Name: Wywołane przez środowisko dziedziczne zmiany w lnie (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-26T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Poznaj metodę wywoływania dziedzicznych zmian genomowych u lnu poprzez stres odżywczy. Technika PCR i Q-R-T-P-C-R pozwala monitorować zmiany genetyczne i ekspresji genów w kolejnych pokoleniach roślin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Wzrost lnu w warunkach indukujących.
<ol>
 <li>Doniczki o średnicy 5 cali wypełnia się ziemią i ugniata.</li>
 <li>W każdej doniczce sadzi się po trzy nasiona na głębokości ¼ cala, a następnie ugniata się nad nimi glebę.</li>
 <li>Następnie doniczki podlewa się 100 ml odpowiednich roztworów odżywczych.
 <ol>
 <li>Warunki kontrolne bez indukcji (C) wykorzystują 1/10th stężenie Miracle-Gro co tydzień. W warunkach wysokiej zawartości składników odżywczych (zabieg NPK) co tydzień stosowano pełne stężenie Miracle-Grow. W warunkach niskiej zawartości składników odżywczych rośliny otrzymywały wyłącznie wodę z kranu przez cały okres wzrostu (Durrant 1971, Cullis 1980).</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Rośliny są hodowane przy świetle naturalnym w okresie letnim. W okresie zimowym są hodowane pod lampami sodowymi z 16/8-godzinnym cyklem światła i ciemności.</li>
 <li>Liście i merystemy są zbierane w odstępach tygodniowych.</li>
 <li>Materiał roślinny jest szybko zamrażany w ciekłym azocie.</li>
</ol>
Wyniki
Trzy genotypy rosną w różnym tempie względnym w zależności od warunków (Rysunek 1). W związku z tym, w warunkach kontrolnych najlepiej rośnie linia Pl, przy czym linia L wykazuje większą wigorystyczność niż S (Rysunek 1a). W warunkach niskiej dostępności składników odżywczych (woda), linia S rośnie lepiej niż L lub Pl (Rysunek 1b). Przy wysokiej dostępności składników odżywczych (NPK) linia L rośnie lepiej niż Pl, która z kolei rośnie tylko nieco lepiej niż S (Rysunek 1c). Porównanie każdej z linii hodowanych w trzech różnych wariantach traktowania przedstawiono na Rysunku 1 d - f. Linia Pl rośnie najlepiej w warunkach kontrolnych (Rysunek 1d), linia L najlepiej przy wysokiej zawartości składników odżywczych (Rysunek 1e), a linia S podobnie zarówno w warunkach wysokiej zawartości składników odżywczych, jak i w warunkach kontrolnych (Rysunek 1f).
Dane te pokazują, że trzy linie można rozróżnić na podstawie ich wzrostu w trzech różnych środowiskach. Warto zauważyć, że Pl rośnie najlepiej w warunkach kontrolnych, podczas gdy L rośnie najlepiej w warunkach NPK (w których została indukcja). S rośnie podobnie we wszystkich trzech warunkach, co oznacza, że nie jest w stanie wykorzystać poprawionych warunków odżywczych, ale lepiej radzi sobie w warunkach bardzo niskiej zawartości składników odżywczych.
