Analiza międzypokoleniowego dziedziczenia epigenetycznego u C. elegans przy użyciu fluorescencyjnego reportera i immunoprecypitacji chromatyny (ChIP)

Ten protokół opisuje interferencję RNA i test ChIP w celu zbadania epigenetycznego dziedziczenia indukowanego przez RNAi wyciszania i związanych z nim modyfikacji chromatyny u C. elegans.

Badania w naszym laboratorium sprawdzają, w jaki sposób białka związane z chromatyną, modyfikacje histonów i małe czynniki szlaku RNA współpracują ze sobą w kontekście rozwoju i międzypokoleniowego dziedziczenia epigenetycznego. Test dziedziczenia RNA, wykorzystujący reporter GFP, stał się bardzo potężnym narzędziem. Protokół ten opisuje, w jaki sposób ustandaryzować przygotowanie, ocenianie i pasażowanie robaków oraz przygotowanie próbek chipów, co może pomóc w generowaniu powtarzalnych wyników.

Jednym z wyzwań eksperymentalnych podczas badania transgenów ulegających ekspresji w linii zarodkowej jest wyizolowanie efektów w linii zarodkowej zwierzęcia. Obecnie używamy całych zwierząt do produkcji chipa, ale w przyszłości chcielibyśmy opracować testy do badania chromatyny w linii zarodkowej. Nasze laboratorium interesuje się metylacją histonów i białkami, które rozpoznają te znaki.

Idąc dalej, chcielibyśmy zbadać wzajemne oddziaływanie między tymi czytnikami chromatyny a szlakami małych RNA w kontekście dziedziczenia RNAi w transgenach i regulacji sekwencji endogennych. Przygotuj zwierzęta do testu dziedziczenia RNAi, wybierając trzy lub cztery dorosłe dorosłe Caenorhabditis elegans pod 35-milimetrowymi standardowymi płytkami NGM, wysianymi bakteriami OP50-1. Po czterech dniach zmyj grawitacyjne dorosłe robaki z płytek do 1,5-mililitrowych probówek za pomocą 800 mikrolitrów buforu M9, uzupełnionego Tritonem X-100.

Powtórz pranie i wciągnij robaki do jednej tuby. Po odwirowaniu robaków w stężeniu 1 000 G przez 1,5 do 2 minut, odessać supernatant, pozostawiając 100 mikrolitrów bez naruszania osadu robaka. Do każdej probówki zawierającej osad robaka dodaj 650 mikrolitrów podwójnie destylowanej wody.

Aby wyizolować zarodki C.Elegans z pobranej populacji, dodaj 250 mikrolitrów świeżo przygotowanego roztworu wybielającego i uruchom minutnik. Każdy od jednej do dwóch minut, dokładnie wymieszaj rurki. Po pięciu minutach monitoruj degradację dorosłych robaków pod stereoskopem.

Kontynuuj wirowanie, aż robaki całkowicie się rozpuszczą i pozostaną tylko zarodki. Zwykle zajmuje to od sześciu do siedmiu minut. Natychmiast odwirować probówki o stężeniu 1 000 G przez 1,5 minuty i odessać supernatant, pozostawiając około 50 do 100 mikrolitrów supernatantu z zarodkami.

Dodaj jeden mililitr buforu M9 uzupełnionego Tritonem X-100 do zarodków i wiru. Odwirować zawiesinę i powtórzyć mycie dwa razy. Po ostatnim płukaniu odessać supernatant i pozostawić około 100 mikrolitrów w probówce.

Wirować probówki z wyizolowanymi zarodkami i dwukrotnie pipetować dwa mikrolitry z każdej probówki na oznakowane szklane szkiełko. Policz zarodki za pomocą licznika zliczającego, aby oszacować stężenie zarodków na mikrolitr. Aby rozpocząć częściowo zsynchronizowany wzrost populacji, przenieś około 250 zarodków na każdą płytkę RNAi NGM zawierającą bakterie E.coli HT115 z wektorami GFP lub kontrolnymi RNAi.

Pozwól płynowi się wchłonąć, inkubuj pokolenie P0 potraktowane RNAi przez cztery dni w temperaturze 21 stopni Celsjusza. Rozpocznij przygotowanie płatków agarozowych, umieszczając kroplę stopionej 1% agarozy pod płytą winylową za pomocą szklanej pipety Pasteura. Ustaw szkiełko w taki sposób, aby linie na płycie były poziome lub pionowe i szybko umieść szkiełko na kropli agarozy na 30 sekund.

Usuń szklane szkiełko z płyty i dodaj około pięciu mikrolitrów świeżo przygotowanej pięciomilimolowej lewamizoli pod stereoskopem. Delikatnie przesuń probówkę zawierającą robaki i przenieś od pięciu do 10 mikrolitrów na podkładkę agarozową, aby zamontować robaki. Oszacuj liczbę robaków w miarę ich dodawania, tak aby na replikę przypadało około 40 robaków.

Ułóż robaki w rzędach za pomocą szpikulca do rzęs i umieść szklaną szkiełko nakrywkowe na szkiełku. Odizoluj zarodki od pozostałych robaków za pomocą protokołu wybielania i umieść 250 zarodków na 35-milimetrowych płytkach NGM wysianych bakteriami OP50-1. Pod stereoskopem fluorescencyjnym należy użyć zestawu filtrów GFP i policzyć oraz zapisać liczbę robaków GFP dodatnich i ujemnych GFP na szkiełkach dla każdej kontrpróby, korzystając z licznika zliczeń.

