Name: Przygotowanie próbek ekstraktów z Mycobacterium tuberculosis do badań metabolomicznych magnetycznego rezonansu jądrowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: Naucz się przygotowywać ekstrakty komórkowe z Mycobacterium tuberculosis do analizy metabolomicznej metodą NMR. Procedura obejmuje hodowlę, lizę i liofilizację próbek, co pozwala identyfikować metabolity i badać szlaki metaboliczne bakterii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować wszystkim członkom laboratoriów dr. Barletty i dr. Powers za pomocne uwagi podczas opracowywania protokołu. Dziękujemy Wendy Austin za pomocne dyskusje i korektę rękopisu. Praca opisana w niniejszym manuskrypcie była finansowana z pilotażowych grantów zasiewowych przyznanych każdemu z wymienionych powyżej badaczy przez University of Nebraska-Lincoln Redox Biology Center (grant nadrzędny #NCRR 2P20RR 017675, D. Becker, P.I.). Ponadto dziękujemy dr Ofelii Chacon za zapewnienie środków z jej grantu R21 (1R21AI087561-01A1) na materiały badawcze oraz częściowe dofinansowanie wynagrodzenia pana Halouski w celu standaryzacji technik NMR zawartych w niniejszej publikacji.

<ol><li>Larsen, M. H., Biermann, K., Tandberg, S., Hsu, T., Jacobs, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+Manipulation+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Genetic Manipulation of Mycobacterium tuberculosis.</a> Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 10, 2(2007).</li>
<li>Larsen, M. H., Biermann, K., Jacobs, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+Maintenance+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Laboratory Maintenance of Mycobacterium tuberculosis.</a> Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 10, 1(2007).</li>
<li>Clarridge, J. E. 3rd, Shawar, R. M., Shinnick, T. M., Plikaytis, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+use+of+polymerase+chain+reaction+for+detection+of+Mycobacterium+tuberculosis+in+a+routine+mycobacteriology+laboratory%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Large-scale use of polymerase chain reaction for detection of Mycobacterium tuberculosis in a routine mycobacteriology laboratory.</a> J. Clin. Microbiol. 31, 2049-2056 (1993).</li>
<li>Nguyen, B. D., Meng, X., Donovan, K. J., Shaka, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SOGGY%3A+solvent-optimized+double+gradient+spectroscopy+for+water+suppression.+A+comparison+with+some+existing+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Magn.+Reson%22%5BJournal%5D)">SOGGY: solvent-optimized double gradient spectroscopy for water suppression. A comparison with some existing techniques.</a> J. Magn. Reson. 184, 263-274 (2007).</li>
<li>Cui, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolite+identification+via+the+Madison+Metabolomics+Consortium+Database%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Metabolite identification via the Madison Metabolomics Consortium Database.</a> Nat. Biotechnol. 26, 162-164 (2008).</li>
<li>Ulrich, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BioMagResBank%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">BioMagResBank.</a> Nucleic Acids Res. 36, 402-408 (2008).</li>
<li>Wishart, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HMDB%3A+the+Human+Metabolome+Database%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">HMDB: the Human Metabolome Database.</a> Nucleic Acids Res. 35, 521-526 (2007).</li>
<li>Kanehisa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KEGG+for+linking+genomes+to+life+and+the+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">KEGG for linking genomes to life and the environment.</a> Nucleic Acids Res. 36, 480-484 (2008).</li>
<li>Karp, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+of+the+BioCyc+collection+of+pathway%2Fgenome+databases+to+160+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Expansion of the BioCyc collection of pathway/genome databases to 160 genomes.</a> Nucleic Acids Res. 33, 6083-6089 (2005).</li>
<li>Halouska, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+NMR+metabolomics+to+analyze+the+targets+of+D-cycloserine+in+mycobacteria%3A+role+of+D-alanine+racemase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome.+Res%22%5BJournal%5D)">Use of NMR metabolomics to analyze the targets of D-cycloserine in mycobacteria: role of D-alanine racemase.</a> J. Proteome. Res. 6, 4608-4614 (2007).</li>
