Name: Analiza międzypokoleniowego dziedziczenia epigenetycznego u C. elegans przy użyciu fluorescencyjnego reportera i immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-05T12:10:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Poznaj metodę analizy dziedziczenia epigenetycznego u C. elegans wykorzystującą reporter GFP i immunoprecypitację chromatyny. Protokół ten umożliwia badanie mechanizmów dziedziczenia RNAi oraz modyfikacji chromatyny w wielu pokoleniach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Pragniemy podziękować laboratoriom w społeczności C. elegans, które opracowały i udostępniły narzędzia i których praca jest cytowana w tym manuskrypcie. Niektóre szczepy zostały dostarczone przez CGC, które jest finansowane przez Biuro Programów Infrastruktury Badawczej NIH (P40 OD010440). Praca ta była wspierana przez grant Kanadyjskiego Instytutu Badań nad Zdrowiem (CIHR) dla A.L.S. (PJT-175245). CL jest wspierany przez stypendium podyplomowe Kanadyjskiej Rady ds. Nauk Przyrodniczych i Inżynierii (NSERC) (PGS-D).

Epigenetic Inheritance and ChIP in Caenorhabditis elegans

<ol><li>Alcazar, R. M., Lin, R., Fire, A. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+dynamics+of+heritable+silencing+induced+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Transmission dynamics of heritable silencing induced by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 180 (3), 1275-1288 (2008).</li>
<li>Ashe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((piRNAs+can+trigger+a+multigenerational+epigenetic+memory+in+the+germline+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">piRNAs can trigger a multigenerational epigenetic memory in the germline of C. elegans.</a> Cell. 150 (1), 88-99 (2012).</li>
<li>Buckley, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nuclear+Argonaute+promotes+multigenerational+epigenetic+inheritance+and+germline+immortality%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A nuclear Argonaute promotes multigenerational epigenetic inheritance and germline immortality.</a> Nature. 489 (7416), 447-451 (2012).</li>
<li>Vastenhouw, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+gene+silencing+by+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Long-term gene silencing by RNAi.</a> Nature. 442 (7105), 882(2006).</li>
<li>Lee, H. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+piRNAs+mediate+the+genome-wide+surveillance+of+germline+transcripts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">C. elegans piRNAs mediate the genome-wide surveillance of germline transcripts.</a> Cell. 150 (1), 78-87 (2012).</li>
<li>Luteijn, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extremely+stable+Piwi-induced+gene+silencing+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Extremely stable Piwi-induced gene silencing in Caenorhabditis elegans.</a> The EMBO Journal. 31 (16), 3422-3430 (2012).</li>
<li>Sapetschnig, A., Sarkies, P., Lehrbach, N. J., Miska, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tertiary+siRNAs+mediate+paramutation+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Tertiary siRNAs mediate paramutation in C. elegans.</a> PLoS Genetics. 11 (3), e1005078(2015).</li>
<li>Shirayama, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((piRNAs+initiate+an+epigenetic+memory+of+nonself+RNA+in+the+C.+elegans+germline%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">piRNAs initiate an epigenetic memory of nonself RNA in the C. elegans germline.</a> Cell. 150 (1), 65-77 (2012).</li>
<li>Minkina, O., Hunter, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+heritable+germline+silencing+directs+somatic+silencing+at+an+endogenous+locus%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Stable heritable germline silencing directs somatic silencing at an endogenous locus.</a> Molecular Cell. 65 (4), 659-670 (2017).</li>
<li>Seroussi, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+epigenetic+regulation+by+C.+elegans+nuclear+RNA+interference+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+%26+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of epigenetic regulation by C. elegans nuclear RNA interference pathways.</a> Seminars in Cell & Developmental Biology. 127, 142-154 (2022).</li>
<li>Lev, I., Gingold, H., Rechavi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H3K9me3+is+required+for+inheritance+of+small+RNAs+that+target+a+unique+subset+of+newly+evolved+genes%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">H3K9me3 is required for inheritance of small RNAs that target a unique subset of newly evolved genes.</a> eLife. 8, e40448(2019).</li>
<li>Woodhouse, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+modifiers+SET-25+and+SET-32+are+required+for+establishment+but+not+long-term+maintenance+of+transgenerational+epigenetic+inheritance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Chromatin modifiers SET-25 and SET-32 are required for establishment but not long-term maintenance of transgenerational epigenetic inheritance.</a> Cell Reports. 25 (8), 2259-2272 (2018).</li>
<li>Houri-Zeevi, L., Teichman, G., Gingold, H., Rechavi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+resets+ancestral+heritable+small+RNA+responses%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Stress resets ancestral heritable small RNA responses.</a> eLife. 10, e65797(2021).</li>
<li>Houri-Ze'evi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tunable+mechanism+determines+the+duration+of+the+transgenerational+small+RNA+inheritance+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A tunable mechanism determines the duration of the transgenerational small RNA inheritance in C. elegans.</a> Cell. 165 (1), 88-99 (2016).</li>
<li>Spracklin, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNAi+inheritance+machinery+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The RNAi inheritance machinery of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 206 (3), 1403-1416 (2017).</li>
<li>Perales, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenerational+epigenetic+inheritance+is+negatively+regulated+by+the+HERI-1+chromodomain+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Transgenerational epigenetic inheritance is negatively regulated by the HERI-1 chromodomain protein.</a> Genetics. 210 (4), 1287-1299 (2018).</li>