Parametry wzrostu istotne dla różnicowania roślin obejmują wysokość rośliny (a z tym powiązaną długość międzywęźla, czyli odległość między kolejnymi liśćmi), wielkość liści oraz stopień rozgałęzienia. W przypadku linii Pl w warunkach kontrolnych roślina jest wysoka z licznymi gałęziami, a liście są duże i ciemnozielone. W warunkach niedoboru składników odżywczych roślina jest bardzo niska, odległość między liśćmi jest również bardzo mała, a liście są małe i jasnozielone. Liście na szczycie są ciemniej zielone niż te znajdujące się niżej na łodydze. W warunkach wysokiej zawartości składników odżywczych roślina wygląda bardzo podobnie do rośliny w warunkach kontrolnych, z wyjątkiem tego, że zarówno główna łodyga, jak i pędy boczne są krótsze niż u roślin kontrolnych. W przypadku dużego genotypu L rośliny wyglądają bardzo podobnie do linii Pl, z wyjątkiem tego, że najbardziej intensywny wzrost występuje przy wysokiej zawartości składników odżywczych. Ponownie, w warunkach niedoboru składników odżywczych roślina jest bardzo niska i posiada jasnozielone liście. Genotyp S rośnie podobnie we wszystkich trzech środowiskach, choć liście są jaśniejszą zielenią przy niskiej zawartości składników odżywczych. Jednakże w warunkach niedoboru składników odżywczych genotyp S jest znacznie bardziej wigorystyczny niż linie Pl lub L.
2. Ekstrakcje RNA i DNA z merystemów i liści lnu przeprowadzono oddzielnie. Do ekstrakcji RNA wykorzystano zestaw Roche total RNA prep kit, a do ekstrakcji DNA zestaw Qiagen DNeasy Plant DNA prep kit.
Izolacja RNA
<ol>
 <li>3 merystemy wraz z kilkoma otaczającymi liśćmi przenosi się z krio probówki do przechowywania do probówki typu Eppendorf i umieszcza w ciekłym azocie do momentu rozgrubienia.</li>
 <li>Do probówki dodaje się sterylny piasek i rozciera tkankę za pomocą mikro pestle, aż do uzyskania drobnej konsystencji.</li>
 <li>Dodaje się 40 µL buforu lizującego/wiążącego z zestawu Roche total RNA prep kit i dalej rozciera tkankę, aż do całkowitego usunięcia grudek.</li>
 <li>Próbkę mieszano w vortexie przez 15 sec, aby wspomóc lizę, a następnie wirowano przez 1 min przy 13,0 rpm w celu osadzenia piasku i zanieczyszczeń.</li>
 <li>Nadosad przenosi się do kolumny wiążącej i postępuje zgodnie z pozostałymi instrukcjami zestawu do izolacji RNA.</li>
</ol>
Obróbka DNazą
<ol>
 <li>Dodaje się 1/10 objętości próbki RNA buforu DNAse 10X.</li>
 <li>Dodaje się 30 jednostek DNAse; reakcję inkubuje się w temperaturze 37°C przez 30 min oraz w 70°C przez 5 min.</li>
</ol>
Odwrotna transkrypcja
<ol>
 <li>Zestaw Applied Biosystems RNA to cDNA należy stosować zgodnie z instrukcją; reakcję inkubuje się w temperaturze 37°C przez 1 godzinę oraz w 95°C przez 5 minut.</li>
</ol>
Następnie cDNA jest wykorzystywane w reakcji PCR lub qPCR
qPCR
Analizę qPCR przeprowadzono przy użyciu systemu ABI Step One. Wszystkie testy wykonano w trzech powtórzeniach w każdym przebiegu. Gen aktyny wykorzystano jako kontrolę liczby kopii, ponieważ jest to najlepszy dostępny gen gospodarski.
<ol>
 <li>Do każdej probówki dodano 1μl odpowiedniej pary starterów.</li>
 <li>cDNA rozcieńczono do odpowiedniego stężenia, a następnie do każdej probówki dodano 9μl.</li>
 <li>Do każdej probówki dodano 10μl 2x Power SYBR Green PCR MasterMix (ABI).</li>
 <li>Program amplifikacji obejmował:
 <ul>
 <li>10 minut w 95°C</li>
 <li>40 cykli: 15sec w 95°C, 1 min w 60°C</li>
 </ul>
 
