Wywołane przez środowisko dziedziczne zmiany w lnie

Ogólnym celem tej procedury jest zademonstrowanie metody uprawy indukowalnej odmiany lnu w warunkach, które skutkują dziedziczną zmiennością genomu. Ponadto monitorowane są zmiany genomowe i obserwowany jest wzrost indukowanych roślin w kolejnych pokoleniach w różnych środowiskach. Aby to osiągnąć, len jest uprawiany w różnych warunkach indukcyjnych.

Tkanka liści i łodyg Maris jest następnie pobierana w różnych momentach wzrostu roślin w różnych środowiskach. Następnie DNA i RNA są izolowane z próbek tkanek. Ostatnim etapem procedury jest wykonanie PCR z wykorzystaniem próbek DNA oraz Q-R-T-P-C-R z wykorzystaniem wyizolowanego RNA w celu identyfikacji zmian genomowych i zmian ekspresji genów wynikających ze wzrostu w różnych warunkach środowiskowych.

Ostatecznie można uzyskać wyniki pokazujące odpowiedź genomową na warunki wzrostu z pojawieniem się jednego elementu insercji LIS w określonym punkcie genomu i różnicami w ekspresji związanymi z obecnością tego pierwiastka, jak uwidoczniono za pomocą PCR i R-T-P-C-R wykonanych z kwasem nukleinowym wyizolowanym z tkanek traktowanych roślin. Cześć, nazywam się Chris Cull i pracuję na Wydziale Biologii Uniwersytetu Case Western Reserve. Nazywam się Cory Johnson i pracuję w Cull Lab.

Nazywam się Tiffany Moss i również pracuję w laboratorium uboju. A ja nazywam się Marshall Lucas. Studentka studiów licencjackich w ramach letniego programu badań licencjackich w laboratorium Cull.

Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania zmian w genomie i ekspresji genów wynikających ze zmian w środowisku wzrostu. Więc zacznijmy. Aby uprawiać len w sprzyjających warunkach, zacznij od wypełnienia pięciocalowych doniczek ziemią i ujędrnienia.

Następna roślina, trzy nasiona lnu w doniczce, głębokość ćwierć cala. Następnie z gleby nad nasionami w nieindukujących warunkach kontrolnych. Podlewaj rośliny 100 mililitrami jednego cudownego roztworu do uprawy o mocy 10.

Potraktuj rośliny w warunkach wysokiej zawartości składników odżywczych 100 mililitrami pełnej mocy. Cudowny wzrost. Na koniec aplikuj.

Wodę należy spuszczać tylko z roślin o niskiej zawartości składników odżywczych. Uprawiaj rośliny w naturalnym świetle latem, gdy rośliny rosną. Podlewaj wszystkie rośliny automatycznym systemem opryskiwania dwa razy dziennie przez pięć minut.

Stosuj warunki wzrostu do roślin raz w tygodniu. Zbieraj liście w łodygi mari w odstępach tygodniowych. Sześć liści zbiera się do ekstrakcji DNA, a trzy łodygi me są potrzebne do ekstrakcji RNA Po pobraniu umieść materiał roślinny w fiolce kriogenicznej, szybko zamroź go w ciekłym azocie i przechowuj próbki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do momentu ekstrakcji.

Te trzy genotypy rosną w różnym względnym tempie w zależności od warunków. W warunkach kontrolnych najlepiej rośnie wsobna odmiana lnu storm lub linia PL. Od tego rodzica wywodziło się kilka linii, przy czym odmiana duża lub L była bardziej żywotna niż odmiana mała lub S.

Jednak przy niskiej zawartości składników odżywczych S rośnie lepiej niż L lub pl. A w warunkach wysokiej zawartości składników odżywczych L rośnie lepiej niż pl, która rośnie tylko nieznacznie lepiej niż S. Porównanie każdej z linii uprawianych pod trzema różnymi zabiegami pokazuje, że PL rośnie najlepiej w warunkach kontrolnych. L najlepiej rośnie w warunkach wysokiej zawartości składników odżywczych, a S rośnie podobnie zarówno w warunkach wysokiej zawartości składników odżywczych, jak i w warunkach kontrolnych.

Dane te pokazują, że te trzy linie można rozróżnić na podstawie ich wzrostu w trzech środowiskach. Podczas gdy PL i L rosną lepiej w określonych środowiskach, S rośnie mniej więcej tak samo we wszystkich trzech warunkach. S nie jest w stanie wykorzystać lepszych warunków odżywczych, ale jest w stanie lepiej rosnąć w warunkach bardzo niskiej zawartości składników odżywczych.

