Izolacja aksoplazmy z nerwu kulszowego szczura

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie czystego cytoplazmy aksonalnej lub ektoplazmy z nerwu obwodowego. Osiąga się to najpierw poprzez wypreparowanie nerwu kulszowego. Drugim krokiem procedury jest usunięcie tkanki łącznej z nerwu i oddzielenie sles.

Trzecim krokiem procedury jest inkubacja krótkich odcinków włókien nerwowych w medium hipotonicznym. Ostatnim krokiem procedury jest inkubacja w roztworze izotonicznym, wirowanie i homogenizacja. W rezultacie można uzyskać wyniki wykazujące wysoki stopień wzbogacenia w komponenty aksonalne w analizie western blot.

Witajcie, nazywam się Elle Rosenbaum. Reprezentujemy laboratorium profesora Mike'a F. Labora z Katedry Chemii Biologicznej w Instytucie Nauki. Dzisiaj zaprezentujemy nową technikę oksy-metylacji.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu do istniejących metod, takich jak manualne wyciskanie OIS nerwu obwodowego, jest fakt, że procedura ta ogranicza zanieczyszczenie surowicą i tkanką łączną treści aksonalnej. Wykorzystaliśmy tę nową technikę do metylacji op PLAs w celu zbadania sygnalizacji wstecznej zależnej od D po uszkodzeniu nerwu kulszowego.

Zacznijmy. Umieść jednego z dwóch uśpionych szczurów szczepu Wistar w wieku od 8 do 10 tygodni na boku na macie sekcyjnej, aby uzyskać bezpośredni dostęp do dystalnej części nerwu kulszowego. Ogól skórę w połowie uda i dokładnie przemyj 70% ethanol.

Za pomocą nożyczek odetnij skórę z uda. Ostrożnie przetnij tkankę tłuszczową i łączną między mięśniem dwugłowym uda a mięśniem pośladkowym powierzchownym. Używając pęsety, unieś odsłonięty odcinek nerwu kulszowego i usuń go.

Wycięty fragment będzie miał długość około 1,5 centymetra. Przenieś nerw do probówki do mikrocentryfugi zawierającej 500 µL lodowatego 2X PBS z inhibitorami proteaz. Przechowuj probówkę w lodzie.

Powtórz procedurę sekcji po drugiej stronie szczura oraz po obu stronach drugiego szczura. Przeskrob dno szalki Petriego pipetą Pasteura i napełnij ją dwoma mililitrami PBS 2X w temperaturze pokojowej z inhibitorami proteaz.

Przenieś pojedynczy nerw do szalki pod mikroskopem stereoskopowym. Za pomocą precyzyjnej pęsety usuń epineurium z nerwu, odciągając go, i wyrzuć go, pozostawiając pęczkowe włókna nerwowe w szalce. Ostrożnie oddziel pęczki od siebie oraz od dna szalki.

Poszczególne fales staną się mętne i wypłyną na powierzchnię roztworu. Natychmiast przenieś oddzielone fales do probówki do mikrowirówki zawierającej 500 µL 0,2 X PB s z inhibitorami proteaz. Przechowuj sles w lodzie.

Z wprawą oddzielić i zebrać sles z pozostałej części nerwu kulszowego w probówce. Usunięcie epineurium i wyizolowanie sles powinno zająć nie więcej niż 10 minut na jeden nerw.

Wyjmij probówkę zawierającą odseparowane SLES z lodu. Inkubuj przez dwie godziny w temperaturze pokojowej, aby uwolnić mielinę i nieaksonalne struktury wszy. Przemyj sles podczas każdego etapu płukania.

Za pomocą pęsety ostrożnie wyjmij sles i przenieś je do nowej probówki zawierającej 1 ml 2X PB s z inhibitorami proteaz. Inkubuj probówkę na wytrząsarce przez pięć minut. W ten sposób wypłucz SLES trzykrotnie.

Przenieś SLES do nowej, pustej probówki typu einor, aby usunąć nadmiar płynu, a następnie przenieś do probówki zawierającej 300 µL 1x PBS z inhibitorami proteaz i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 20 do 30 minut. Aby eluować opsm, wyższe stężenia soli mogą zakłócać dalsze procedury proteomiczne. Wirowarkuj próbkę przy 10 000 ×g przez 10 minut w temperaturze 4 °C, aby wytrącić tkankę i szczątki komórkowe, a następnie odpipetuj nadsącz do czystej probówki typu einor.

Uzyskany supernatant powinien być klarowny. Należy użyć spektrofotometru do pomiaru stężenia białka.

Należy uzyskać wydajność od 200 do 250 µg białka. Preparat osocza należy przechowywać w alikwotach w temperaturze -80 °C przez okres do sześciu miesięcy. Należy unikać cykli zamrażania i rozmrażania.

Poniżej przedstawiono analizę Western blot porównującą op plasm izolowaną metodą ręcznego wyciskania z próbkami opsm izolowanymi zgodnie z opisanym w niniejszym protokole sposobem. Zwróć uwagę na obniżone poziomy albuminy i GFAP, które odpowiednio reprezentują zanieczyszczenia białkami krwi i komórkami glejowymi. W przeciwieństwie do nich, tubulina beta trzy aksonalna jest wzbogacona w tym preparacie, co wskazuje na wysoki poziom białek aksonalnych.

Po obejrzeniu całego tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak przeprowadzić dyssekcję nerwu kulszowego oraz jak prawidłowo oddzielić Paco. To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w prowadzeniu eksperymentów.