 Krok denaturacji termicznej w celu weryfikacji swoistości amplifikacji.</li>
 <li>Względne poziomy ekspresji określono na podstawie wartości 2(CTunknown - CTactin).</li>
</ol>
Przygotowanie DNA
<ol>
 <li>Do probówki do mikrocentryfugi zawierającej 6 liści oraz steryjny piasek dodaje się bufor AP1 z zestawu Qiagen DNeasy Plant DNA prep kit. Tkankę uciera się mikropestleikiem do momentu, aż nie będą widoczne żadne grudki.</li>
 <li>Postępuje się zgodnie z instrukcją dołączoną do zestawu.</li>
</ol>
Wyniki
Amplifikacja PCR z DNA wyizolowanego z liści w różnych pozycjach wzdłuż łodygi wykazuje, że pojawienie się LIS-1 następuje podczas wzrostu roślin w warunkach indukujących (4). Wyniki qPCR wskazują, że obecność LIS-1 (lub innych zmian genomicznych związanych z indukcją) wpływa na ekspresję genów znajdujących się w bezpośrednim sąsiedztwie LIS-1 (Rysunek 2). Sześć genów przedstawionych na Rysunku 2 wykazuje zróżnicowaną ekspresję w PL i S, przy czym cztery z nich mają wyższą ekspresję w PL (bez LIS-1), a dwa wyższą ekspresję w S (które posiada LIS-1). Panele 1 i 2 przedstawiają dwa geny położone najbliżej punktu insercji LIS-1. Aby określić jakikolwiek związek przyczynowy między LIS-1 a zmianami ekspresji, konieczne będzie zbadanie ekspresji tych genów w dużym genotropie (w którym zaszły zmiany indukowane, ale który nie posiada LIS-1) oraz ekspresji w różnych warunkach wzrostu.
<img src="/files/ftp_upload/2332/2332fig1.jpg" alt="Eksperyment porównawczy wzrostu roślin; schemat siewek poddanych różnym zabiegom: woda, kontrola, NPK." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> Rysunek 1. Pl, L i S wyhodowane w trzech różnych reżimach odżywczych. Panele a – kontrolne, b – niskie stężenie składników odżywczych i c – NPK. d – Pl, e – S, f – L. Panele d – f od lewej do prawej: niskie stężenie składników odżywczych, kontrolne i NPK. D – Pl, e – L, F – S.
<img src="/files/ftp_upload/2332/2332fig2tmb.jpg" alt="Wykresy słupkowe porównujące poziomy ekspresji białek dla różnych inhibitorów i motywów w różnych warunkach." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Miniatura Rysunku 2"> Rysunek 2. Ekspresja genów wokół miejsca insercji LIS-1. Gen 1 (inhibitor wzrostu) znajduje się bezpośrednio po stronie 5' względem LIS-1, a gen 2 (inhibitor kinazy zależnej od cyklin związany z Kip) znajduje się po stronie 3' LIS-1. Pozostałe geny rozmieszczone są wzdłuż tego samego rusztowania (~50 kb), zbudowanego na podstawie pełnej sekwencji genomu lnu. Proszę <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2332/2332fig2.jpg">kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony schemat</a>.
<img src="/files/ftp_upload/2332/2332fig3.jpg" alt="Wyniki elektroforezy żelowej fragmentów DNA; ścieżki 1-6 przedstawiające rozdział i analizę prążków." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> Rysunek 3. Amplifikacje PCR DNA wyekstrahowanego z pojedynczych liści roślin Stormont Cirrus hodowanych w warunkach niskiej dostępności składników odżywczych. Produkty PCR rozdzielono w 2% żelu agaroza-TBE. Miejsce bez wstawki pokazano na panelu a, a dwa końce miejsca z wstawką pokazano na panelach b i c. Próbki liści 1–6 pobierano w odstępach tygodniowych, przy czym próbka 1 była najwcześniejsza po wysiewie.