<li>Boshoff, H. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcriptional+responses+of+Mycobacterium+tuberculosis+to+inhibitors+of+metabolism%3A+novel+insights+into+drug+mechanisms+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The transcriptional responses of Mycobacterium tuberculosis to inhibitors of metabolism: novel insights into drug mechanisms of action.</a> J. Biol. Chem. 279, 40174-40184 (2004).</li>
<li>Mehaffy, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Descriptive+proteomic+analysis+shows+protein+variability+between+closely+related+clinical+isolates+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Descriptive proteomic analysis shows protein variability between closely related clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis.</a> Proteomics. 10, 1966-1984 (2010).</li>
<li>Schnappinger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+Adaptation+of+Mycobacterium+tuberculosis+within+Macrophages%3A+Insights+into+the+Phagosomal+Environment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Transcriptional Adaptation of Mycobacterium tuberculosis within Macrophages: Insights into the Phagosomal Environment.</a> J. Exp. Med. 198, 693-704 (2003).</li>
<li>Schnappinger, D., Schoolnik, G. K., Ehrt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+profiling+of+host+pathogen+interactions%3A+how+Mycobacterium+tuberculosis+and+the+macrophage+adapt+to+one+another%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes.+Infect%22%5BJournal%5D)">Expression profiling of host pathogen interactions: how Mycobacterium tuberculosis and the macrophage adapt to one another.</a> Microbes. Infect. 8, 1132-1140 (2006).</li>
<li>Shui, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+proteomic+profiling+of+host-pathogen+interactions%3A+the+macrophage+response+to+Mycobacterium+tuberculosis+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome.+Res%22%5BJournal%5D)">Quantitative proteomic profiling of host-pathogen interactions: the macrophage response to Mycobacterium tuberculosis lipids.</a> J. Proteome. Res. 8, 282-289 (2009).</li>
<li>Talaat, A. M., Lyons, R., Howard, S. T., Johnston, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+temporal+expression+profile+of+Mycobacterium+tuberculosis+infection+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">The temporal expression profile of Mycobacterium tuberculosis infection in mice.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 4602-4607 (2004).</li>
<li>Forgue, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMR+metabolic+profiling+of+Aspergillus+nidulans+to+monitor+drug+and+protein+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">NMR metabolic profiling of Aspergillus nidulans to monitor drug and protein activity.</a> J. Proteome Res. 5, 1916-1923 (2006).</li>
<li>Goodacre, R., Vaidyanathan, S., Dunn, W. B., Harrigan, G. G., Kell, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomics+by+numbers%3A+acquiring+and+understanding+global+metabolite+data%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Metabolomics by numbers: acquiring and understanding global metabolite data.</a> Trends Biotechnol. 22, 245-252 (2004).</li>
<li>Shin, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMR-based+Metabolomic+Profiling+in+Mice+Infected+with+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">NMR-based Metabolomic Profiling in Mice Infected with Mycobacterium tuberculosis.</a> J. Proteome Res. 10, 2238-2247 (2011).</li>
<li>Jaki, B. U., Franzblau, S. G., Cho, S. H., Pauli, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+extraction+method+for+mycobacterial+metabolome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharm.+Biomed.+Anal%22%5BJournal%5D)">Development of an extraction method for mycobacterial metabolome analysis.</a> J. Pharm. Biomed. Anal. 41, 196-200 (2006).</li>
<li>de Carvalho, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomics+of+Mycobacterium+tuberculosis+reveals+compartmentalized+co-catabolism+of+carbon+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Metabolomics of Mycobacterium tuberculosis reveals compartmentalized co-catabolism of carbon substrates.</a> Chem. Biol. 17, 1122-1131 (2010).</li>
<li>de Carvalho, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-based+metabolomic+profiling+of+enzymatic+function%3A+identification+of+Rv1248c+as+a+mycobacterial+2-hydroxy-3-oxoadipate+synthase%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Activity-based metabolomic profiling of enzymatic function: identification of Rv1248c as a mycobacterial 2-hydroxy-3-oxoadipate synthase.</a> Chem. Biol. 17, 323-332 (2010).</li>
