Name: Izolacja aksoplazmy od nerwu kulszowego szczura (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-24T17:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 29 s
Description: Naucz się izolować aksoplazmę z nerwu kulszowego szczura. Ta metoda wykorzystuje hipotoniczny roztwór do lizy struktur pozaaksomalnych, zapewniając wysoką czystość materiału do badań biochemicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Niniejszy protokół umożliwia izolację aksoplazmy przy minimalizacji zanieczyszczeń tkanką glejową i naczyniową. Metoda ta pozwala na uzyskanie około 70-100 μg całkowitego białka aksoplazmy z jednego szczura rasy Wistar w wieku 8-10 tygodni.
1. Disekcja nerwów kulszowych
<ol>
 <li>Uśmierć dwa szczury poprzez inhalację CO2, a następnie zwichnięcie stawów szyjnych. Przed rozpoczęciem sekcji potwierdź zgon poprzez palpację, sprawdzając brak bicia serca.</li>
 <li>Przetrzyj obszar sekcji 70% etanolem.</li>
 <li>Nacnij skórę, rozdziel mięśnie i wyizoluj nerw kulszowy, używając ostrożnie nożyczek i pęsety, aby nie uszkodzić naczyń krwionośnych. Wypreparuj oba nerwy kulszowe (o długości ok. 1,5 cm każdy) z każdego zwierzęcia i zbierz wszystkie cztery nerwy do probówki typu Eppendorf zawierającej 500 μL PBS 0,2X + inhibitory, utrzymywanej w lodzie.</li>
 <li>Przenieś segmenty nerwów do plastikowych szalek zawierających co najmniej 2 mL PBS 0,2X + inhibitory proteaz.</li>
 <li>Usuń epineurium z nerwów za pomocą precyzyjnej pęsety pod mikroskopem binokularnym. Bardzo ostrożnie rozdziel pęczki, aż staną się mętne i zaczną unosić się na powierzchni roztworu. Należy ćwiczyć ten etap, aż będzie można go wykonać szybko i precyzyjnie (nie poświęcając więcej niż 10 min na jeden nerw).</li>
</ol>
2. Inkubacja, przemywanie i elucja
<ol>
 <li>Przenieś odseparowane pęczki do nowej probówki Eppendorf zawierającej 500 μL 0,2X PBS z inhibitorami proteaz i inkubuj przez 2 h w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Przemyj co najmniej 3 razy 1 mL tego samego buforu, przenosząc pęczki z jednej probówki Eppendorf do drugiej i wstrząsając przez 5 min po każdym przeniesieniu.</li>
 <li>Aby usunąć nadmiar płynu, umieść pęczki w nowej pustej probówce Eppendorf, a następnie przenieś je do nowej probówki Eppendorf z 300 μL 1X PBS z inhibitorem proteaz i inkubuj przez 20-30 min w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Wiruj przez 10 min przy 10 000 x g w temperaturze 4°C.</li>
 <li>Odbierz nadsącz i zmierz stężenie białka. Otrzymany roztwór stanowi preparat aksoplazmy.</li>
</ol>
3. Reprezentatywne wyniki
<img src="/files/ftp_upload/2087/2087fig1.jpg" alt="Analiza Western blot ekstraktu z mózgu; białka: Albumin, Tubulin β3, GFAP, gERK, 65-42kDa." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Western blot porównujący aksoplazmę wyizolowaną metodą ręcznego wyciskania z próbkami aksoplazmy wyizolowanymi zgodnie z opisem w niniejszym protokole. Zwróć uwagę na obniżone poziomy albuminy i GFAP, reprezentujące odpowiednio zanieczyszczenia białkami krwi i komórkami glejowymi. Przeciwnie, w tym preparacie wzbogacona jest tubulina β3, co wskazuje na wysoki poziom białek aksonalnych.