Do ekstrakcji DNA dodaj bufor, AP jeden z rośliny Qiagen, DNEZ, zestaw do przygotowania DNA do sześciu liści ze sterylnym piaskiem w mikro probówce fuge, zmiel tkankę mikro tłuczkiem, aż nie będą widoczne żadne grudki. Kontynuuj ekstrakcję, postępując zgodnie z instrukcjami zestawu, zgodnie z instrukcjami, aby rozpocząć transfer ekstrakcji RNA, trzech łodyg maris oraz kilku otaczających liści z fiolki kriogenicznej do przechowywania do probówki z mikro fuge. Dodaj sterylny piasek do probówki i zmiel tkankę za pomocą mikrotłuczka, aż zostanie drobno zmielona.

Wiruj próbkę przez 15 sekund, aby wspomóc lizę, a następnie wiruj przez jedną minutę z prędkością 13 000 obr./min, aby zebrać piasek i wszelkie zanieczyszczenia. Dodaj SNAT do kolumny wirowej i kontynuuj przygotowanie RNA zgodnie z instrukcjami producenta. Po wyekstrahowaniu RNA z tkanki przenieś 10 XDNA na jedną dziesiątą objętości próbki RNA do reakcji.

I przy 30 jednostkach D Ns inkubować reakcję w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut, a następnie w temperaturze 70 stopni Celsjusza przez pięć minut. Wykonaj odwrotną transkrypcję za pomocą zastosowanego zestawu biosystems RNA do CD NA. Zgodnie z instrukcjami producentów i S inkubuj reakcję w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę, a następnie w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez pięć minut.

Na koniec uruchom pięć mikrolitrów CDNA na 1,5% żelu AROS, aby określić wydajność. Po przygotowaniu płyty CD NA z lnu stosuje się ją do QPCR. Przeprowadź QPCR przy użyciu systemu A BI Krok pierwszy.

Wykonaj wszystkie testy w trzech egzemplarzach dla każdej serii i użyj Gene Acton jako kontrolki liczby kopii do przygotowania reakcji do QPCR. Dodaj jeden mikrolitr odpowiedniej pary starterów do każdej probówki. Rozcieńczyć CD NA do odpowiedniego stężenia i dodać dziewięć mikrolitrów do każdej probówki.

Na koniec dodaj 10 mikrolitrów dwóch x cyberg green PCR master mix do każdej probówki. Następnie skonfiguruj program wzmacniający po wzmocnieniu. Oblicz względne poziomy wyrażenia na podstawie numeru cyklu dla progu, który jest określany przez domyślne parametry w oprogramowaniu kroku pierwszego i potwierdzony przez inspekcję krzywych wzmocnienia.

Amplifikacja PCR z DNA, wyizolowana z liści w różnych miejscach wzdłuż łodygi, pokazuje pojawienie się pojedynczej kopii 5,7 kilozasady, fragmentu DNA zwanego sekwencją insercji linii lub sekwencją INSER, gdy rośliny są uprawiane w warunkach indukcyjnych. LIS one pojawia się, gdy PL jest uprawiana w warunkach niskiej zawartości składników odżywczych i ostatecznie staje się homozygotyczna. Tu. Próbki liści od pierwszej do szóstej izolowano w odstępach tygodniowych, przy czym próbka pierwsza była najwcześniejsza po zszyciu, a następnie wyekstrahowano DNA z próbek.

Amplifikacja PCR ujawnia obecność obu końców LAS po jednym we wszystkich próbkach z wyjątkiem pierwszej. Odpowiada to zniknięciu miejsca wstawionego unina i braku dowodów na to przez QPCR piątego liścia. Wyniki pokazują, że obecność LAS one lub innych zmian genomowych związanych z indukcją wpływa na ekspresję genów w bezpośrednim sąsiedztwie genu S.

Sześć pokazanych tutaj genów ma różną ekspresję w PL i S Cztery geny mają wyższą ekspresję w pl, który nie ma LIS jeden. I odwrotnie, dwa mają wyższą ekspresję w S, który ma jeden LIS, właśnie pokazaliśmy, jak wyhodować indukowane linie lnu. Tak więc genom zmienia się w odpowiedzi na środowisko wzrostu i charakterystykę wzrostu kolejnych pokoleń.

Wykonując tę procedurę, należy pamiętać, że warunki wzrostu muszą zostać odtworzone, aby można było odtworzyć zmiany. Więc to wszystko. Wiem, że wielu z was jest sceptycznie nastawionych do tego zjawiska, ale teraz możecie sami odtworzyć te obserwacje.

Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.