Płytka 0,1 mililitra próbki na MADC. Agar.

Zamroź próbki w suchej kąpieli lodowej na etanolu i przechowuj w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, aż będą gotowe do liofilizacji i przetworzenia w urządzeniu NMR. Po dwóch miesiącach sprawdź płytki, aby sprawdzić, czy nie ma jednostek tworzących kolonie. Jeśli nie zostanie znaleziony żaden użytkownik mukowiscydozy, próbki mogą zostać pobrane z laboratorium BSL three do dalszej analizy w standardowym urządzeniu do NMR.

Po dopasowaniu próbek do suchości ponownie zamieszać w 0,7 mililitra buforu NMR i przenieść do wirówki z mikrowirówką na trzy minuty po 13 000 razy. G, usuń 0,6 mililitra i przenieś do pięciomilimetrowej probówki NMR. Na podstawie analizy mediów, dostosowany stojak ułatwia ładowanie wielu probówek NMR do przędzalników na odpowiedniej głębokości.

Następnie przenieś próbki do spektrometru NMR, aby włożyć je do A-B-A-C-S jednego podajnika próbek 20. Na przemian między kulturami nieleczonymi i leczonymi lekami. Pierwsza próbka musi zostać wstępnie załadowana do magnesu na początku automatycznego przebiegu.

Aby skalibrować instrument, zoptymalizuj długość impulsu 90 stopni dla pojedynczej próbki i dostrój instrument do pozostałych próbek. Użyj ikony NMR i podkładki gradowej. Zautomatyzuj podkładkowanie blokujące i zbieranie danych NMR dla każdej próbki.

Dla widma 1D hydrogen one NMR wybierz sekwencję impulsów z tłumieniem wody i rzeźbieniem wzbudzenia. Ustaw łącznie 32 000 punktów danych, 128 skanów i 16 skanów fikcyjnych dla widma dwóch DH i jednego C 13 hs QC. Wybierz sekwencję impulsów.

Wybierz łącznie 2048 punktów danych z szerokością przeciągnięcia wzdłuż jednego wymiaru bezpośredniego H i 64 punktami danych z szerokością przeciągnięcia wzdłuż pośredniego wymiaru C 13. Określ również zbieranie widma za pomocą 128 skanów i 16 skanów fikcyjnych, aby uzyskać dobry stosunek sygnału do szumu. Spektrum gruźlicy m wygenerowało około 400 pików, w tym 50 znanych metabolitów.

Na przykład, przetwarzanie danych szczegółowo opisane w dołączonym manuskrypcie wytworzyło to spektrum metabolitów, które są bezpośrednio lub pośrednio związane ze szlakiem D-alaniny. Wielkość szczytowych intensywności jest proporcjonalna do stężeń metabolitów obecnych w ekstrakcie komórkowym, dzięki czemu względne zaburzenia metabolitów i szlaków metabolicznych można określić ilościowo między próbkami a zabiegami. Metabolomika LMR toruje drogę badaniom w dziedzinie bakteriologii w celu zbadania fizjologii i patogenezy mikrobakterii wzrokowych i mikroorganizmów innych drobnoustrojów chorobotwórczych lub niepatogennych.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować ekstrakty z wielu komórek gruźlicy do metabolomiki NMR i, co ważne, zachować spójność w całym protokole, aby uzyskać wiarygodne wyniki.