<ol><li>Hanz, S., Perlson, E., Willis, D., Zheng, J. Q., Massarwa, R., Huerta, J. J., Koltzenburg, M., Kohler, M., van-Minnen, J., Twiss, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axoplasmic+importins+enable+retrograde+injury+signaling+in+lesioned+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Axoplasmic importins enable retrograde injury signaling in lesioned nerve.</a> Neuron. 40, 1095-1104 (2003).</li>
<li>Michaelevski, I., Medzihradszky, K. F., Lynn, A., Burlingame, A. L., Fainzilber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+transport+proteomics+reveals+mobilization+of+translation+machinery+to+the+lesion+site+in+injured+sciatic+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Axonal transport proteomics reveals mobilization of translation machinery to the lesion site in injured sciatic nerve.</a> Mol Cell Proteomics. 9 (5), 976-987 (2010).</li>
<li>Rishal, I., Michaelevski, I., Rozenbaum, M., Shinder, V., Medzihradszky, K. F., Burlingame, A. L., Fainzilber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axoplasm+isolation+from+peripheral+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Axoplasm isolation from peripheral nerve.</a> Dev Neurobiol. 70, 126-133 (2010).</li>
<li>Twiss, J. L., Fainzilber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosomes+in+axons--scrounging+from+the+neighbors%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Ribosomes in axons--scrounging from the neighbors.</a> Trends Cell Biol. 19, 236-243 (2009).</li>
</ol>

Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.

Analizy biochemiczne i proteomiczne potwierdziły, że procedura ta zmniejsza zanieczyszczenie surowicą i komórkami glejowymi 3 w porównaniu do wcześniej opisanych metod izolacji aksoplazmy poprzez wyciskanie mechaniczne 1. Wykorzystaliśmy ten protokół izolacji aksoplazmy do zbadania sygnałów wstecznych opartych na dyneinie po uszkodzeniu nerwu kulszowego2 i przewidujemy, że będzie on użyteczny w badaniu wielu innych procesów w dorosłym nerwie obwodowym, w tym oddziaływań akson-glej 4<...

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;ul&gt; &lt;li&gt;Samce szczurów Wistar (w wieku 8-10 tygodni)&lt;/li&gt; &lt;li&gt;Roztwory PBS 0,2X oraz PBS 1X zawierające inhibitory proteaz (Roshe), 2 tabletki na 50 ml&lt;/li&gt; &lt;li&gt;Probówki typu Eppendorf o pojemności 1,5 ml&lt;/li&gt; &lt;li&gt;Sterylne plastikowe szalki 35 mm&lt;/li&gt; &lt;li&gt;Narzędzia do sekcji, w tym: nożyczki i precyzyjna pęseta&lt;/li&gt; &lt;li&gt;Stereomikroskop i lampa stołowa&lt;/li&gt; &lt;/ul&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_step">Przeciwciała&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_content">Mysie przeciwciało anty-GFAP klon G-A-5 pochodziło z firmy Sigma (G6171). Królicze przeciwciało anty-albumina pochodziło z firmy Cedarlane (CLAG5140). Mysie przeciwciało anty-tubulina &amp;#946;3 oraz królicze przeciwciało anty-gERK pochodziły z firmy Sigma (odpowiednio T2200 i M5670).&lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

izolacja aksoplazmy z nerwu kulszowego szczura

Axoplasm Isolation from Rat Sciatic Nerve

Izolacja czystej cytoplazmy aksonalnej (aksoplazmy) z nerwu obwodowego jest kluczowa dla badań biochemicznych wielu procesów biologicznych. W niniejszym artykule prezentujemy i opisujemy protokół izolacji aksoplazmy z nerwu kulszowego dorosłego szczura, oparty na następujących etapach: (1) wypreparowanie pęczków nerwowych i oddzielenie tkanki łącznej; (2) inkubacja krótkich fragmentów pęczków nerwowych w medium hipotonicznym w celu uwolnienia mieliny i lizy struktur nieaksonalnych; oraz (3) ekstrakcja pozostałego materiału wzbogaconego w aksony. Charakterystyka proteomiczna i biochemiczna otrzymanego preparatu potwierdziła wysoki stopień wzbogacenia w komponenty aksonalne.