<li>Shukla, A., Perales, R., Kennedy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((piRNAs+coordinate+poly%28UG%29+tailing+to+prevent+aberrant+and+perpetual+gene+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">piRNAs coordinate poly(UG) tailing to prevent aberrant and perpetual gene silencing.</a> Current Biology. 31 (20), 4473-4485 (2021).</li>
<li>Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+GeneticsWormBook%3A+the+Online+Review+of+C.+elegans+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Reverse GeneticsWormBook: the Online Review of C. elegans Biology.</a> WormBook. , https://www.ncbi.nim.nih.gov/books/NBK19711/ (2006).</li>
<li>Rivera Gomez, K., Schvarzstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilization+of+nematodes+for+live+imaging+using+an+agarose+pad+produced+with+a+Vinyl+Record%5BTitle%5D)+AND+%22microPublication+Biology%22%5BJournal%5D)">Immobilization of nematodes for live imaging using an agarose pad produced with a Vinyl Record.</a> microPublication Biology. 2018, (2018).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%3A+The+Online+Review+of+C.+Elegans+Biology%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook: The Online Review of C. Elegans Biology. , 1-11 (2006).</li>
<li>Askjaer, P., Ercan, S., Meister, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modern+techniques+for+the+analysis+of+chromatin+and+nuclear+organization+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%3A+the+Online+Review+of+C.+elegans+Biology%22%5BJournal%5D)">Modern techniques for the analysis of chromatin and nuclear organization in C. elegans.</a> WormBook: the Online Review of C. elegans Biology. , 1-35 (2014).</li>
<li>Gu, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplification+of+siRNA+in+Caenorhabditis+elegans+generates+a+transgenerational+sequence-targeted+histone+H3+lysine+9+methylation+footprint%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Amplification of siRNA in Caenorhabditis elegans generates a transgenerational sequence-targeted histone H3 lysine 9 methylation footprint.</a> Nature Genetics. 44 (2), 157-164 (2012).</li>
<li>Kalinava, N., Ni, J. Z., Peterman, K., Chen, E., Gu, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoupling+the+downstream+effects+of+germline+nuclear+RNAi+reveals+that+H3K9me3+is+dispensable+for+heritable+RNAi+and+the+maintenance+of+endogenous+siRNA-mediated+transcriptional+silencing+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics+%26+Chromatin%22%5BJournal%5D)">Decoupling the downstream effects of germline nuclear RNAi reveals that H3K9me3 is dispensable for heritable RNAi and the maintenance of endogenous siRNA-mediated transcriptional silencing in Caenorhabditis elegans.</a> Epigenetics & Chromatin. 10, 6(2017).</li>
<li>Kalinava, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((elegans+heterochromatin+factor+SET-32+plays+an+essential+role+in+transgenerational+establishment+of+nuclear+RNAi-mediated+epigenetic+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">elegans heterochromatin factor SET-32 plays an essential role in transgenerational establishment of nuclear RNAi-mediated epigenetic silencing.</a> Cell Reports. 25 (8), 2273-2284 (2018).</li>
<li>Lev, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MET-2-dependent+H3K9+methylation+suppresses+transgenerational+small+RNA+inheritance%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">MET-2-dependent H3K9 methylation suppresses transgenerational small RNA inheritance.</a> Current Biology. 27 (8), 1138-1147 (2017).</li>
<li>Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effectiveness+of+specific+RNA-mediated+interference+through+ingested+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Genome Biology. 2 (1), (2001).</li>
<li>Xu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cytoplasmic+Argonaute+protein+promotes+the+inheritance+of+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A cytoplasmic Argonaute protein promotes the inheritance of RNAi.</a> Cell Reports. 23 (8), 2482-2494 (2018).</li>
<li>Grishok, A., Tabara, H., Mello, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+requirements+for+inheritance+of+RNAi+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genetic requirements for inheritance of RNAi in C. elegans.</a> Science. 287 (5462), 2494-2497 (2000).</li>
<li>Houri-Zeevi, L., Korem Kohanim, Y., Antonova, O., Rechavi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+rules+explain+transgenerational+small+RNA+inheritance+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Three rules explain transgenerational small RNA inheritance in C. elegans.</a> Cell. 182 (5), 1186-1197 (2020).</li>
<li>Burton, N. O., Burkhart, K. B., Kennedy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+RNAi+maintains+heritable+gene+silencing+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Nuclear RNAi maintains heritable gene silencing in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (49), 19683-19688 (2011).</li>
<li>Mao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Nrde+pathway+mediates+small-RNA-directed+histone+H3+lysine+27+trimethylation+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">The Nrde pathway mediates small-RNA-directed histone H3 lysine 27 trimethylation in Caenorhabditis elegans.</a> Current Biology. 25 (18), 2398-2403 (2015).</li>
<li>Landt, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq+guidelines+and+practices+of+the+ENCODE+and+modENCODE+consortia%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia.</a> Genome Research. 22 (9), 1813-1831 (2012).</li>
<li>Mukhopadhyay, A., Deplancke, B., Walhout, A. J. M., Tissenbaum, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation+%28ChIP%29+coupled+to+detection+by+quantitative+real-time+PCR+to+study+transcription+factor+binding+to+DNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation (ChIP) coupled to detection by quantitative real-time PCR to study transcription factor binding to DNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Protocols. 3 (4), 698-709 (2008).</li>
</ol>