<ol><li>Durrant, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+environmental+induction+of+heritablel+change+in+Linum%5BTitle%5D)+AND+%22Heredity%22%5BJournal%5D)">The environmental induction of heritablel change in Linum.</a> Heredity. 17, 27-61 (1962).</li>
<li>Cullis, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+aspects+of+the+environmental+induction+of+heritable+changes+in+flax%5BTitle%5D)+AND+%22Heredity%22%5BJournal%5D)">Molecular aspects of the environmental induction of heritable changes in flax.</a> Heredity. 38, 129-154 (1977).</li>
<li>Chen, Y., Schneeberger, R. G., Cullis, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+site-specific+insertion+sequence+in+flax+genotrophs+induced+by+the+environment.+New+Phytol%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">A site-specific insertion sequence in flax genotrophs induced by the environment. New Phytol.</a> , 167-171 (2005).</li>
<li>Chen, Y., Lowenfeld, R., Cullis, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+environmentally+induced+adaptive+%28%3F%29+insertion+event+in+flax%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Genet.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">An environmentally induced adaptive (?) insertion event in flax.</a> Int. J. Genet. Mol. Biol. 1, 38-47 (2009).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Len wydaje się posiadać z natury niestabilny genom. Liczne komercyjne odmiany lnu włóknistego szybko tracą jednorodność po kilku pokoleniach uprawy. Podobne obserwacje nie wydają się mieć miejsca w przypadku odmian lnu olejnego. Wskazuje to zatem na istnienie związku między selekcją pod kątem jakości włókna a niestabilnością genomu. Dziedziczne zmiany w lnie wywołane czynnikami środowiskowymi zostały pierwotnie zidentyfikowane podczas badania agronomicznych obserwacji wzrostu upraw włóknistych. Te powtarzalne obserwacje specyficznych wariacji fenotypowych i genomicznych stawiają pytanie o to, w jaki sposób stres środowiskowy może wpływać na zestaw możliwych do wystąpienia rearanżacji genomicznych. Powtarzające się pojawianie się LIS-1 w odpowiedzi na konkretne warunki środowiskowe jest zgodne z tezą, że mutacja ta jest selekcjonowana bezpośrednio lub pośrednio. Wzrost linii indukowanych różnymi zabiegami wskazuje również na poprawę wydajności w odpowiednich warunkach indukcyjnych. Zmiany w ekspresji powiązane z obecnością LIS-1 ponownie wskazują, że insercja ta wpływa na kondycję rośliny. Prezentacja wideo stanowi forum umożliwiające obserwację zmian fenotypowych roślin w sposób niemożliwy do przekazania w tradycyjnych materiałach drukowanych.