Prezentujemy protokół izolacji aksoplazmy z nerwu kulszowego dorosłego szczura, oparty na wycięciu pęczków nerwowych i inkubacji w medium hipotonicznym w celu uwolnienia mieliny oraz lizy struktur nieaksonalnych, a następnie ekstrakcji pozostałego materiału wzbogaconego w aksony.

Izolacja aksoplazmy z nerwu kulszowego szczura

Izolacja czystej cytoplazmy aksonalnej (aksoplazmy) z nerwu obwodowego jest kluczowa dla badań biochemicznych wielu procesów biologicznych. W niniejszym artykule...

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie czystego cytoplazmy aksonalnej lub ektoplazmy z nerwu obwodowego. Osiąga się to najpierw poprzez wypreparowanie nerwu kulszowego. Drugim krokiem procedury jest usunięcie tkanki łącznej z nerwu i oddzielenie sles.Trzecim krokiem procedury jest inkubacja krótkich odcinków włókien nerwowych w medium hipotonicznym. Ostatnim krokiem procedury jest inkubacja w roztworze izotonicznym, wirowanie i homogenizacja. W rezultacie można uzyskać wyniki wykazujące wysoki stopień wzbogacenia w komponenty aksonalne w analizie western blot.Witajcie, nazywam się Elle Rosenbaum. Reprezentujemy laboratorium profesora Mike'a F. Labora z Katedry Chemii Biologicznej w Instytucie Nauki. Dzisiaj zaprezentujemy nową technikę oksy-metylacji.Główną zaletą tej techniki w porównaniu do istniejących metod, takich jak manualne wyciskanie OIS nerwu obwodowego, jest fakt, że procedura ta ogranicza zanieczyszczenie surowicą i tkanką łączną treści aksonalnej. Wykorzystaliśmy tę nową technikę do metylacji op PLAs w celu zbadania sygnalizacji wstecznej zależnej od D po uszkodzeniu nerwu kulszowego.Zacznijmy. Umieść jednego z dwóch uśpionych szczurów szczepu Wistar w wieku od 8 do 10 tygodni na boku na macie sekcyjnej, aby uzyskać bezpośredni dostęp do dystalnej części nerwu kulszowego. Ogól skórę w połowie uda i dokładnie przemyj 70% ethanol.Za pomocą nożyczek odetnij skórę z uda. Ostrożnie przetnij tkankę tłuszczową i łączną między mięśniem dwugłowym uda a mięśniem pośladkowym powierzchownym. Używając pęsety, unieś odsłonięty odcinek nerwu kulszowego i usuń go.Wycięty fragment będzie miał długość około 1,5 centymetra. Przenieś nerw do probówki do mikrocentryfugi zawierającej 500 µL lodowatego 2X PBS z inhibitorami proteaz. Przechowuj probówkę w lodzie.Powtórz procedurę sekcji po drugiej stronie szczura oraz po obu stronach drugiego szczura. Przeskrob dno szalki Petriego pipetą Pasteura i napełnij ją dwoma mililitrami PBS 2X w temperaturze pokojowej z inhibitorami proteaz.Przenieś pojedynczy nerw do szalki pod mikroskopem stereoskopowym. Za pomocą precyzyjnej pęsety usuń epineurium z nerwu, odciągając go, i wyrzuć go, pozostawiając pęczkowe włókna nerwowe w szalce. Ostrożnie oddziel pęczki od siebie oraz od dna szalki.Poszczególne fales staną się mętne i wypłyną na powierzchnię roztworu. Natychmiast przenieś oddzielone fales do probówki do mikrowirówki zawierającej 500 µL 0,2 X PB s z inhibitorami proteaz. Przechowuj sles w lodzie.Z wprawą oddzielić i zebrać sles z pozostałej części nerwu kulszowego w probówce. Usunięcie epineurium i wyizolowanie sles powinno zająć nie więcej niż 10 minut na jeden nerw.Wyjmij probówkę zawierającą odseparowane SLES z lodu. Inkubuj przez dwie godziny w temperaturze pokojowej, aby uwolnić mielinę i nieaksonalne struktury wszy. Przemyj sles podczas każdego etapu płukania.Za pomocą pęsety ostrożnie wyjmij sles i przenieś je do nowej probówki zawierającej 1 ml 2X PB s z inhibitorami proteaz. Inkubuj probówkę na wytrząsarce przez pięć minut. W ten sposób wypłucz SLES trzykrotnie.Przenieś SLES do nowej, pustej probówki typu einor, aby usunąć nadmiar płynu, a następnie przenieś do probówki zawierającej 300 µL 1x PBS z inhibitorami proteaz i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 20 do 30 minut. Aby eluować opsm, wyższe stężenia soli mogą zakłócać dalsze procedury proteomiczne. Wirowarkuj próbkę przy 10 000 ×g przez 10 minut w temperaturze 4 °C, aby wytrącić tkankę i szczątki komórkowe, a następnie odpipetuj nadsącz do czystej probówki typu einor.Uzyskany supernatant powinien być klarowny. Należy użyć spektrofotometru do pomiaru stężenia białka.Należy uzyskać wydajność od 200 do 250 µg białka. Preparat osocza należy przechowywać w alikwotach w temperaturze -80 °C przez okres do sześciu miesięcy. Należy unikać cykli zamrażania i rozmrażania.Poniżej przedstawiono analizę Western blot porównującą op plasm izolowaną metodą ręcznego wyciskania z próbkami opsm izolowanymi zgodnie z opisanym w niniejszym protokole sposobem. Zwróć uwagę na obniżone poziomy albuminy i GFAP, które odpowiednio reprezentują zanieczyszczenia białkami krwi i komórkami glejowymi. W przeciwieństwie do nich, tubulina beta trzy aksonalna jest wzbogacona w tym preparacie, co wskazuje na wysoki poziom białek aksonalnych.Po obejrzeniu całego tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak przeprowadzić dyssekcję nerwu kulszowego oraz jak prawidłowo oddzielić Paco. To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w prowadzeniu eksperymentów.