Ręczna ocena jądrowego sygnału GFP w linii zarodkowej dla każdego pokolenia wykazała, że wyciszenie transgenu było w pełni penetrujące u naciętych robaków P0 i F1 traktowanych RNAi GFP. W pokoleniu F2 odsetek populacji wykazującej dziedziczenie wyciszenia GFP wynosił około 50%W pokoleniu F5 większość populacji nie wykazywała dziedziczenia wyciszenia. W pokoleniu F 10 wszystkie robaki wykazywały ekspresję GFP i nie wykryto dziedziczenia.

Zacznij od posiewu około 3 500 zarodków pokolenia C.Elegans F1 na 14 płytkach i pozwól im rosnąć do stadium młodego dorosłego osobnika przez trzy dni w temperaturze 21 stopni Celsjusza. Umyj i zbierz C.Elegans do 1,5-mililitrowych probówek za pomocą PBS/TX. Wirować przy 1 000 G przez dwie minuty.

Odessać i wyciągnąć robaki z jednego szczepu do jednej probówki. Powtórz trzy prania z PBS/TX. Następnie odessać supernatant, pozostawiając jeden mililitr w probówce i odwrócić do wymieszania.

Po trzykrotnym zliczeniu liczby robaków C.Elegans w trzech mikrolitrach, oblicz stężenie robaków i przenieś objętość odpowiadającą 3 000 robaków do nowej probówki w celu sieciowania formaldehydu. Zacznij od dodania formaldehydu do końcowego stężenia 1,8% do probówki zawierającej robaki i obracania probówki w temperaturze pokojowej przez sześć minut. Następnie natychmiast zamroź probówki w ciekłym azocie i przechowuj próbki w temperaturze 80 stopni Celsjusza.

Aby kontynuować, rozmrozić próbkę usieciowania formaldehydowego w łaźni wodnej o temperaturze pokojowej przez trzy minuty i obracać próbki przez 16 minut w temperaturze pokojowej. Dodaj 1,25 molowej glicyny do 125 milimolowego stężenia końcowego i obracaj przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Po wykonaniu tego kroku należy trzymać próbki na lodzie lub w temperaturze czterech stopni i używać lodowatych aż do rozcieńczenia kulki magnetycznej.

Po odwirowaniu próbki o sile 1 000 G przez trzy minuty, przemyć ją trzykrotnie jednym mililitrem PBS/TX. Następnie przemyć go dwa razy jednym mililitrem bufora do sporządzania zawiesiny. Po ostatnim praniu pozostaw wystarczającą ilość bufora, aby upewnić się, że całkowita objętość granulek jest co najmniej trzykrotnie większa niż objętość granulek i co najmniej 100 mikrolitrów.

Zacznij od wymieszania i porcjowania od 90 do 120 mikrolitrów próbek usieciowania formaldehydu C.Elegans do probówki do sonikacji polistyrenu. Dodać równą objętość buforu do sporządzania zawiesiny zawierającego 2x detergenty. Sonikować w łaźni wodnej przez siedem minut.

Delikatnie wymieszać próbkę przez pipetowanie i powtarzać sonikację przez dodatkowe siedem minut. Po zakończeniu przenieś sonikowany lizat do 1,5 mililitrowej probówki. Dodać połowę objętości buforu do sporządzania zawiesiny bez detergentów.

Po odwirowaniu w temperaturze 13 000 G przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, podzielić supernatant lizatu na cztery części. Przechowuj wejściową część lizatu w temperaturze 20 stopni Celsjusza w probówce o pojemności 1.5 mililitra. Dodać 0,5 mikrograma trimetylacji anty-H3K9, antyhistonu H3 lub IgG do odpowiedniej próbki immunoprecypitacji lub IP.

Inkubować reakcję w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc z rotacją. Następnego dnia podwielokrotnić dziewięć mikrolitrów kulek magnetycznych pokrytych białkiem G na próbkę IP w probówce o pojemności 1,5 mililitra. Po dwóch praniach jednym mililitrem FA 150 ponownie zawieś kulki magnetyczne w buforze FA 150.

Po zakończeniu dodaj 7,5 mikrolitra zawiesiny kulek magnetycznych do każdej mieszanki przeciwciał IP przed inkubacją probówek w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez dwie godziny z rotacją. Następnie umyj kulki magnetyczne siedmiokrotnie, używając co najmniej 200 mikrolitrów każdego roztworu buforowego. Inkubuj każde pranie w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut z rotacją, a następnie zbierz kulki na stojaku magnetycznym w celu zassania prania.

Po odessaniu ostatniego przemywania buforu, ponownie zawieś kulki magnetyczne w 50 mikrolitrach buforu elucyjnego IP chromatyny i przenieś go do probówki o pojemności 1,5 mililitra. Po wyluzowaniu próbki w termomikserze zebrać kulki na stojaku magnetycznym i przenieść supernatant do nowej probówki. Powtórz elucję z kolejnymi 50 mikrolitrami buforu wyjaśniającego do immunoprecypitacji chromatyny.

Po zakończeniu zbierz łącznie 100 mikrolitrów supernatantu przed przystąpieniem do odwrotnego sieciowania i elucji DNA.