<table><tbody><tr><td>Nasiona lnu oryginalnej odmiany Stormont Cirrus oznaczone jako Pl oraz genotrofy L i S.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Doniczki 5&quot;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ziemia do doniczek</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Miracle-Gro</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>szklarnia</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lampy sodowe wysokociśnieniowe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ciekły azot</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Moździerze i tłuczki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikrotłuczki i probówki do wirówek mikrocentryfugalnych</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Termocykler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sprzęt do elektroforezy w żelu agarozowym</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>System obrazowania cyfrowego</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Moduł qPCR StepOne</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zestaw Qiagen DNeasy do izolacji DNA z roślin</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zestaw Applied Biosystems do syntezy cDNA z RNA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zestaw Roche do izolacji całkowitego RNA</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

indukowane środowiskowo dziedziczne zmiany u lnu

Environmentally Induced Heritable Changes in Flax

Niektóre odmiany lnu reagują na stres pokarmowy poprzez modyfikację swojego genomu, a modyfikacje te mogą być dziedziczone przez wiele pokoleń. Z tymi zmianami genomicznymi wiążą się również dziedziczne zmienności fenotypowe 1,2. Odmiana lnu Stormont Cirrus (Pl), w zależności od trzech różnych warunków odżywienia, może pozostać indukowalna (w warunkach kontrolnych) lub zostać stabilnie zmodyfikowana do genotrofu dużego bądź małego poprzez wzrost odpowiednio w warunkach wysokiej lub niskiej zawartości składników odżywczych. Linie powstałe w wyniku początkowego wzrostu w każdych z tych warunków wydają się rosnąć lepiej, gdy są hodowane w tych samych warunkach w kolejnych pokoleniach; w szczególności linia Pl rośnie najlepiej w traktowaniu kontrolnym, co wskazuje, że rośliny rosnące zarówno przy wysokiej, jak i niskiej zawartości składników odżywczych znajdują się pod wpływem stresu. Jedną ze zmian genomicznych związanych z indukcją zmian dziedzicznych jest pojawienie się elementu insercyjnego (LIS-1) 3, 4 podczas wzrostu roślin w warunkach stresu pokarmowego. W odniesieniu do tego zdarzenia insercyjnego, odmiana lnu Stormont Cirrus (Pl) hodowana w trzech różnych warunkach odżywienia może pozostać niezmieniona (w warunkach kontrolnych), wykazać pojawienie się insercji u wszystkich roślin (przy niskiej zawartości składników odżywczych) i przekazać ją następnemu pokoleniu, lub wykazać pojawienie się insercji (lub jej części), która nie jest jednak przekazywana w kolejnych pokoleniach (przy wysokiej zawartości składników odżywczych) 4. Częstotliwość występowania tej insercji wskazuje, że podlega ona selekcji pozytywnej, co jest spójne z odpowiedzią wzrostową w kolejnych pokoleniach. Liście lub merystemy zbierane na różnych etapach wzrostu są wykorzystywane do izolacji DNA i RNA. RNA służy do identyfikacji zmienności ekspresji związanej z różnymi środowiskami wzrostu i/lub obecnością/brakiem LIS-1. Izolowane DNA jest wykorzystywane do identyfikacji roślin, w których doszło do insercji.

