Przygotowanie próbek ekstraktów z Mycobacterium tuberculosis do badań metabolomicznych magnetycznego rezonansu jądrowego
3 września 2012
Profil metabolomiczny Mycobacterium tuberculosis jest określany po wzroście w kulturach bulionowych. Warunki można zmieniać, aby przetestować wpływ suplementów diety, utleniaczy i środków przeciwgruźliczych na profil metaboliczny tego mikroorganizmu. Procedura przygotowania ekstraktu ma zastosowanie zarówno do analiz 1D 1H, jak i 2D 1 H-13C NMR.
Celem tej procedury jest analiza prątków gruźlicy, ekstraktów bezkomórkowych za pomocą pierwszej hodowli metabolomicznej NMR, oraz pobranie komórek na odpowiednim etapie wzrostu. Następnie lisa komórek i uzyskaj ekstrakty bezkomórkowe do analizy. Ponownie zawiesić liofilizowane ekstrakty w buforze do analizy NMR.
Na koniec zbierz dane NMR i przeanalizuj widma za pomocą oprogramowania w celu identyfikacji metabolitów. Ostatecznie analiza NMR prątków gruźlicy jest stosowana w celu wykazania zachowanych poziomów metabolitów po różnych zabiegach. Metabolomika NMR może być stosowana do kluczowych aspektów fizjologii prątków gruźlicy, takich jak ważne szlaki metaboliczne.
Wiedza ta ma kluczowe znaczenie dla wyjaśnienia mechanizmów działania i oporności leków oraz dla zidentyfikowania nowych celów projektowania leków. Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej metodzie miałyby trudności z powodu niemożności obsługi wszystkich próbek dokładnie tak samo, co wprowadziłoby niepotrzebne zmiany i wyniki z mojego laboratorium. Doktorant Steven Luka zademonstruje procedury postępowania z próbkami do przetwarzania NMR Z mojego laboratorium kierownik laboratorium badawczego i Robert Fenton, technik badawczy trzy, zademonstrują teraz procedury postępowania z kulturami prątków gruźlicy podczas przeprowadzania gruźlicy M.
Badania były prowadzone zgodnie z praktykami trzeciego poziomu bezpieczeństwa biologicznego, określonymi w wytycznych instytucjonalnych. Chociaż etykiety w tym filmie mówią o gruźlicy drobnoustrojowej ze względu na bezpieczeństwo biologiczne, w tej demonstracji wykorzystano niepatogenne prątki magmowe. Zacznij od rozmrożenia 50% glicerolu gruźlicy M na lodzie.
Zaszczepić 0,15 mililitra w 110 mililitrach bulionu M-A-D-C-T-W w 250-mililitrowym ER, a moja kolba hoduje kultury w temperaturze 37 stopni Celsjusza z wytrząsaniem przy 100 obr./min przez około sześć dni. Jeśli nie ma antybiotyków, potrzebne są alternatywne dodatki lub inne leczenie. Zbierz kultury dla kultur wymagających zabiegów.
Zarezerwuj 0,5 mililitra Eloqua na lodzie do hodowli, miareczkowania i kontroli jakości. Następnie wykonaj żądany zabieg i umieść kultury z powrotem w wytrząsarce po okresie leczenia. Usuń jeden mililitr i określ OD 600.
Zarezerwuj również próbkę o wielkości 0,5 mililitra do hodowli, miareczkowania i kontroli jakości. Utrzymuj komórki na lodzie przez cały pozostały protokół. Zbierz komórki w czterech 50-mililitrowych probówkach przez odwirowanie po umyciu 15 mililitrami lodowatej wody podwójnie destylowanej.
Reese zawiesił granulki w 10-mililitrowych porcjach. Wyciągnąć dwie porcje i osad przez odwirowanie, a następnie ponownie zawiesić osad komórkowy w końcowej objętości jednego mililitra podwójnie destylowanej wody. Jeśli pożądana jest zawiesina pojedynczej komórki wolna od zbrylania, przepuść komórki przez igłę o rozmiarze 27.