Wszyscy autorzy potwierdzają, że nie mają żadnych konfliktów do ujawnienia.

W tym protokole dsRNA jest wprowadzane przez karmienie, które stało się standardową metodą u C. elegans18. W przypadku testów dziedziczenia RNAi podejście żywieniowe zapewnia łatwą metodę uzyskania dużej populacji P0 2,11,12,22,23,24,25. Jednak czas i czas trwania ekspozycji na RNAi wpływa na skuteczność wyciszania transgenu26, a stężenie bakterii RNAi wpływa na trwałość dziedzicznego wyciszania RNAi1. Dlatego standaryzowane bakterie RNAi i wzrost robaków są ważne dla uzyskania stałego poziomu wyciszenia GFP i czasu trwania dziedziczenia. W tym przypadku zarodki są siane na płytkach RNAi, dzięki czemu zwierzęta P0 są narażone na działanie bakterii RNAi od wyklucia. Alternatywne podejścia polegały na umieszczeniu zsynchronizowanych zwierząt w stadium L124,27 lub L425 na płytkach RNAi-NGM. Ponadto, ponieważ głód i inne stresy wpływają na utrzymanie dziedziczenia RNAi13, talerze muszą być monitorowane, aby zapobiec przepełnieniu i wyczerpaniu zapasów żywności. Jako alternatywę dla inicjowania RNAi przez karmienie, niektóre z pionierskich badań dziedziczenia RNAi C. elegans indukowały RNAi poprzez wstrzyknięcie gonad, co zapewnia większą kontrolę stężenia dsRNA 1,28.
W tym protokole każde pokolenie jest pasażowane jako populacja z alkalicznym traktowaniem podchlorynem, jak opisano wcześniej 16,22,23,24. Leczenie podchlorynem zapewnia, że pokolenie F1 nie zostanie skażone bakteriami RNAi ze środowiska rodzicielskiego22 i zapobiega potencjalnemu niepożądanemu wąskiemu gardłu populacji. Jednak masowe pasażowanie może być również ograniczeniem, ponieważ poszczególne zwierzęta mogą mieć różne wzorce dziedziczenia 1,29. Alternatywną metodą ustalania każdego pokolenia jest selekcja pojedynczych zwierząt 1,2,9,11,25. Takie podejście pozwala na śledzenie fenotypów w obrębie linii genetycznych i włączanie krzyżówek genetycznych. Analiza pochodzenia może być również korzystna dla fenotypów o niskiej penetracji12.
Ekspresja białek fluorescencyjnych jest potężnym i wygodnym odczytem wyciszania indukowanego przez RNAi 2,3,4,12,14,15,16,25,30. Zgodnie z opisem w tym protokole, wyrażenie GFP może być ręcznie oceniane jako ON lub OFF 11,12,15,16,25. Ręczną punktację można dodatkowo udoskonalić, przypisując jakościowe poziomy intensywności 3,4,14. Alternatywnie, zautomatyzowana ocena intensywności obrazów mikroskopowych 11,12,14,25,27 lub pomiar fluorescencji żywych zwierząt za pomocą cytometrii przepływowej 2 mogą zapewnić ilościowy i wysokoprzepustowy odczyt. Ponieważ jednak ekspresja reporterowa jest ograniczona do linii zarodkowej, zastrzeżenie zautomatyzowanych podejść polega na tym, że muszą one również rozróżniać zwierzęta z wyciszoną ekspresją GFP i zwierzęta bez linii zarodkowej, zwłaszcza jeśli badanie obejmuje mutanty z nieprawidłowym rozwojem linii zarodkowej. Jako alternatywę dla fluorescencji GFP, odwrotna transkrypcja (RT)-qPCR może być stosowana do ilościowego określania docelowych poziomów RNAi pre-mRNAi mRNA 2,16,23,24. Takie podejście zapewnia bardziej bezpośredni odczyt wyciszania, które jest ukierunkowane na RNA i jest szczególnie przydatne w przypadku innych celów RNAi, w których wyciszanie nie wytwarza widocznego fenotypu. Ograniczeniem stosowania sztucznych reporterów GFP jest to, że sekwencje egzogenne i endogenne są różnie regulowane w międzypokoleniowym RNAi11. Badania z celami endogennymi, takimi jak wrażliwy na temperaturę embrionalny śmiertelny allel oma-1(zu405)1,11,16,25, powinny być zatem uważane za podejście uzupełniające do fluorescencyjnych reporterów transgenowych.
Analiza ChIP w kontekście testów dziedziczenia RNAi wymaga porównania między traktowanymi i powtórzonymi próbami. Po pierwsze, aby uwzględnić różnice w materiale wyjściowym między próbkami, sygnał ChIP jest normalizowany do sygnału wejściowego w tym samym miejscu, co "procent wejścia". Równoległe przetwarzanie histonu H3 ChIP pomoże określić, czy jakiekolwiek zmiany modyfikacji histonu odpowiadają zmianom gęstości nukleosomów. Ponadto, ponieważ ChIP jest procesem wieloetapowym, wydajność może się różnić w zależności od próbki. Wybór odpowiednich loci kontroli dodatniej i ujemnej jest przydatny do oceny i porównania stosunku sygnału do szumu między próbkami i eksperymentami. Ponadto, aby ułatwić porównania między próbkami, wartości progowe cyklu qPCR ChIP DNA w miejscu docelowym RNAi są często normalizowane do locus kontrolnego 3,11,15,23,30,31. Aby ocenić efekty leczenia RNAi, porównuje się również stosunek sygnału ChIP w warunkach RNAi poddanych działaniu RNAi w porównaniu z warunkami kontrolnymi lub brakiem RNAi. Ograniczeniem obecnego podejścia jest to, że ChIP przeprowadza się na całych zwierzętach, podczas gdy odpowiedź na leczenie RNAi może być unikalna dla linii zarodkowej. Podejściem do przezwyciężenia tego zastrzeżenia jest wykonanie ChIP przy użyciu izolowanych jąder linii zarodkowej. Dodatkowe zagadnienia techniczne dotyczące optymalizacji ChIP zostały również szeroko omówione w innym miejscu32,33.
Ogólnie rzecz biorąc, ten protokół dziedziczenia RNAi i ChIP zapewnia szczegółową i łatwą do dostosowania podstawę, którą można zintegrować z innymi technikami w celu dalszego zbadania międzypokoleniowej regulacji epigenetycznej. Na przykład biblioteki sekwencjonowania o wysokiej przepustowości można skonstruować z DNA ChIP (ChIP-seq), aby uzyskać bardziej szczegółowy obraz krajobrazu chromatyny zarówno proksymalnie do celu RNAi, jak i w skali całego genomu.

Dziedziczenie epigenetyczne pozwala na przekazywanie informacji regulacyjnych genów między pokoleniami, a zatem może pozwolić środowisku lub doświadczeniom rodziców wpływać na ich potomstwo. U C. elegans wyciszenie genu linii zarodkowej zainicjowane przez egzogenny dwuniciowy RNA (dsRNA) może być dziedziczone przez wiele pokoleń u potomstwa, które nie jest narażone na oryginalny wyzwalacz1,2,3,4. Proces ten, określany jako dziedziczenie interferencji RNA (RNAi), jest jednym z kilku powiązanych epigenetycznych zjawisk wyciszania u C. elegans, w tym wielopokoleniowego wyciszania inicjowanego przez piRNA2,5, paramutacja/RNAe (wyciszanie epigenetyczne indukowane RNA)6,7,8 oraz wyciszanie inicjowane przez tablicę multikopii9, które mają pokrywające się, ale odrębne wymagania dotyczące małych mechanizmów regulacji RNA i chromatyny. W egzogennym RNAi C. elegans, dsRNA jest przetwarzane na małe interferujące RNA (siRNA), które działają w kompleksie z pierwotnymi białkami Argonaute, aby rozpoznać ich docelowe mRNA. To celowanie prowadzi do amplifikacji wtórnych siRNA, które łączą się z wtórnymi Argonautami w celu wyciszenia docelowego mRNA zarówno przez cytoplazmatyczne, jak i jądrowe szlaki wyciszania. W przypadku celów RNAi wyrażanych w linii zarodkowej, jądrowy wtórny Argonaute HRDE-1 i dodatkowe jądrowe czynniki RNAi celują w powstające transkrypty, powodując represję transkrypcyjną i rekrutację metylotransferaz histonowych do deponowania represyjnych znaczników chromatyny, w tym H3K9me310. Histon H3K9me3 sprzyja dziedzicznemu wyciszaniu transgenów białka zielonej fluorescencji (GFP) wyrażanego przez linię zarodkową poprzez dziedziczenie RNAi11,12.
Celem tego protokołu jest użycie transgenu wyrażającego białko fuzyjne GFP-histon w linii zarodkowej jako reportera do dziedziczenia RNAi oraz zbadanie zmian w modyfikacjach histonów w locus transgenu reporterowego za pomocą immunoprecypitacji chromatyny i ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy (ChIP-qPCR). Protokół ten opisuje ustandaryzowane podejście do podawania RNAi na płytkach w celu zainicjowania wyciszania reporterowego. Przedstawiono w nim również szczegółowy harmonogram pasażowania zwierząt między pokoleniami poprzez izolowanie zarodków w macicy od ciężarnych dorosłych osobników za pomocą alkalicznego podchlorynu ("bielenie"). Opisano również metody i reprezentatywne dane do monitorowania częstości wyciszania GFP w podgrupie populacji za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej oraz dla histonu H3K9me3 ChIP-qPCR. Testy dziedziczenia RNAi oparte na reporterach zapewniają wysoce elastyczny system do funkcjonalnej analizy ról czynników genetycznych i środowiskowych w regulacji epigenetycznej13,14, a badania genetyczne wykorzystujące takie reportery zidentyfikowały oba geny, które są wymagane dla2,3,15 oraz geny, które negatywnie regulują16,17 czas trwania międzypokoleniowego dziedziczenia epigenetycznego.