<li>Marrero, J., Rhee, K. Y., Schnappinger, D., Pethe, K., Ehrt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gluconeogenic+carbon+flow+of+tricarboxylic+acid+cycle+intermediates+is+critical+for+Mycobacterium+tuberculosis+to+establish+and+maintain+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Gluconeogenic carbon flow of tricarboxylic acid cycle intermediates is critical for Mycobacterium tuberculosis to establish and maintain infection.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 9819-9824 (2010).</li>
<li>Tang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+metabolism+in+Mycobacterium+smegmatis+during+the+transition+from+O2-rich+to+O2-poor+conditions+as+studied+by+isotopomer-assisted+metabolite+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Central metabolism in Mycobacterium smegmatis during the transition from O2-rich to O2-poor conditions as studied by isotopomer-assisted metabolite analysis.</a> Biotechnol. Lett. 31, 1233-1240 (2009).</li>
<li>Kweon, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+polyomic+approach+to+elucidate+the+fluoranthene-degradative+pathway+in+Mycobacterium+vanbaalenii+PYR-1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">A polyomic approach to elucidate the fluoranthene-degradative pathway in Mycobacterium vanbaalenii PYR-1.</a> J. Bacteriol. 189, 4635-4647 (2007).</li>
<li>Hasan, M. R., Rahman, M., Jaques, S., Purwantini, E., Daniels, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+6-phosphate+accumulation+in+mycobacteria%3A+implications+for+a+novel+F420-dependent+anti-oxidant+defense+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Glucose 6-phosphate accumulation in mycobacteria: implications for a novel F420-dependent anti-oxidant defense system.</a> J. Biol. Chem. 285, 19135-19144 (2010).</li>
<li>Soga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+metabolome+analysis+using+capillary+electrophoresis+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Quantitative metabolome analysis using capillary electrophoresis mass spectrometry.</a> J. Proteome Res. 2, 488-494 (2003).</li>
<li>Metz, T. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+future+of+liquid+chromatography-mass+spectrometry+%28LC-MS%29+in+metabolic+profiling+and+metabolomic+studies+for+biomarker+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Biomark+Med%22%5BJournal%5D)">The future of liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) in metabolic profiling and metabolomic studies for biomarker discovery.</a> Biomark Med. 1, 159-185 (2007).</li>
<li>Ludwig, C., Viant, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+J-resolved+NMR+spectroscopy%3A+review+of+a+key+methodology+in+the+metabolomics+toolbox%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochem.+Anal%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional J-resolved NMR spectroscopy: review of a key methodology in the metabolomics toolbox.</a> Phytochem. Anal. 21, 22-32 (2010).</li>
<li>Simpson, R. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSimpson%2C+RJ+%22Proteins+and+Proteomics%3A+A+Laboratory+Manual%22">Proteins and Proteomics: A Laboratory Manual</a>. Inglis, J. , Cold Spring Laboratory Press. 425-595 (2003).</li>
<li>Beste, D. J., McFadden, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((System-level+strategies+for+studying+the+metabolism+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biosyst%22%5BJournal%5D)">System-level strategies for studying the metabolism of Mycobacterium tuberculosis.</a> Mol. Biosyst. 6, 2363-2372 (2010).</li>
<li>Rhee, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+carbon+metabolism+in+Mycobacterium+tuberculosis%3A+an+unexpected+frontier%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Central carbon metabolism in Mycobacterium tuberculosis: an unexpected frontier.</a> Trends Microbiol. , (2011).</li>
<li>Who. Health Organization. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Anti-tuberculosis+Drug+Resistance+in+the+World%3A+Report+No.+4%22">Anti-tuberculosis Drug Resistance in the World: Report No. 4</a>. , (2008).</li>
<li>Jassal, M., Bishai, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensively+drug-resistant+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Extensively drug-resistant tuberculosis.</a> Lancet Infect Dis. 9, 19-30 (2009).</li>
</ol>

Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.

Znaczna liczba badań przeanalizowała profile transkrypcyjne i proteomiczne M. tuberculosis w różnych warunkach in vitro oraz in vivo.11-16 W rezultacie zmiany w ekspresji genów i aktywności enzymów prowadzą do wahań stężeń cząsteczek o niskiej masie cząsteczkowej. Pełny opis tych związków stanowi metabolom. Zatem wpływ leków i zróżnicowanych warunków wzrostu na szlaki metaboliczne można śledzić za pomocą analizy metabolomicznej.17,18 Nieliczne badania wykorzystały tę metod...

<table><tbody><tr><td>Suplement ADC</td><td>BD BBL Middlebrook</td><td>212352</td><td></td></tr><tr><td>Próbnik BACS-120</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spektrometr NMR Bruker Avance</td><td>Bruker</td><td></td><td>500 MHz</td></tr><tr><td>Seryjna albumina wołowa</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1600-100</td><td>Frakcja V</td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Beckman Coulter</td><td>Allegra X-15R</td><td>Nastolna</td></tr><tr><td>Probówki do wirowania</td><td>Corning</td><td>430291</td><td>50 ml, sterylne, polipropylenowe</td></tr><tr><td>Probówki kriogeniczne</td><td>Corning</td><td>430488</td><td>2,0 ml, sterylne, polipropylenowe</td></tr><tr><td>Cykloheksymida</td><td>A.G. Scientific</td><td>C-1189</td><td>Toksyczna</td></tr><tr><td>D(+) - Glukoza</td><td>ACROS</td><td>41095-0010</td><td></td></tr><tr><td>Tlenek deuteru</td><td>Sigma Aldrich</td><td>617385</td><td></td></tr><tr><td>Kolba Erlenmeyera</td><td>VWR</td><td>89095-266</td><td>Sterylna, płaskie dno, poliwęglanowa, korek z membraną PTFE 0,22 &amp;mu;m</td></tr><tr><td>Kolba do szybkiego mrożenia</td><td>VWR</td><td>82018-226</td><td>750 ml</td></tr><tr><td>Liofilizator</td><td>VWR</td><td>82019-038</td><td>4,5 L, nastolny</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>GibcoBRL</td><td>15514-029</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>New Brunswick</td><td>Innova 40</td><td>Mieszadło nastolne</td></tr><tr><td>Matryca do lizy B</td><td>MP Biomedicals</td><td>6911-100</td><td></td></tr><tr><td>Urządzenie do lizy</td><td>MP Biomedicals</td><td>FastPrep-24</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowirówka</td><td>Eppendorf</td><td>5415D</td><td>Nastolna</td></tr><tr><td>Mikrowirówka</td><td>Beckman Coulter</td><td>Microfuge 22R</td><td>Nastolna</td></tr><tr><td>Pożywka Middlebrook 7H9</td><td>Difco</td><td>271310</td><td></td></tr><tr><td>Probówki NMR</td><td>Norell</td><td>ST500-7</td><td>5mM</td></tr><tr><td>Suplement OADC</td><td>BD BBL Middlebrook</td><td>212351</td><td></td></tr><tr><td>Kwas oleinowy</td><td>Sigma</td><td>O1008</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan dwuzasadowy potasu</td><td>VWR</td><td>BDH0266</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan jednozasadowy potasu</td><td>VWR</td><td>BDH0268</td><td></td></tr><tr><td>Rotor - Microfuge 22R</td><td>Beckman Coulter</td><td>F241.5P</td><td>Szczelny, polipropylenowy</td></tr><tr><td>Rotor - Allegra X-15R</td><td>Beckman Coulter</td><td>SX4750</td><td>Z certyfikowanymi osłonami biologicznymi</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-3</td><td></td></tr><tr><td>Sód-3-trimetylosililopropionian-2,2,3,3-D4</td><td>Cambridge Isotope</td><td>DLM-48</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr</td><td>Beckman Coulter</td><td>DU-530</td><td></td></tr><tr><td>Kuwety spektrofotometryczne</td><td>LifeLINE</td><td>LS-2410</td><td>1,5 ml, polistyrenowe, 2 przezroczyste ścianki</td></tr><tr><td>Strzykawka</td><td>Becton Dickinson</td><td>309585</td><td>Sterylna, 3 ml Luer-Lok</td></tr><tr><td>Filtr strzykawkowy</td><td>Nalgene</td><td>190-2520</td><td>0,2 &amp;mu;m, sterylny octan celulozy</td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP338-500</td><td></td></tr></tbody></table>