Trzy razy przystąp do przenoszenia jednomililitrowej zawiesiny komórek do dwumililitrowej nakrętki zawierającej matrycę lizy B. Umieść szybko przygotowany homogenizator do lizy 24 w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Umieść próbki w uchwycie na próbki, zabezpieczając płytkę szprychy mocującej. Następnie przetwarzaj przez 60 sekund z prędkością sześć metrów na sekundę.
Następnie odwiruj próbki, aby osadzać resztki komórek i nienaruszone komórki. Następnie przepuścić supinat przez filtr strzykawkowy o grubości 0,2 mikrona do sterylnej probówki, aby kontrolować brak żywych komórek. Płytka 0,1 mililitra próbki na MADC. Agar.
Zamroź próbki w suchej kąpieli lodowej na etanolu i przechowuj w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, aż będą gotowe do liofilizacji i przetworzenia w urządzeniu NMR. Po dwóch miesiącach sprawdź płytki, aby sprawdzić, czy nie ma jednostek tworzących kolonie. Jeśli nie zostanie znaleziony żaden użytkownik mukowiscydozy, próbki mogą zostać pobrane z laboratorium BSL three do dalszej analizy w standardowym urządzeniu do NMR.
Po dopasowaniu próbek do suchości ponownie zamieszać w 0,7 mililitra buforu NMR i przenieść do wirówki z mikrowirówką na trzy minuty po 13 000 razy. G, usuń 0,6 mililitra i przenieś do pięciomilimetrowej probówki NMR. Na podstawie analizy mediów, dostosowany stojak ułatwia ładowanie wielu probówek NMR do przędzalników na odpowiedniej głębokości.
Następnie przenieś próbki do spektrometru NMR, aby włożyć je do A-B-A-C-S jednego podajnika próbek 20. Na przemian między kulturami nieleczonymi i leczonymi lekami. Pierwsza próbka musi zostać wstępnie załadowana do magnesu na początku automatycznego przebiegu.
Aby skalibrować instrument, zoptymalizuj długość impulsu 90 stopni dla pojedynczej próbki i dostrój instrument do pozostałych próbek. Użyj ikony NMR i podkładki gradowej. Zautomatyzuj podkładkowanie blokujące i zbieranie danych NMR dla każdej próbki.
Dla widma 1D hydrogen one NMR wybierz sekwencję impulsów z tłumieniem wody i rzeźbieniem wzbudzenia. Ustaw łącznie 32 000 punktów danych, 128 skanów i 16 skanów fikcyjnych dla widma dwóch DH i jednego C 13 hs QC. Wybierz sekwencję impulsów.
Wybierz łącznie 2048 punktów danych z szerokością przeciągnięcia wzdłuż jednego wymiaru bezpośredniego H i 64 punktami danych z szerokością przeciągnięcia wzdłuż pośredniego wymiaru C 13. Określ również zbieranie widma za pomocą 128 skanów i 16 skanów fikcyjnych, aby uzyskać dobry stosunek sygnału do szumu. Spektrum gruźlicy m wygenerowało około 400 pików, w tym 50 znanych metabolitów.
Na przykład, przetwarzanie danych szczegółowo opisane w dołączonym manuskrypcie wytworzyło to spektrum metabolitów, które są bezpośrednio lub pośrednio związane ze szlakiem D-alaniny. Wielkość szczytowych intensywności jest proporcjonalna do stężeń metabolitów obecnych w ekstrakcie komórkowym, dzięki czemu względne zaburzenia metabolitów i szlaków metabolicznych można określić ilościowo między próbkami a zabiegami. Metabolomika LMR toruje drogę badaniom w dziedzinie bakteriologii w celu zbadania fizjologii i patogenezy mikrobakterii wzrokowych i mikroorganizmów innych drobnoustrojów chorobotwórczych lub niepatogennych.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować ekstrakty z wielu komórek gruźlicy do metabolomiki NMR i, co ważne, zachować spójność w całym protokole, aby uzyskać wiarygodne wyniki.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
To badanie koncentruje się na analizie profilu metabolomowego Mycobacterium tuberculosis za pomocą metabolomiki NMR. Procedura polega na hodowaniu bakterii w hodowlach bulionowych i przygotowaniu ekstrakcji wolnych od komórek do analizy.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Metabolomika
- Mikrobiologia
- Mycobacterium tuberculosis
Tło
- Mycobacterium tuberculosis jest znaczącym patogenem odpowiedzialnym za gruźlicę.