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>Bioshop</td><td>AGA002</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Bioshop</td><td>AMP201</td><td>Przygotować roztwór o stężeniu 100 mg/ml w wodzie ultraczystej. Filtrować-sterylizować i przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>Przeciwciało poliklonalne anty-H3K9me3 królika</td><td>Abcam</td><td>ab8898</td><td>Stężenie jest zależne od partii (0,9 - 1 mg / ml).</td></tr><tr><td>Przeciwciało poliklonalne przeciw histonowi H3 królika</td><td>Abcam</td><td>ab1791</td><td>Stężenie zależy od partii (0,7 - 1 mg / ml).</td></tr><tr><td>Wybielacz (6% podchloryn sodu)</td> <td>Szczep Lavo</td><td>02358107</td><td></td></tr><tr><td>C. elegans z GFP RNAi Reporter</td><td>NA</td><td>, SX1263</td>, <td>Sapetschnig i in., 2015 (ref. 7). Prezent od laboratorium E. Miska, University of Cambridge.</td></tr><tr><td>Carbenicillin</td><td>BioShop</td><td>CAR544</td><td>Przygotuj roztwór o stężeniu 25 mg/ml w ultraczystej wodzie. Filtrować-sterylizować i przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>Dynabeads Białko G Koraliki magnetyczne</td><td>Invitrogen</td><td>10003D</td><td></td></tr><tr><td>E. coli szczep HT115(DE3)</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td>HT115(DE3)</td><td></td></tr><tr><td>E. coli szczep OP50-1</td><td>Centrum Genetyki Caenorhabditis (CGC)</td><td>OP50-1</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (0,5 M, pH 8,0)</td><td>Invitrogen</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>fluorescencji Stereoskop</td><td>Zeiss</td><td>Axio Zoom.V16</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd (37%)</td><td>Sigma</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>Glicyna</td><td>Sigma</td><td>50046</td><td>Przygotować 1,25 M roztwór i przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>HEPES-KOH (1 M, pH 7,5)</td><td>Teknova</td><td>H1035</td><td></td></tr><tr><td>Hydrofobowe szkiełka z nadrukiem, 10 dołków</td><td>VWR</td><td>100488-904</td><td></td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630 (etoksylowany oktylofenol)</td><td>BioShop</td><td>NON999</td><td>Przygotuj 10% (v/v) roztwór w ultraczystej wodzie i przechowuj w temperaturze pokojowej.</td></tr><tr><td>IPTG (Izopropylo-&beta;-D-tiogalaktozyd)</td><td>BioShop</td><td>IPT001</td><td>Przygotuj roztwór o stężeniu 0,2 g/ml w ultraczystej wodzie. Filtrować-sterylizować i przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>iTaq Universal SYBR Green Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>1725122</td><td></td></tr><tr><td>LB Płytki agarowe uzupełnione o 100 &mikro; g/ml Ampicylina</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Standardowa receptura laboratoryjna.</td></tr><tr><td>Lewamizol (chlorowodorek tetramizolu)</td><td>Sigma</td><td>L9756</td><td>Przygotować 200 mM roztwór w ultraczystej wodzie. Przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>LiCl (8 m)</td><td>Sigma</td><td>L7026</td><td></td></tr><tr><td>M9 Bufor</td><td>NA</td><td>NA 22</td><td>mM KH2PO4, 42 mM Na2HPO4, 86 mM NaCl, 1 mM MgSO4.</td></tr><tr><td>Separator magnetyczny (probówki 1,5 ml)</td><td>Applied Biosystems</td><td>A13346</td><td></td></tr><tr><td>Separator magnetyczny (probówki 0,2 ml)</td>Szkło pokrywowe mikroskopu <td>Permagen</td><td>MSR812</td><td></td></tr> Szkiełko mikroskopowe <tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>12541B</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko mikroskopowe</td><td>Wybór technologa</td><td>LAB-037</td><td></td></tr><tr><td>NaCl (5 M)</td><td>Promega</td><td>V4221</td><td>Do ChIP.</td></tr><tr><td>NaOH&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S5881</td><td>Przygotuj 10 M roztwór i przechowuj w temperaturze pokojowej.</td></tr><tr><td>Płytki</td><td>NGM NA</td><td>NA</td><td>1,7% (w/v) agar, 0,3% (w/v) NaCl, 0,25% (w/v) pepton, 1 mM CaCl2, 5 &mu; g/ml cholesterolu, 25 mM fosforanu potasu pH 6,0, 1 mM MgSO4, 50 i mikro; g/ml streptomycyny.</td></tr><tr><td>Normalna IgG królika (1 mg / ml)</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>2729</td><td></td></tr><tr><td>Szalki Petriego (35 mm x 10 mm)</td><td>Sarstedt</td><td>82.1135.500</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (10X)</td><td>Odczynniki Fisher</td><td>BP3991</td><td></td></tr><tr><td>Plazmid - Kontrolny RNAi&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>L4440 (Plasmid #1654)</td><td></td></tr><tr><td>Plazmid - RNAi&nbsp namierzający GFP&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>L4417 (Plazmid #1649)</td><td>Należy pamiętać, że można zastosować alternatywne plazmidy pochodzące z L4440 ukierunkowane na GFP.</td></tr><tr><td>Para starterów [-3.3 kb przed gfp]</td><td>Zintegrowane technologie DNA</td><td>NA</td><td>F: AAACCAAAGGACGAGAGATTCA, R: GGCTCGATCAAGTAAAATTTCG</td></tr><tr><td>Para starterów [+1.3 kb za gfp]</td><td>Zintegrowane technologie DNA</td><td></td><td>F: TCGACCAGTTCTAAAGTCACCG, R: ACGTGCGGGATCATTTCTTACT</td></tr><tr><td>Para starterów [CLEC-18]</td><td>Zintegrowane technologie DNA F</td><td></td><td>: TGCTCCATGACCTCAACAACA, R: AGTACAGTTCACCGATCCAGAGA</td></tr><tr><td>Para starterów [gfp exon 1]</td><td>Zintegrowane technologie</td><td>DNA</td><td>F: CTGGAGTTGTCCCAATTCTTGTGT, R: GGGTAAGTTTTCCGTATGTTGC</td></tr><tr><td>Para starterów [gfp exon 4]</td><td>Zintegrowane technologie DNA</td><td></td><td>F: GATGGCCCTGTCCTTTTACCA, R: ATGCCATGTGTAATCCCAGCA</td></tr><tr><td>Para starterów [HRP-2]Zintegrowane</td> <td>technologie DNA</td><td></td><td>F: CGTCAACAGGGAGCAGCTG, R: CCTCCGAACTTTCTCTCTCCA</td></tr><tr><td>Tabletka koktajlowa inhibitora proteazy</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaza K&nbsp;</td><td>Bioline</td><td>BIO-37084</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oczyszczania QIAquick PCR&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>System wykrywania PCR w czasie rzeczywistym</td><td>Bio-Rad</td><td>CFX96&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Płytki RNAi-ngm</td><td>NA</td><td>NA</td><td>1,7% (w/v) agar, 0,3% (w/v) NaCl, 0,25% (w/v) pepton, 1 mM CaCl2, 5 i mikro; g/ml cholesterolu, 25 mM bufor fosforanowy pH 6,0, 1 mM MgSO4, 25 i mikro; g/ml karbenicyliny i 5 mM IPTG.</td></tr><tr><td>RNaza A</td><td>Sigma</td><td>R4642</td><td></td></tr><tr><td>Sarkosyl (sól sodowa N-lauroilsarkozyny)</td><td>Sigma</td><td>L5777</td><td>Przygotować 10% (w/v) roztwór i przechowywać w temperaturze pokojowej, chronić przed światłem przez maksymalnie 1 miesiąc.</td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma</td><td>74255</td><td>Przygotować 10% (w/v) roztwór i przechowywać w temperaturze pokojowej.</td></tr><tr><td>Deoksycholan sodu</td><td>Sigma</td><td>30970</td><td>Przygotować 5% (w/v) roztwór i przechowywać w temperaturze pokojowej, chronić przed światłem maksymalnie przez 1 miesiąc.</td></tr><tr><td>Rurka Sonication Evergreen</td><td></td><td>214-3721-010</td><td></td></tr><tr><td>Nasadka rurki sonikacyjnej</td><td>Evergreen</td><td>300-2911-020</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Qsonica</td><td>Q800R3-110</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan streptomycyny</td><td>Bioshop</td><td>STP101</td><td>Przygotuj roztwór 50 mg/ml w ultraczystej wodzie. Filtrować-sterylizować i przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>Bufor TAE (1X)</td><td>NA</td><td>NA</td><td>40 mM Tris, 20 mM acetat, 1 mM EDTA</td></tr><tr><td>Tally counter clicker</td><td>Uline</td><td>H-7350</td><td></td></tr><tr><td>Tetracyklina</td><td>Bioshop</td><td>TET701</td><td>Przygotować roztwór 5 mg/ml w etanolu i przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>05-400-205</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl (1 M, pH 8,0)</td><td>Invitrogen</td><td>15568025</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td>Przygotować 10% (v/v) roztwór w ultraczystej wodzie i przechowywać w temperaturze pokojowej.</td></tr></tbody></table>