Uprawa niektórych odmian lnu w warunkach stresu nutrientowego prowadzi do zmienności genomicznej w obrębie określonej części genomu oraz do zmienności fenotypowej. Złożona insercja w konkretnym miejscu jest powiązana z wzrostem w różnych reżimach odżywczych oraz ze zmianami w ekspresji genów w obrębie tego miejsca.

Indukowane środowiskowo dziedziczne zmiany u lnu

Niektóre odmiany lnu reagują na stres nutrientowy poprzez modyfikację swojego genomu, a modyfikacje te mogą być dziedziczone przez wiele pokoleń. Ponadto...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zaprezentowanie metody hodowli indukcyjnej odmiany lnu w warunkach prowadzących do powstania dziedzicznych wariacji genomowych. Ponadto monitorowane są zmiany genomowe, a wzrost roślin indukowanych w kolejnych pokoleniach jest obserwowany w różnych środowiskach. Aby to osiągnąć, len jest hodowany w zróżnicowanych warunkach indukcyjnych.Następnie pobiera się próbki tkanek liści i łodyg Maris w różnych punktach czasowych podczas wzrostu roślin w zróżnicowanych warunkach środowiskowych. W kolejnym kroku z próbek tkanek izoluje się DNA i RNA. Ostatnim etapem procedury jest przeprowadzenie reakcji PCR z wykorzystaniem próbek DNA oraz Q-R-T-P-C-R z wykorzystaniem wyizolowanego RNA w celu zidentyfikowania zmian genomicznych oraz zmian w ekspresji genów wynikających z uprawy w różnych warunkach środowiskowych.Ostatecznie można uzyskać wyniki wykazujące odpowiedź genomiczną na warunki wzrostu w postaci pojawienia się elementu insercyjnego LIS1 w konkretnym miejscu w genomie oraz różnice w ekspresji związane z obecnością tego elementu, co można zwizualizować za pomocą PCR i R-T-P-C-R przeprowadzonych z wykorzystaniem kwasów nukleinowych wyizolowanych z tkanek roślin poddanych działaniu preparatu. Cześć, jestem Chris Cull z Katedry Biologii na Case Western Reserve University. Jestem Cory Johnson z laboratorium prof. Culla.Jestem Tiffany Moss, również z laboratorium Cull. A ja jestem Marshall Lucas, student studiów licencjackich w ramach letniego programu badań dla studentów w laboratorium Cull.W naszym laboratorium stosujemy tę procedurę do badania zmian w genomie i ekspresji genów wynikających ze zmienności środowiska wzrostu. Zacznijmy zatem. Aby wyhodować len w warunkach indukujących, należy najpierw wypełnić pięciocalowe doniczki ziemią i ją ubić.Następnie posadź trzy nasiona lnu w każdej doniczce na głębokości jednej czwartej cala. Następnie przykryj nasiona ziemią w przypadku warunków kontrolnych nieindukujących. Podlej rośliny 100 mililitrami roztworu Miracle-Gro o stężeniu 1/10.Rośliny w warunkach wysokiej podaży składników odżywczych potraktuj 100 mililitrami pełnej mocy roztworu Miracle grow. Na koniec zastosuj.Rośliny o niskiej zawartości składników odżywczych podlewaj wyłącznie wodą z kranu. W okresie letnim rośliny hoduj przy świetle naturalnym w miarę ich wzrostu. Podlewaj wszystkie rośliny za pomocą automatycznego systemu zraszania dwa razy dziennie przez pięć minut.Warunki wzrostu należy stosować w odniesieniu do roślin raz w tygodniu. Liście oraz łodygi zbierać w odstępach tygodniowych. Do ekstrakcji DNA pobiera się sześć liści, a do ekstrakcji RNA potrzebne są trzy łodygi. Po zebraniu materiał roślinny należy umieścić w probówce kriogenicznej, szybko zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać próbki w temperaturze -80 °C do momentu ekstrakcji.Trzy genotypy rosną w różnym tempie względnym w zależności od warunków. W warunkach kontrolnych najlepiej rośnie inbredyjna odmiana lnu Storm lub linia PL. Z tego rodzica wyewoluowało kilka linii, przy czym odmiana duża (L) wykazuje większą żywotność niż odmiana mała (S).Jednakże w warunkach niskiej dostępności składników odżywczych linia S rośnie lepiej niż L lub pl. Natomiast w warunkach wysokiej dostępności składników odżywczych linia L rośnie lepiej niż pl, która rośnie jedynie nieco lepiej niż S. Porównanie poszczególnych linii hodowanych w trzech różnych wariantach traktowania wykazuje, że pl rośnie najlepiej w warunkach kontrolnych. Linia L rośnie najlepiej w warunkach wysokiej dostępności składników odżywczych, a linia S rośnie podobnie zarówno w warunkach wysokiej dostępności składników odżywczych, jak i w warunkach kontrolnych.Dane te