przygotowanie próbek ekstraktów z mycobacterium tuberculosis do metabolomicznych badań metodą rezonansu magnetycznego jądra

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

Mycobacterium tuberculosis jest główną przyczyną śmiertelności ludzi w skali globalnej. Pojawienie się szczepów wielolekoopornych (MDR) oraz ekstremalnie lekoopornych (XDR) grozi zahamowaniem obecnych wysiłków w zakresie kontroli tej choroby. W związku z tym istnieje pilna potrzeba opracowania leków i szczepionek, które byłyby bardziej skuteczne niż te obecnie dostępne. Genom M. tuberculosis jest znany od ponad 10 lat, jednak wciąż istnieją istotne luki w naszej wiedzy na temat funkcji i niezbędności genów. W wielu badaniach wykorzystano analizę ekspresji genów na poziomie transkrypcyjnym i proteomicznym, aby określić wpływ leków, utleniaczy i warunków wzrostu na globalne wzorce ekspresji genów. Ostatecznie końcowa odpowiedź na te zmiany odzwierciedlona jest w składzie metabolicznym bakterii, obejmującym kilka tysięcy związków o niskiej masie cząsteczkowej. Porównanie profili metabolicznych szczepów typu dzikiego i mutantów, nieleczonych lub leczonych konkretnym lekiem, może skutecznie umożliwić identyfikację celu i doprowadzić do opracowania nowych inhibitorów o działaniu przeciwgruźliczym. Podobnie można oceniać wpływ dwóch lub więcej warunków na metabolom. Magnetyczny rezonans jądrowy (NMR) jest potężną technologią wykorzystywaną do identyfikacji i ilościowego określania produktów pośrednich metabolizmu. W niniejszym protokole opisano procedury przygotowania ekstraktów komórkowych M. tuberculosis do analizy metabolomicznej metodą NMR. Hodowle komórkowe są prowadzone w odpowiednich warunkach i wymagają izolacji na poziomie bezpieczeństwa biologicznego 3 (Biosafety Level 3),1 zbierane, a następnie poddawane lizie mechanicznej w niskich temperaturach w celu maksymalnego zachowania metabolitów. Lizaty komórkowe są odzyskiwane, filtrowane w celu sterylizacji i przechowywane w ultra-niskich temperaturach. Alikwoty z tych ekstraktów komórkowych są wysiewane na agar Middlebrooka 7H9 w celu oznaczenia jednostek tworzących kolonie, aby zweryfikować brak żywych komórek. Po dwóch miesiącach inkubacji w 37 °C, jeśli nie zaobserwowano żywych kolonii, próbki są wywożone z zaplecza izolacyjnego do dalszego przetwarzania. Ekstrakty są liofilizowane, resuspenderowane w buforze deuterowanym i wstrzykiwane do urządzenia NMR, co pozwala na zarejestrowanie danych spektroskopowych, które następnie poddawane są analizie statystycznej. Opisane procedury mogą być stosowane zarówno dla jednowymiarowych (1D) analiz 1H NMR, jak i dwuwymiarowych (2D) analiz 1H-13C NMR. Metodyka ta zapewnia bardziej niezawodną identyfikację metabolitów o niskiej masie cząsteczkowej oraz bardziej wiarygodne i czułe analizy ilościowe składu metabolicznego ekstraktów komórkowych niż metody chromatograficzne. Wariacje opisanej procedury następujące po etapie lizy komórek mogą zostać również dostosowane do równoległej analizy proteomicznej.