analiza międzypokoleniowego dziedziczenia epigenetycznego u c. elegans przy użyciu fluorescencyjnego reportera i immunoprecypitacji chromatyny (chip)

Analysis of Transgenerational Epigenetic Inheritance in C. elegans Using a Fluorescent Reporter and Chromatin Immunoprecipitation (ChIP)

Międzypokoleniowe dziedziczenie epigenetyczne (TEI) pozwala na przekazywanie informacji przez linię zarodkową bez zmiany sekwencji genomu, poprzez czynniki takie jak niekodujące RNA i modyfikacje chromatyny. Zjawisko dziedziczenia interferencji RNA (RNAi) u nicienia Caenorhabditis elegans jest skutecznym modelem do badania TEI, który wykorzystuje krótki cykl życiowy tego organizmu modelowego, jego samorozprzestrzenianie się i przezroczystość. W dziedziczeniu RNAi narażenie zwierząt na RNAi prowadzi do wyciszenia genów i zmienionych sygnatur chromatyny w locus docelowym, które utrzymują się przez wiele pokoleń przy braku początkowego wyzwalacza. Protokół ten opisuje analizę dziedziczenia RNAi u C. elegans przy użyciu reportera białka zielonej fluorescencji jądrowej (GFP) wyrażonego w linii zarodkowej. Wyciszanie reporterowe jest inicjowane przez karmienie zwierząt bakteriami wykazującymi ekspresję dwuniciowego RNA ukierunkowanego na GFP. W każdym pokoleniu zwierzęta są pasażowane w celu utrzymania zsynchronizowanego rozwoju, a wyciszanie genów reporterowych jest określane za pomocą mikroskopii. W wybranych pokoleniach populacje są zbierane i przetwarzane pod kątem immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) i ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy (qPCR) w celu zmierzenia wzbogacenia modyfikacji histonów w locus reporterowym GFP. Ten protokół badania dziedziczenia RNAi można łatwo modyfikować i łączyć z innymi analizami w celu dalszego badania czynników TEI w małych szlakach RNA i chromatyny.