axoplasm-isolation-from-rat-sciatic-nerve

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Izolowanie aksonopłazmy z nerwu udowego szczura

Ze względu na prostotę zabiegu chirurgicznego oraz wyraźne efekty behawioralne, przewlekłe uciskowe uszkodzenie nerwu kulszowego jest jednym z najważniejszych modeli zwierzęcych bólu neuropatycznego. W ciągu 24 h po operacji rozwija się nadwrażliwość bólowa, którą można zmierzyć ilościowo za pomocą estezjometru von Freya (test mechaniczny) oraz urządzenia do pomiaru analgesii podeszwowej (test termiczny).

Przewlekłe uciskowe uszkodzenie nerwu kulszowego i badanie nadwrażliwości bólowej u szczurów

Ten film przedstawia izolację i hodowlę komórek Schwanna z korzeni rdzeniowych myszy. Wyizolowane komórki są następnie hodowane w określonych pożywkach. Komórki Schwanna są izolowane poprzez zróżnicowane trawienie i przyleganie. Następnie są przenoszone do szkiełek nakrywkowych pokrytych macierzą zewnątrzkomórkową w celu przyczepienia i proliferacji.

Izolacja komórek Schwanna z korzeni rdzeniowych myszy

Ten film demonstruje metodę izolowania komórek Schwanna od włókien nerwu kulszowego myszy.

