Izolacja aksoplazmy od nerwu kulszowego szczura

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie czystej cytoplazmy aksonalnej lub ektoplazmy z nerwu obwodowego. Osiąga się to poprzez najpierw wypreparowanie nerwu kulszowego. Drugim etapem zabiegu jest usunięcie tkanki łącznej z nerwu i oddzielenie pęcherzy.

Trzecim etapem zabiegu jest inkubacja krótkich odcinków pęcherzyków nerwowych w podłożu hipotonicznym. Ostatnim etapem zabiegu jest inkubacja w roztworze izotonicznym, odwirowanie i opsm milian. Ostatecznie można uzyskać wyniki, które wskazują na wysoki stopień wzbogacenia składników aksonalnych za pomocą analizy western blot.

Cześć, nazywam się ja, Elle I mogę Rosenbaum. Pochodzimy z laboratorium profesora Mike'a F. z Wydziału Chemii Biologicznej Instytutu Nauk Ścisłych. Dzisiaj będziemy reprezentować nową technikę mezylacji Oxy Opat.

Główną zaletą tej techniki jest przewaga nad istniejącymi metodami, takimi jak ręczne ściskanie OIS nerwu obwodowego. Oznacza to, że procedura ta zmniejsza zanieczyszczenie surowicy i glosu dociera do treści aksonalnej. Użyliśmy tej nowej techniki do metylacji op PLAs, aby zbadać sygnalizację retro opartą na D po uszkodzeniu nerwu kulszowego.

Więc zacznijmy. Umieść jednego z dwóch uśpionych szczurów wistar w wieku od 8 do 10 tygodni na boku na macie preparcyjnej, aby uzyskać bezpośrednie podejście do dystalnej części nerwu kulszowego. Ogol skórę w połowie uda i dokładnie zamień na 70% etanol.

Użyj nożyczek, aby odciąć skórę od uda. Ostrożnie przetnij tłuszcz i tkankę łączną między bicepsem kości udowej a powierzchownymi mięśniami pośladkowymi. Użyj kleszczy, aby podnieść odsłonięty obszar nerwu kulszowego i usunąć go.

Usunięta sekcja będzie miała około 1,5 centymetra długości. Przenieś nerw do 500 mikrolitrów lodowatego 2X PBS z inhibitorami proteazy w mikroprobówce wirówkowej. Trzymaj probówkę na lodzie.

Powtórz procedurę sekcji po drugiej stronie szczura i po obu stronach drugiego szczura. Zdrap dno szalki Petriego pipetą do pasty i napełnij ją dwoma mililitrami temperatury pokojowej. Punkt drugi X PB s z inhibitorami proteazy.

Przenieś pojedynczy nerw do naczynia pod mikroskopem preparacyjnym. Użyj cienkich kleszczy, aby usunąć epi nearium z nerwu, odciągając go i wyrzucając, pozostawiając faciles w naczyniu. Ostrożnie oddziel naczynia od siebie i od dna naczynia.

Poszczególne fale staną się mętne i będą unosić się na powierzchni roztworu. Natychmiast przenieść oddzielone fale do mikroprobówki wirówkowej zawierającej 500 mikrolitrów 0,2 X PB s z inhibitorami proteazy. Trzymaj sles na lodzie.

Oddziel i zbierz krople z pozostałej rwy kulszowej w rurce z praktyką. Usunięcie epineurium i oddzielenie pęcherzyków. Nie powinno zająć więcej niż 10 minut na nerw.

Wyjąć z lodu probówkę zawierającą oddzielony SLES. Inkubuj przez dwie godziny w temperaturze pokojowej, aby uwolnić mielinę i nieaksonalne struktury. Umyj sles do każdego prania.

Użyj kleszczy, aby delikatnie podnieść pęcherze i przenieść je do świeżej probówki zawierającej jeden mililitr 2X PB s z inhibitorami proteazy. Potrząsaj rurką na bujaku przez pięć minut. Umyj w ten sposób SLES trzy razy po umyciu.

Przenieść SLES do świeżej, pustej probówki einor w celu usunięcia nadmiaru płynu, a następnie przenieść do probówki zawierającej 300 mikrolitrów jednego XPBS z inhibitorami proteusa inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 do 30 minut. Aby wymyć opsm, wyższe stężenia soli zakłócają dalsze procedury proteomiczne. Odwirować pęczek w ilości 10 000 sera przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby osadzać tkanki i resztki komórek, pipetować szwadron do czystej probówki einor.

Otrzymany supernatant. Powinno być jasne. Użyj spektrofotometru, aby zmierzyć stężenie białka.

Należy uzyskać wydajność od 200 do 250 mikrogramów białka. Preparat osocza operacyjnego należy przechowywać w porcjach w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przez okres do sześciu miesięcy. Unikaj cykli rozmrażania i zamrażania.

Oto zachodni blok porównujący plazmę operacyjną wyizolowaną metodą ręcznego ściskania z próbkami opsm wyizolowanymi, jak pokazano w tym protokole. Należy zwrócić uwagę na obniżone poziomy albuminy i GFAP reprezentujące odpowiednio zanieczyszczenie białkami krwi i komórkami glejowymi. Natomiast tubulina aksonalna beta three jest wzbogacona w ten preparat, co wskazuje na wysoki poziom białek aksonalnych.

Po obejrzeniu całego tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak rozciąć nerw satyczny i jak prawidłowo oddzielić Paco. Więc to wszystko. Dziękuję za oglądanie i życzę powodzenia w eksperymentach.