Zwierzęta niosące reporter GFP-histony H2B [mex-5p::gfp-h2b::tbb-2 3'UTR]7 wykazujący ekspresję w linii zarodkowej (Rysunek 2A) poddano działaniu GFP RNAi lub kontrolnego RNAi poprzez podawanie w pokarmie, a następnie przeprowadzono pasażowanie zgodnie z opisem w protokole i na Rysunku 1. Sygnał GFP w jądrach komórek linii zarodkowej oceniano manualnie za pomocą fluorescencyjnego mikroskopu dissectingowego dla próbek populacji w każdym pokoleniu. Wyciszenie transgenu było w pełni penetrujące u ocenianych zwierząt P0 i F1 traktowanych GFP RNAi (Rysunek 2B). W pokoleniu F2 odsetek populacji wykazujący dziedziczenie wyciszenia GFP wynosił około 50%. Do pokolenia F5 większość populacji nie wykazywała dziedziczenia wyciszenia, a w pokoleniu F10 nie stwierdzono już żadnego dziedziczenia, ponieważ wszystkie zwierzęta wykazywały ekspresję GFP.
Aby określić zmianę wzbogacenia histony H3K9me3 odpowiadającą wyciszeniu indukowanemu przez RNAi, przeprowadzono analizę ChIP-qPCR u zwierząt pokolenia F1 po zastosowaniu RNAi przeciwko GFP lub kontrolnego RNAi. Zgodnie z oczekiwaniami, populacja traktowana RNAi GFP wykazała wyższy poziom histony H3K9me3 w obrębie celu GFP oraz w regionie 1,3 kb w dół rzeki w porównaniu do zwierząt traktowanych kontrolnym RNAi (Rycina 2C). Specyficzność ChIP dla histony H3K9me3 została potwierdzona poprzez wzbogacenie w locus kontroli pozytywnej (clec-18), w którym znane jest wzbogacenie tej modyfikacji, oraz brak wzbogacenia w pobliskim locus kontroli negatywnej (hrp-2). Zgodnie z oczekiwaniami, we wszystkich locus qPCR wykryto również wzbogacenie histony H3 oraz wzbogacenie na poziomie tła w immunoprecypitacjach kontrolnych z użyciem IgG. Po normalizacji wzbogacenia ChIP dla reportera do locus kontroli pozytywnej clec-18, wykazano wyższe wzbogacenie histony H3K9me3 po zastosowaniu RNAi GFP, podczas gdy wzbogacenie histony H3 było podobne dla obu grup traktowanych (Rycina 2D). Ponieważ nie oczekuje się, aby RNAi GFP wpływało na poziom H3K9me3 lub całkowite zajęcie histony H3 w locus clec-18, normalizacja ta niweluje zmienność techniczną, taką jak różnice w wydajności ChIP pomiędzy próbkami RNAi GFP a kontrolnymi. Krotność zmiany poziomu histony H3K9me3 i histony H3 pomiędzy grupami traktowanymi RNAi wykazuje specyficzne dla reportera GFP wzbogacenie histony H3K9me3, niezależne od zajęcia histonów, po wyciszeniu indukowanym przez RNAi GFP (Rycina 2E).
<img alt="Wpływ RNAi na wyciszanie GFP i metylację histonów; diagramy i wykresy; badanie ekspresji genów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65285/65285fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Wyciszanie GFP indukowane przez RNAi odpowiada zwiększonemu wzbogaceniu H3K9me3 w miejscu docelowym RNAi. (A) Schemat reportera RNAi GFP mjIs134[mex-5p::gfp-h2b::tbb-2 3'UTR] wyrażanego w linii zarodkowej z zaznaczonymi regionami amplikonów qPCR. (B) Ekspresja GFP oceniana w kolejnych generacjach po zastosowaniu RNAi w temperaturze 21 °C. Słupki błędu reprezentują odchylenie standardowe z dwóch powtórzeń biologicznych. (C) ChIP-qPCR dla H3K9me3, histonu H3 i kontroli IgG u młodych osobników F1 z dwóch powtórzeń biologicznych. clec-18 i hrp-2 są odpowiednio dodatnią i ujemną kontrolą loci dla wzbogacenia H3K9me3. (D) Wzbogacenie H3K9me3 i histonu H3 w reporterze RNAi GFP, znormalizowane do dodatniej kontroli locus clec-18. (E) Zmiana wzbogacenia H3K9me3 i histonu H3 pomiędzy zwierzętami traktowanymi RNAi przeciwko GFP a zwierzętami traktowanymi kontrolnym RNAi, z normalizacją do clec-18. Linia przerywana reprezentuje zmianę krotności (fold-change) równą 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65285/65285fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Ten protokół opisuje interferencję RNA i test ChIP w celu zbadania epigenetycznego dziedziczenia indukowanego przez RNAi wyciszania i związanych z nim modyfikacji chromatyny u C. elegans.

Analiza międzypokoleniowego dziedziczenia epigenetycznego u C. elegans przy użyciu fluorescencyjnego reportera i immunoprecypitacji chromatyny (ChIP)

Transgenerational epigenetic inheritance (TEI) allows the transmission of information through the germline without changing the genome sequence, through ...