Profil metabolomiczny Mycobacterium tuberculosis jest określany po hodowli w pożywkach płynnych. Warunki mogą być modyfikowane w celu zbadania wpływu suplementów odżywczych, utleniaczy oraz leków przeciwgruźliczych na profil metaboliczny tego mikroorganizmu. Procedura przygotowania ekstraktu jest odpowiednia zarówno dla analiz NMR 1D 1H, jak i 2D 1H-13C.

Przygotowanie próbek ekstraktów z Mycobacterium tuberculosis do metabolomicznych badań metodą rezonansu magnetycznego jądra

*Mycobacterium tuberculosis* jest główną przyczyną śmiertelności ludzi w skali globalnej. Pojawienie się szczepów zarówno wielolekoopornych (MDR), jak i szerokolekoopornych (XDR)...

Celem niniejszej procedury jest analiza ekstraktów bezkomórkowych z Mycobacterium tuberculosis za pomocą metabolomiki NMR poprzez pierwszą hodowlę i zbiorowanie komórek na odpowiednim etapie wzrostu. Następnie należy zlizować komórki i uzyskać ekstrakty bezkomórkowe do analizy. Zliofilizowane ekstrakty należy resuspendować w buforze do analizy NMR.Na koniec należy zebrać dane NMR i przeanalizować widma za pomocą oprogramowania w celu zidentyfikowania metabolitów. W ostateczności analiza NMR mycobacterium tuberculosis jest wykorzystywana do wykazania zachowania poziomów metabolitów po różnych zabiegach. Metabolomika NMR może być zastosowana do kluczowych aspektów fizjologii mycobacterium tuberculosis, takich jak istotne szlaki metaboliczne.Zrozumienie to jest kluczowe dla wyjaśnienia mechanizmów działania leków oraz mechanizmów oporności, a także dla zidentyfikowania nowych celów w projektowaniu leków. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności ze względu na brak możliwości identycznego potraktowania wszystkich próbek, co wprowadza niepotrzebną zmienność do wyników z mojego laboratorium. Steven Luka, doktorant, zaprezentuje procedury przygotowania próbek d

sample-preparation-mycobacterium-tuberculosis-extracts-for-nuclear

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Przygotowanie próbek Mycobacterium tuberculosis do badań metabolomiki rezonansem magnetycznym jąder atomowych

Przedstawiono metodę ekstrakcji metabolitów z planktonicznych społeczności drobnoustrojów. Pobieranie próbek całej społeczności realizowane jest poprzez filtrację na specjalnie przygotowanych filtrach. Po liofilizacji ekstrahowane są metabolity rozpuszczalne w wodzie. Podejście to umożliwia zastosowanie metabolomiki środowiskowej w badaniach trans-omicznych naturalnych lub eksperymentalnych społeczności drobnoustrojów.

Koncentracja metabolitów z planktonicznych zbiorowisk o niskiej gęstości do metabolomiki środowiskowej z wykorzystaniem spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego

Ten film opisuje technikę przygotowania próbek komórek raka piersi do profilowania metabolitów. Komórki raka piersi leczy się estradiolem, który wiąże się z receptorem estrogenowym alfa i powoduje zmianę składu metabolitów.

Przygotowanie próbek do metabolomiki: metoda przygotowania próbek komórek do profilowania metabolitów

Neurochemia mózgu ssaków ulega zmianie w wielu chorobach neurologicznych i ogólnoustrojowych. Profile charakterystyczne metabolitów mózgowych można skutecznie uzyskać na podstawie surowych ekstraktów tkanki mózgowej. W tym celu stosuje się wysokorozdzielczą spektroskopię NMR, umożliwiającą szczegółową analizę ilościową stężeń metabolitów (metabolomika).