pokazują, że trzy linie można rozróżnić na podstawie ich wzrostu w trzech środowiskach. Podczas gdy PL i L rosną lepiej w określonych środowiskach, S rośnie w podobnym stopniu we wszystkich trzech warunkach. Linia S nie jest w stanie wykorzystać poprawionych warunków odżywczych, ale lepiej radzi sobie ze wzrostem w warunkach bardzo niskiej zawartości składników odżywczych.W celu ekstrakcji DNA do sześciu liści znajdujących się w probówce do wirówki z dodatkiem sterylnego piasku należy dodać bufor AP1 z zestawu Qiagen DNEZ Plant DNA Prep Kit, a następnie rozetrzeć tkankę mikrościerką, aż do całkowitego rozbicia grudek. Ekstrakcję należy kontynuować zgodnie z instrukcją dołączoną do zestawu. Aby rozpocząć ekstrakcję RNA, należy przenieść trzy łodygi maris wraz z częścią okolicznych liści z krio probówki do probówki do wirówki. Do probówki należy dodać sterylny piasek i rozetrzeć tkankę za pomocą mikrościerki, aż zostanie ona drobno zmielona.Próbkę mieszaj w wstrząsarze typu vortex przez 15 sekund, aby wspomóc lizę, a następnie wiruj przez jedną minutę przy 13 000 RPM w celu osadzenia piasku i wszelkich zanieczyszczeń. Przenieś nadnadkład SNAT do kolumny wiążącej i kontynuuj przygotowanie RNA zgodnie z instrukcjami producenta. Po wyekstrahowaniu RNA z tkanki, dodaj do reakcji bufor 10 XDNA w objętości stanowiącej 1/10 objętości próbki RNA.Dodając 30 jednostek DNaz, inkubować reakcję w temperaturze 37°C przez 30 minut, a następnie w 70°C przez pięć minut. Przeprowadzić odwrotną transkrypcję przy użyciu zestawu Applied Biosystems RNA to cDNA. Zgodnie z instrukcjami producenta, inkubować reakcję w temperaturze 37°C przez jedną godzinę, a następnie w 95°C przez pięć minut.Na koniec naniesie 5 µL cDNA na żel agarozowy 1,5%, aby określić wydajność. Po przygotowaniu cDNA z lnu zostaje ono wykorzystane do qPCR. Przeprowadź qPCR, korzystając z systemu ABI StepOne.Wszystkie testy należy przeprowadzić w trzech powtórzeniach dla każdego przebiegu, a w celu przygotowania reakcji do QPCR należy wykorzystać gen housekeeping Acton jako kontrolę liczby kopii. Do każdej probówki należy dodać jeden mikrolitr odpowiedniej pary starterów. DNA CD należy rozcieńczyć do odpowiedniego stężenia i dodać dziewięć mikrolitrów do każdej probówki.Na koniec do każdej probówki dodaj 10 µL 2x cyberg green PCR master mix. Następnie ustaw program amplifikacji zgodnie z procedurą amplifikacji. Oblicz względne poziomy ekspresji na podstawie liczby cykli dla progu (threshold), wyznaczonej przez domyślne parametry w oprogramowaniu step one i potwierdzonej poprzez analizę krzywych amplifikacji.Amplifikacja PCR DNA wyizolowanego z liści w różnych pozycjach wzdłuż łodygi wykazuje pojawienie się pojedynczej kopii fragmentu DNA o długości 5,7 kilobazy, zwanego sekwencją insercji linii lub LIS one, gdy rośliny są hodowane w warunkach indukujących. LIS one pojawia się, gdy PL jest hodowany w indukujących warunkach niedoboru składników odżywczych i ostatecznie staje się homozygotyczny. W tym przypadku próbki liści od jeden do sześć pobierano w odstępach tygodniowych, przy czym próbka jeden była pobrana najwcześniej po wysiewie; następnie z próbek wyekstrahowano DNA.Amplifikacja PCR ujawnia obecność obu końców LAS one we wszystkich próbkach z wyjątkiem pierwszej. Odpowiada to zanikowi miejsca insercji unins i brakowi dowodów na jego obecność w piątym liściu podczas qPCR. Wyniki wskazują, że obecność LAS one lub inne zmiany genomiczne związane z indukcją wpływają na ekspresję genów w bezpośrednim sąsiedztwie a S one.Sześć przedstawionych tutaj genów wykazuje zróżnicowaną ekspresję w PL i S; cztery z tych genów mają wyższą ekspresję w pl, które nie posiada LIS one. Odwrotnie, dwa mają wyższą ekspresję w S, które posiada LIS one. Właśnie pokazaliśmy Państwu, jak hodować indukowalne linie lnu. Zatem genom zmienia się w odpowiedzi na środowisko wzrostu oraz cechy wzrostowe kolejnych pokoleń.Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że warunki hodowli muszą zostać powtórzone, aby zapewnić odtwarzalność indukowanych zmian. To wszystko. Wiem, że wielu z Państwa podchodzi sceptycznie do tego zjawiska, ale teraz możecie Państwo samodzielnie zreprodukować te obserwacje.Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