Badania w naszym laboratorium sprawdzają, w jaki sposób białka związane z chromatyną, modyfikacje histonów i małe czynniki szlaku RNA współpracują ze sobą w kontekście rozwoju i międzypokoleniowego dziedziczenia epigenetycznego. Test dziedziczenia RNA, wykorzystujący reporter GFP, stał się bardzo potężnym narzędziem. Protokół ten opisuje, w jaki sposób ustandaryzować przygotowanie, ocenianie i pasażowanie robaków oraz przygotowanie próbek chipów, co może pomóc w generowaniu powtarzalnych wyników.Jednym z wyzwań eksperymentalnych podczas badania transgenów ulegających ekspresji w linii zarodkowej jest wyizolowanie efektów w linii zarodkowej zwierzęcia. Obecnie używamy całych zwierząt do produkcji chipa, ale w przyszłości chcielibyśmy opracować testy do badania chromatyny w linii zarodkowej. Nasze laboratorium interesuje się metylacją histonów i białkami, które rozpoznają te znaki.Idąc dalej, chcielibyśmy zbadać wzajemne oddziaływanie między tymi czytnikami chromatyny a szlakami małych RNA w kontekście dziedziczenia RNAi w transgenach i regulacji sekwencji endogennych. Przygotuj zwierzęta do testu dziedziczenia RNAi, wybierając trzy lub cztery dorosłe dorosłe Caenorhabditis elegans pod 35-milimetrowymi standardowymi płytkami NGM, wysianymi bakteriami OP50-1. Po czterech dniach zmyj grawitacyjne dorosłe robaki z płytek do 1,5-mililitrowych probówek za pomocą 800 mikrolitrów buforu M9, uzupełnionego Tritonem X-100.Powtórz pranie i wciągnij robaki do jednej tuby. Po odwirowaniu robaków w stężeniu 1 000 G przez 1,5 do 2 minut, odessać supernatant, pozostawiając 100 mikrolitrów bez naruszania osadu robaka. Do każdej probówki zawierającej osad robaka dodaj 650 mikrolitrów podwójnie destylowanej wody.Aby wyizolować zarodki C.Elegans z pobranej populacji, dodaj 250 mikrolitrów świeżo przygotowanego roztworu wybielającego i uruchom minutnik. Każdy od jednej do dwóch minut, dokładnie wymieszaj rurki. Po pięciu minutach monitoruj degradację dorosłych robaków pod stereoskopem.Kontynuuj wirowanie, aż robaki całkowicie się rozpuszczą i pozostaną tylko zarodki. Zwykle zajmuje to od sześciu do siedmiu minut. Natychmiast odwirować probówki o stężeniu 1 000 G przez 1,5 minuty i odessać supernatant, pozostawiając około 50 do 100 mikrolitrów supernatantu z zarodkami.Dodaj jeden mililitr buforu M9 uzupełnionego Tritonem X-100 do zarodków i wiru. Odwirować zawiesinę i powtórzyć mycie dwa razy. Po ostatnim płukaniu odessać supernatant i pozostawić około 100 mikrolitrów w probówce.Wirować probówki z wyizolowanymi zarodkami i dwukrotnie pipetować dwa mikrolitry z każdej probówki na oznakowane szklane szkiełko. Policz zarodki za pomocą licznika zliczającego, aby oszacować stężenie zarodków na mikrolitr. Aby rozpocząć częściowo zsynchronizowany wzrost populacji, przenieś około 250 zarodków na każdą płytkę RNAi NGM zawierającą bakterie E.coli HT115 z wektorami GFP lub kontrolnymi RNAi.Pozwól płynowi się wchłonąć, inkubuj pokolenie P0 potraktowane RNAi przez cztery dni w temperaturze 21 stopni Celsjusza. Rozpocznij przygotowanie płatków agarozowych, umieszczając kroplę stopionej 1% agarozy pod płytą winylową za pomocą szklanej pipety Pasteura. Ustaw szkiełko w taki sposób, aby linie na płycie były poziome lub pionowe i szybko umieść szkiełko na kropli agarozy na 30 sekund.Usuń szklane szkiełko z płyty i dodaj około pięciu mikrolitrów świeżo przygotowanej pięciomilimolowej lewamizoli pod stereoskopem. Delikatnie przesuń probówkę zawierającą robaki i przenieś od pięciu do 10 mikrolitrów na podkładkę agarozową, aby zamontować robaki. Oszacuj liczbę robaków w miarę ich dodawania, tak aby na replikę przypadało około 40 robaków.Ułóż robaki w rzędach za pomocą szpikulca do rzęs i umieść szklaną szkiełko nakrywkowe na szkiełku. Odizoluj zarodki od pozostałych robaków za pomocą protokołu wybielania i umieść 250 zarodków na 35-milimetrowych płytkach NGM wysianych bakteriami OP50-1. Pod stereoskopem fluorescencyjnym należy użyć zestawu filtrów GFP i policzyć oraz zapisać liczbę robaków GFP dodatnich i ujemnych GFP na szkiełkach dla każdej kontrpróby, korzystając z licznika zliczeń.Ręczna ocena jądrowego sygnału GFP w linii zarodkowej dla każdego pokolenia wykazała, że wyciszenie transgenu było w pełni penetrujące u naciętych robaków P0 i F1 traktowanych RNAi GFP. W pokoleniu F2 odsetek populacji wykazującej dziedziczenie wyciszenia GFP wynosił około 50%W pokoleniu F5 większość populacji nie wykazywała dziedziczenia wyciszenia. W pokoleniu F 10 wszystkie robaki wykazywały ekspresję GFP i nie wykryto dziedziczenia.Zacznij od posiewu około 3 500 zarodków pokolenia C.Elegans F1 na 14 płytkach i pozwól im rosnąć do stadium młodego dorosłego osobnika przez trzy dni w temperaturze 21 stopni Celsjusza. Umyj i zbierz C.Elegans do 1,5-mililitrowych probówek za pomocą PBS/TX. Wirować przy 1 000 G przez dwie minuty.Odessać i wyciągnąć robaki z jednego szczepu do jednej probówki. Powtórz trzy prania z PBS/TX. Następnie odessać supernatant, pozostawiając jeden mililitr w probówce i odwrócić do wymieszania.Po trzykrotnym zliczeniu liczby robaków C.Elegans w trzech mikrolitrach, oblicz stężenie robaków i przenieś objętość odpowiadającą 3 000 robaków do nowej probówki w celu sieciowania formaldehydu. Zacznij od dodania formaldehydu do końcowego stężenia 1,8% do probówki zawierającej robaki i obracania probówki w temperaturze pokojowej przez sześć minut. Następnie natychmiast zamroź probówki w ciekłym azocie i przechowuj próbki w temperaturze 80 stopni Celsjusza.Aby kontynuować, rozmrozić próbkę usieciowania formaldehydowego w łaźni wodnej o temperaturze pokojowej przez trzy minuty i obracać próbki przez 16 minut w temperaturze pokojowej. Dodaj 1,25 molowej glicyny do 125 milimolowego stężenia końcowego i obracaj przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Po wykonaniu tego kroku należy trzymać próbki na lodzie lub w temperaturze czterech stopni i używać lodowatych aż do rozcieńczenia kulki magnetycznej.Po odwirowaniu próbki o sile 1 000 G przez trzy minuty, przemyć ją trzykrotnie jednym mililitrem PBS/TX. Następnie przemyć go dwa razy jednym mililitrem bufora do sporządzania zawiesiny. Po ostatnim praniu pozostaw wystarczającą ilość bufora, aby upewnić się, że całkowita objętość granulek jest co najmniej trzykrotnie większa niż objętość granulek i co najmniej 100 mikrolitrów.Zacznij od wymieszania i porcjowania od 90 do 120 mikrolitrów próbek usieciowania formaldehydu C.Elegans do probówki do sonikacji polistyrenu. Dodać równą objętość buforu do sporządzania zawiesiny zawierającego 2x detergenty. Sonikować w łaźni wodnej przez siedem minut.Delikatnie wymieszać próbkę przez pipetowanie i powtarzać sonikację przez dodatkowe siedem minut. Po zakończeniu przenieś sonikowany lizat do 1,5 mililitrowej probówki. Dodać połowę objętości buforu do sporządzania zawiesiny bez detergentów.Po odwirowaniu w temperaturze 13 000 G przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, podzielić supernatant lizatu na cztery części. Przechowuj wejściową część lizatu w temperaturze 20 stopni Celsjusza w probówce o pojemności 1.5 mililitra. Dodać 0,5 mikrograma trimetylacji anty-H3K9, antyhistonu H3 lub IgG do odpowiedniej próbki immunoprecypitacji lub IP.Inkubować reakcję w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc z rotacją. Następnego dnia podwielokrotnić dziewięć mikrolitrów kulek magnetycznych pokrytych białkiem G na próbkę IP w probówce o pojemności 1,5 mililitra. Po dwóch praniach jednym mililitrem FA 150 ponownie zawieś kulki magnetyczne w buforze FA 150.Po zakończeniu dodaj 7,5 mikrolitra zawiesiny kulek magnetycznych do każdej mieszanki przeciwciał IP przed inkubacją probówek w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez dwie godziny z rotacją. Następnie umyj kulki magnetyczne siedmiokrotnie, używając co najmniej 200 mikrolitrów każdego roztworu buforowego. Inkubuj każde pranie w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut z rotacją, a następnie zbierz kulki na stojaku magnetycznym w celu zassania prania.Po odessaniu ostatniego przemywania buforu, ponownie zawieś kulki magnetyczne w 50 mikrolitrach buforu elucyjnego IP chromatyny i przenieś go do probówki o pojemności 1,5 mililitra. Po wyluzowaniu próbki w termomikserze zebrać kulki na stojaku magnetycznym i przenieść supernatant do nowej probówki. Powtórz elucję z kolejnymi 50 mikrolitrami buforu wyjaśniającego do immunoprecypitacji chromatyny.Po zakończeniu zbierz łącznie 100 mikrolitrów supernatantu przed przystąpieniem do odwrotnego sieciowania i elucji DNA.