Analiza metabolomiczna mózgu szczura za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego o wysokiej rozdzielczości ekstraktów tkankowych

Ten artykuł przedstawia zastosowanie PSYCHE i SAPPHIRE-PSYCHE w profilowaniu metabolicznym roślin i zawiera szczegółowe procedury przygotowania próbek i optymalnego zapisu widm NMR Pure Shift. Omówiono przykłady, dzięki którym przyrost rozdzielczości osiągnięty przez rozprzęganie homojądrowe pozwala na pełniejsze zrozumienie systemu.

Magnetyczny rezonans jądrowy z czystym przesunięciem: nowe narzędzie do metabolomiki roślin

W tym protokole prezentujemy zoptymalizowany przepływ pracy, który łączy w sobie efektywne i szybkie przygotowanie wielu próbek. Ponadto udostępniamy przewodnik krok po kroku, jak zmniejszyć odchylenia analityczne w celu wysokoprzepustowej oceny metabolicznych badań GWAS.

Large-Scale Multi-Omimic Genome-Wide Association Studies (Mo-GWAS): Wytyczne dotyczące przygotowania i normalizacji próbek

Ten protokół opisuje chromatografię wykluczania rozmiaru, łatwą i powtarzalną technikę wzbogacania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych Mycobacterium tuberculosis z supernatantów hodowli.

Mycobacterium tuberculosis (prątki gruźlicy) Wzbogacanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych za pomocą chromatografii wykluczania wielkości

Spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) służy do wykrywania dysregulacji metabolitów u pacjentów z różnymi chorobami. Technika ta pozwala na ilościowe określenie zaburzonych metabolitów, odkrywając patofizjologiczne wglądy. W tym miejscu opisujemy krok po kroku procedurę podejścia opartego na NMR w celu charakterystyki metabolicznej pacjentów.

Identyfikacja i kwantyfikacja metabolitów zaburzonych u pacjentów w stanie krytycznym przy użyciu metabolomiki opartej na NMR

Protokół ten rozdziela nierozpuszczalne białka ściany komórkowej i błony na proste frakcje (1-5 białek) za pomocą preparatywnego ogniskowania izoelektrycznego (IEF) opartego na punkcie izoelektrycznym, a następnie rozdzielania według masy cząsteczkowej. Otrzymane frakcje można wykorzystać bezpośrednio do analizy immunologicznej i proteomicznej bez dalszego oczyszczania.

Separacja i frakcjonowanie białek ściany komórkowej i błony komórkowej z Mycobacterium tuberculosis do dalszej analizy białek

Protokół ten pokazuje, że bicie koralików w połączeniu z oczyszczaniem kulek wychwytywania DNA zapewnia szybką i spójną metodę ekstrakcji DNA z próbek Mycobacterium tuberculosis , co czyni ją skutecznym wyborem do zastosowań sekwencjonowania nowej generacji.

Ekstrakcja DNA prątków za pomocą bicia kulek w niestandardowym buforze, a następnie przepływu pracy NGS

Protokół ten opisuje metodę CTAB polegającą na wydobyciu wysokiej jakości DNA z mykobakterii, pokonując wyzwania związane z ich twardymi, bogatymi w kwas grzybniczy ściany komórkowe. Proces obejmuje trawienie enzymatyczne, lizę komórek za pomocą CTAB oraz oczyszczanie DNA poprzez ekstrakcję organiczną i wytrącanie etanolem. Ta metoda wytwarza DNA odpowiednie do badań molekularnych i jest wiarygodna w badaniach mykobakterialnych.

Ekstrakcja deoksyrybonukleinowym w całym genomie z gatunków Mycobacterium za pomocą techniki bromku cetylotrymetylamoniowego

Naucz się przygotowywać ekstrakty komórkowe z Mycobacterium tuberculosis do analizy metabolomicznej metodą NMR. Procedura obejmuje hodowlę, lizę i liofilizację próbek, co pozwala identyfikować metabolity i badać szlaki metaboliczne bakterii.

Przygotowanie próbek ekstraktów z Mycobacterium tuberculosis do metabolomicznych badań metodą rezonansu magnetycznego jądra

Przeglądaj więcej filmów