environmentally-induced-heritable-changes-in-flax

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Zmiany dziedziczne indukowane środowiskowo w lenie

Technika dwuniciowej interferencji RNA (dsRNAi) jest stosowana do obniżania poziomu genu reduktazy cynamoylokoenzymu A (ZmCCR1) w kukurydzy w celu obniżenia zawartości ligniny roślinnej. Regulacja w dół ligniny ze ściany komórkowej jest wizualizowana za pomocą analiz mikroskopowych i określana ilościowo metodą Klasona. Analizowane są zmiany składu hemicelulozy i celulozy krystalicznej.

Regulacja ligniny w dół Zea mays za pomocą dsRNAi i analizy ligniny Klason

Tutaj prezentujemy protokół przekształcania lnu za pomocą transformacji roślin za pośrednictwem Agrobacterium za pomocą dipu kwiatowego. Protokół ten jest prosty do wykonania i niedrogi, a mimo to zapewnia wyższy współczynnik transformacji niż obecnie dostępne metody transformacji lnu.

Przemiana lnu w zanurzeniu kwiatowym (Linum usitatissimum) w celu wytworzenia transgenicznych potomków o wysokim współczynniku transformacji

Ten protokół opisuje metodologię o wysokiej przepustowości do funkcjonalnego badania przesiewowego pod kątem dziedziczenia opartego na białkach u S. cerevisiae.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe w kierunku dziedziczenia na podstawie białek u S. cerevisiae

BLISS, protokół podwójnego etykietowania do badania dynamiki lignifikacji, został opracowany. Wykorzystując syntetyczne reportery monolignolu i sekwencyjną kombinację bioortogonalnych reakcji klikania SPAAC i CuAAC, metodologia ta toruje drogę do dogłębnej analizy czynników regulujących biogenezę lignin w planta.

Wizualizacja dynamiki zdrewniałości w roślinach za pomocą chemii kliknięć: Podwójne etykietowanie to BŁOGOŚĆ!

Tutaj prezentujemy protokół do analizy wzrostu Aspergillus flavus i produkcji aflatoksyn w ziarnach kukurydzy wyrażających białko przeciwgrzybicze. Używając szczepu A. flavus wykazującego ekspresję GFP, monitorowaliśmy infekcję i rozprzestrzenianie się grzyba w dojrzałych ziarnikach w czasie rzeczywistym. Test jest szybki, wiarygodny i powtarzalny.

Hamowanie wzrostu Aspergillus flavus i produkcji aflatoksyn w transgenicznej kukurydzy z ekspresją inhibitora α-amylazy z Lablab purpureus L.

Opisujemy metodę wywoływania owłosionych korzeni przez przemianę za pośrednictwem Agrobacterium rhizogenes w gryce tartarskiej (Fagopyrum tataricum). Może to być wykorzystane do zbadania funkcji genów i produkcji metabolitów wtórnych w gryce tartarskiej, może być wykorzystane do dowolnej transformacji genetycznej lub wykorzystane do innych roślin leczniczych po ulepszeniu.

Wywoływanie owłosionych korzeni przez przemianę za pośrednictwem Agrobacterium rhizogenes w gryce winnej (Fagopyrum tataricum)

Wczesny rozwój zależy od produktów dziedziczonych po matce, a rola wielu z tych produktów jest obecnie nieznana. W tym miejscu opisaliśmy protokół, który wykorzystuje CRISPR-Cas9 do identyfikacji fenotypów efektu matczynego w jednym pokoleniu.

Określanie roli genów ulegających ekspresji matki we wczesnym rozwoju za pomocą matczynych chrupek

Opisujemy podejście do pomiaru zmian w wydajności fotosyntezy w roślinach po traktowaniu niskim poziomemCO2 za pomocą fluorescencji chlorofilu.

Ocena efektywności fotosyntezy w mutantach fotooddechowych za pomocą analizy fluorescencji chlorofilu

Ten protokół opisuje interferencję RNA i test ChIP w celu zbadania epigenetycznego dziedziczenia indukowanego przez RNAi wyciszania i związanych z nim modyfikacji chromatyny u C. elegans.

Analiza międzypokoleniowego dziedziczenia epigenetycznego u C. elegans przy użyciu fluorescencyjnego reportera i immunoprecypitacji chromatyny (ChIP)

Opracowaliśmy metodę odpowiedzi wizualno-motorycznej (Visual-Motor Response), aby ilościowo określić reakcję motoryczną larw zebrafish w odpowiedzi na przyrosty i spadki natężenia światła. Zbadaliśmy również mutanty wzroku zebrafish, w tym mutanty z brakiem odpowiedzi optokinetycznej (nrc), które uznano za całkowicie niewidome podczas testowania za pomocą innego badania wzroku – odruchu optokinetycznego.

Test behawioralny do pomiaru reaktywności rybek zebrafish na zmiany natężenia światła

Poznaj metodę wywoływania dziedzicznych zmian genomowych u lnu poprzez stres odżywczy. Technika PCR i Q-R-T-P-C-R pozwala monitorować zmiany genetyczne i ekspresji genów w kolejnych pokoleniach roślin.

Indukowane środowiskowo dziedziczne zmiany u lnu

Przeglądaj więcej filmów