analysis-transgenerational-epigenetic-inheritance-c-elegans-using

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Zarodek C. elegans jest potężnym systemem do badania biologii komórki i rozwoju. Przedstawiamy protokół obrazowania na żywo zarodków C. elegans z wykorzystaniem optyki DIC lub fluorescencji, przy użyciu powszechnie dostępnych mikroskopów epifluorescencyjnych oraz oprogramowania otwartoźródłowego.

Obrazowanie zarodków C. elegans przy użyciu mikroskopu epifluorescencyjnego i oprogramowania otwartoźródłowego

Niniejszy artykuł opisuje technikę wizualizacji wczesnych etapów embriogenezy u nicienia Caenorhabditis elegans.

Mikroskopia poklatkowa wczesnego embrionogenezy u Caenorhabditis elegans

Ten protokół opisuje szybką i mało materiałochłonną procedurę integracji transgenicznych układów pozachromosomalnych z genomem Caenorhabditis elegans za pomocą promieniowania ultrafioletowego (UV). Co więcej, protokół ten jest szczególnie odpowiedni dla linii transgenicznych, które przesyłają macierze pozachromosomalne z dużą szybkością.

Szybki protokół integracji macierzy pozachromosomalnych o wysokiej szybkości transmisji z genomem C. elegans

Opisujemy szczegółowe etapy wysokoprzepustowego testu chemicznego u nicieni Caenorhabditis elegans używanych do oceny toksyczności linii zarodkowej. W tym teście zaburzenie funkcji linii zarodkowej po narażeniu na działanie substancji chemicznych jest monitorowane za pomocą fluorescencyjnego reportera specyficznego dla zarodków aneuploidalnych.

Kompleksowa ocena toksyczności chemicznej linii rozrodczej z wykorzystaniem nicienia Caenorhabditis elegans

Regulacja środowiska chromatyny jest niezbędnym procesem niezbędnym do prawidłowej ekspresji genów. W tym miejscu opisujemy metodę kontrolowania ekspresji genów poprzez rekrutację maszynerii modyfikującej chromatynę w sposób specyficzny dla genu i odwracalny.

Tłumienie transkrypcji genów poprzez przekierowywanie maszynerii komórkowej za pomocą chemicznych modyfikatorów epigenetycznych

Ta metoda jest przeznaczona do śledzenia tworzenia domen chromatyny za pośrednictwem PRC2 w liniach komórkowych, a metoda może być dostosowana do wielu innych systemów.

Metoda badania tworzenia się de novo domen chromatyny

Ta praca opisuje protokół o średniej przepustowości, który umożliwia jednoczesne obrazowanie 3D poklatkowe embriogenezy u zarodków 80-100 C. elegans w ciągu jednej nocy. Dodatkowo dołączone są narzędzia do przetwarzania i wizualizacji obrazu, które usprawniają analizę danych. Połączenie tych metod z niestandardowymi szczepami reporterowymi umożliwia szczegółowe monitorowanie embriogenezy.

Metoda obrazowania półwysokoprzepustowego i zestaw narzędzi do wizualizacji danych do analizy rozwoju embrionalnego C. elegans

Zakażenie Caenorhabditis elegans pasożytem mikrosporydów Nematocida parisii umożliwia robakom wytwarzanie potomstwa, które jest wysoce odporne na ten sam patogen. Jest to przykład odporności dziedzicznej, słabo poznanego zjawiska epigenetycznego. Niniejszy protokół opisuje badanie odporności dziedzicznej w genetycznie podatnym modelu robaka.

Badanie odporności dziedzicznej w modelu zakażenia mikrosporydiami Caenorhabditis elegans

Tutaj prezentujemy protokoły i narzędzia do wizualizacji wapnia podczas zapłodnienia i wczesnej embriogenezy za pomocą genetycznie kodowanego reportera wapnia wyrażonego w linii zarodkowej modelowego nicienia C. elegans.

Wizualizacja in vivo stanów przejściowych wapnia podczas nawożenia i wczesnego rozwoju C. elegans

Przedstawiamy tutaj szybki i prosty protokół ATAC-seq do zaimplementowania w całym robaku Caenorhabditis elegans na etapie L4, używając tylko 30 µL pelletu z dżdżownic.

Analiza dostępności chromatiny w całym Caenorhabditis elegans larw L4

Przepływ pracy z mikroiniekcją CRISPR/Cas9 do endogennego fluorescencyjnego oznaczania w linii komórkowej Caenorhabditis elegans w celu uzyskania homozygotycznych linii knock-in do analizy lokalizacji białka in vivo lokalizacji białka.

Endogenouszne fluorescencyjne oznaczanie genów specyficznych dla komórek germinalnych za pośrednictwem CRISPR/Cas9 u Caenorhabditis elegans

Poznaj metodę analizy dziedziczenia epigenetycznego u C. elegans wykorzystującą reporter GFP i immunoprecypitację chromatyny. Protokół ten umożliwia badanie mechanizmów dziedziczenia RNAi oraz modyfikacji chromatyny w wielu pokoleniach.

Analiza międzypokoleniowego dziedziczenia epigenetycznego u C. elegans przy użyciu fluorescencyjnego reportera i immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) (Wideo) | JoVE Journal

Analiza międzypokoleniowego dziedziczenia epigenetycznego u C. elegans przy użyciu fluorescencyjnego reportera i immunoprecypitacji chromatyny (ChIP)

Przeglądaj więcej filmów