- Zrozumienie jego profilu metabolicznego może dostarczyć wglądu w jego fizjologię.
- Metabolomika NMR jest potężnym narzędziem do analizy metabolitów.
- Różnice w warunkach wzrostu mogą wpływać na profile metaboliczne.
Cel badania
- Analiza profilu metabolicznego Mycobacterium tuberculosis.
- Ocena wpływu suplementów żywieniowych i terapii na metabolizm.
- Wykorzystanie analizy NMR do identyfikacji metabolitów w ekstraktach wolnych od komórek.
Zastosowane metody
- Hodowla Mycobacterium tuberculosis w bulionie.
- Zbiór komórek na odpowiednim etapie wzrostu.
- Lizys komórek w celu uzyskania ekstrakcji wolnych od komórek.
- Resuspendowanie ekstraktów w buforze do analizy NMR.
Główne wyniki
- Analiza NMR ujawnia zmiany w poziomach metabolitów po różnych zabiegach.
- Identyfikacja kluczowych ścieżek metabolicznych wpływanych przez różne warunki.
- Wykazanie przydatności metabolomiki NMR w badaniu Mycobacterium tuberculosis.
- Wgląd w fizjologiczne aspekty bakterii.
Wnioski
- Metabolomika NMR jest skuteczna w analizie Mycobacterium tuberculosis.
- Różnice w warunkach wzrostu znacząco wpływają na profile metaboliczne.
- To podejście może zwiększyć zrozumienie metabolizmu gruźlicy.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Robust metabolomic profiling of Mycobacterium tuberculosis extracts using NMR enables high-confidence interrogation of metabolic pathways under drug treatment and genetic perturbation. This workflow supports target validation and mechanistic de-risking at the discovery stage, directly informing lead identification and prioritization for anti-tubercular drug development. Reliable, quantitative metabolite data enhances predictive confidence and translational continuity across the early discovery pipeline.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative comparison of metabolic profiles between wild-type and mutant strains under various treatments.
- Supports identification of metabolic pathway perturbations linked to drug action or resistance mechanisms.
- Facilitates functional target validation by correlating gene or protein changes with metabolite shifts.
- Provides mechanistic de-risking by clarifying downstream biological effects of candidate interventions.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, reproducible sample preparation for NMR-based metabolite quantification.
- Generates high-quality, quantitative outputs suitable for screening compound effects on bacterial metabolism.
- Enables assay scalability and platform reuse for diverse experimental conditions and compound libraries.
- Supports reliable evaluation of metabolic responses to drug candidates.
Translational & Preclinical Research
- Aligns metabolic readouts with disease-relevant pathways for translational biomarker exploration.
- Provides continuity from discovery-stage metabolic insights to preclinical validation of drug effects.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on quantitative metabolic perturbations.
- Supports predictive de-risking for candidate selection in tuberculosis drug pipelines.
Pipeline & Workflow Integration
This NMR metabolomics workflow integrates from early discovery through lead identification and preclinical research, supporting hypothesis-driven target validation and mechanistic studies.
- Discovery Biology: Quantitative metabolite profiling clarifies pathway engagement and biological response to interventions.
- Screening: Standardized sample preparation and NMR analysis enable reproducible, quantitative assay outputs.
- Analytics: High-resolution spectra and statistical analysis facilitate robust comparison of metabolic states across conditions.
- Translational Research: Metabolite data inform biomarker alignment and disease relevance for preclinical models.
- Enterprise Reuse: The protocol is adaptable for parallel proteomic analysis and scalable across multiple experimental designs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable metabolomics workflows.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk in anti-tubercular portfolios.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of drug candidates targeting M. tuberculosis.
Implementation Considerations
- Requires expertise in biosafety level 3 handling and NMR metabolomics.
- Demands access to high-field NMR instrumentation and analytical software.
- Necessitates rigorous cross-team standardization to minimize sample variation.
- Adaptable for use with other mycobacterial or microbial systems with protocol modifications.
- Sample consistency and biosafety compliance are critical for reliable, actionable data.