Magnetyczna separacja komórek Schwanna od nerwów kulszowych myszy

Ten film pokazuje jednowłóknowe nagranie przewodnictwa nerwowego włókna C u szczurów. Znieczulony szczur jest nacinany w celu odsłonięcia nerwu kulszowego, który zapewnia czuciowe i motoryczne zasilanie kończyn dolnych. Poszczególne włókna C są następnie naświetlane. Stymulacja elektryczna jest dostarczana za pomocą elektrod bodźcowych wszczepionych w stopę, a odpowiedź jest rejestrowana z pojedynczego włókna nerwowego.

Zapis in vivo pojedynczych włókien włókien C nerwu kulszowego u szczurów

Tutaj prezentujemy technikę in vivo transferu genów do komórek Schwanna (SC) w nerwie kulszowym gryzoni. Ta prosta technika jest przydatna do badania mechanizmów sygnalizacyjnych zaangażowanych w rozwój i utrzymanie mielinizujących się SC.

In vivo (in vivo) Transfer genów do komórek Schwanna w nerwie kulszowym gryzoni za pomocą elektroporacji

Tutaj prezentujemy protokół hydraulicznego wytłaczania rdzenia kręgowego, jak również identyfikacji i izolacji specyficznych zwojów korzenia grzbietowego (DRG) u tego samego gryzonia. W porównaniu ze standardowymi metodami izolacji rdzenia kręgowego, metoda ta jest znacznie szybsza i zmniejsza ryzyko uszkodzenia tkanek.

Hydrauliczne wytłaczanie rdzenia kręgowego i izolacja zwojów korzenia grzbietowego u gryzoni

Zapis jednowłóknisty to skuteczna technika elektrofizjologiczna, która ma zastosowanie do ośrodkowego i obwodowego układu nerwowego. Wraz z przygotowaniem nienaruszonego DRG z przyczepionym nerwem kulszowym badany jest mechanizm niewydolności przewodzenia. Oba protokoły poprawiają zrozumienie związku obwodowego układu nerwowego z bólem.

Zastosowanie zapisu pojedynczego włókna in vivo i nienaruszonego zwoju korzenia grzbietowego z przyczepionym nerwem kulszowym w celu zbadania mechanizmu uszkodzenia przewodzenia

Ta metoda pozwala na rejestrację siły skurczów skurczowych i tężcowych oraz potencjałów czynnościowych w trzech typach jednostek motorycznych w mięśniu brzuchatym łydki przyśrodkowego szczura. Izolacja funkcjonalna pojedynczej jednostki silnikowej jest indukowana przez stymulację elektryczną aksonu.

Funkcjonalna izolacja pojedynczych jednostek motorycznych mięśnia brzuchatego łydki przyśrodkowego szczura

Ten protokół opisuje przygotowanie całej tkanki nerwowej rwy kulszowej szczura do elektrofizjologicznej stymulacji ex vivo i zapis w regulowanej środowiskowo, dwukomorowej, perfundowanej kąpieli solankowej.

Przygotowanie nerwu kulszowego szczura do neurofizjologii ex vivo

W systemie kokultury zwojów korzenia grzbietowego i komórek Schwanna, mielinizacja obwodowego układu nerwowego może być badana. Model ten zapewnia eksperymentalne możliwości obserwacji i ilościowego określenia mielinizacji obwodowej oraz zbadania wpływu związków będących przedmiotem zainteresowania na osłonkę mielinową.

Mielinizacja in vitro aksonów obwodowych w kokulturze eksplantatów zwojów korzenia grzbietowego szczura i komórek Schwanna

Naucz się izolować aksoplazmę z nerwu kulszowego szczura. Ta metoda wykorzystuje hipotoniczny roztwór do lizy struktur pozaaksomalnych, zapewniając wysoką czystość materiału do badań biochemicznych.

Izolacja aksoplazmy z nerwu kulszowego szczura

Przeglądaj więcej filmów