Name: Określanie roli genów ulegających ekspresji matki we wczesnym rozwoju za pomocą matczynych chrupek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 8 s
Description: Poznaj technikę CRISPR-Cas9 do identyfikacji genów matczynych we wczesnym rozwoju embrionalnym. Metoda multiplexingu guide RNA umożliwia szybkie odkrywanie nowych fenotypów matczynych w jednym pokoleniu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy byłym i obecnym pracownikom laboratorium hodowli zwierząt Pelegri za ich troskę o obiekt wodny. Jesteśmy również wdzięczni za komentarze i wgląd w rękopis autorstwa Ryana Treveny i Diane Hanson. Finansowanie zostało zapewnione z grantu NIH dla F.P. (GM065303)

<ol><li>Pelegri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+factors+in+zebrafish+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Maternal factors in zebrafish development.</a> Developmental Dynamics. 228 (3), 535-554 (2003).</li>
<li>Campbell, P. D., Heim, A. E., Smith, M. Z., Marlow, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinesin-1+interacts+with+Bucky+ball+to+form+germ+cells+and+is+required+to+pattern+the+zebrafish+body+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Kinesin-1 interacts with Bucky ball to form germ cells and is required to pattern the zebrafish body axis.</a> Development. 142 (17), Cambridge, England. 2996-3008 (2015).</li>
<li>Eno, C., Solanki, B., Pelegri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((aura+%28mid1ip1l%29+regulates+the+cytoskeleton+at+the+zebrafish+egg-to-embryo+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">aura (mid1ip1l) regulates the cytoskeleton at the zebrafish egg-to-embryo transition.</a> Development. 143 (9), Cambridge, England. 1585-1599 (2016).</li>
<li>He, W. -X., et al. Oocyte-specific maternal Slbp2 is required for replication-dependent histone storage and early nuclear cleavage in zebrafish oogenesis and embryogenesis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHe%2C+W-X+%22RNA%22">RNA</a>. 24 (12), RNA. New York, N.Y. 1738-1748 (2018).</li>
<li>Burger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maximizing+mutagenesis+with+solubilized+CRISPR-Cas9+ribonucleoprotein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Maximizing mutagenesis with solubilized CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein complexes.</a> Development. 143 (11), Cambridge, England. 2025-2037 (2016).</li>
<li>Jao, L. -E., Wente, S. R., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+multiplex+biallelic+zebrafish+genome+editing+using+a+CRISPR+nuclease+system%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (34), 13904-13909 (2013).</li>
<li>Shah, A. N., Davey, C. F., Whitebirch, A. C., Miller, A. C., Moens, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+reverse+genetic+screening+using+CRISPR+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid reverse genetic screening using CRISPR in zebrafish.</a> Nature Methods. 12 (6), 535-540 (2015).</li>
<li>Shankaran, S. S., Dahlem, T. J., Bisgrove, B. W., Yost, H. J., Tristani-Firouzi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-directed+gene+editing+for+the+generation+of+loss-of-function+mutants+in+high-throughput+zebrafish+F0+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-directed gene editing for the generation of loss-of-function mutants in high-throughput zebrafish F0 screens.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 119 (1), 1-22 (2017).</li>
<li>Trubiroha, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Rapid+CRISPR%2FCas-based+mutagenesis+assay+in+zebrafish+for+identification+of+genes+involved+in+thyroid+morphogenesis+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A Rapid CRISPR/Cas-based mutagenesis assay in zebrafish for identification of genes involved in thyroid morphogenesis and function.</a> Scientific Reports. 8 (1), 5647(2018).</li>
<li>Wu, R. S., Lam, I. I., Clay, H., Duong, D. N., Deo, R. C., Coughlin, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Rapid+method+for+directed+gene+knockout+for+screening+in+G0+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">A Rapid method for directed gene knockout for screening in G0 zebrafish.</a> Developmental Cell. 46 (1), 112-125 (2018).</li>
<li>Moravec, C. E., Voit, G. C., Otterlee, J., Pelegri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+maternal-effect+genes+in+zebrafish+using+maternal+crispants%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Identification of maternal-effect genes in zebrafish using maternal crispants.</a> Development. 148 (19), Cambridge, England. 199536(2021).</li>
<li>Braat, A. K., Zandbergen, T., van de Water, S., Goos, H. J., Zivkovic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+zebrafish+primordial+germ+cells%3A+morphology+and+early+distribution+of+vasa+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%3A+An+Official+Publication+of+the+American+Association+of+Anatomists%22%5BJournal%5D)">Characterization of zebrafish primordial germ cells: morphology and early distribution of vasa RNA.</a> Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 216 (2), 153-167 (1999).</li>
<li>Eno, C., Hansen, C. L., Pelegri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aggregation%2C+segregation%2C+and+dispersal+of+homotypic+germ+plasm+RNPs+in+the+early+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Aggregation, segregation, and dispersal of homotypic germ plasm RNPs in the early zebrafish embryo.</a> Developmental Dynamics. 248 (4), 306-318 (2019).</li>
<li>Knaut, H., Steinbeisser, H., Schwarz, H., Nüsslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evolutionary+conserved+region+in+the+vasa+3%27UTR+targets+RNA+translation+to+the+germ+cells+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Current+biology%3A+CB%22%5BJournal%5D)">An evolutionary conserved region in the vasa 3'UTR targets RNA translation to the germ cells in the zebrafish.</a> Current biology: CB. 12 (6), 454-466 (2002).</li>
<li>Yoon, C., Kawakami, K., Hopkins, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+vasa+homologue+RNA+is+localized+to+the+cleavage+planes+of+2-+and+4-cell-stage+embryos+and+is+expressed+in+the+primordial+germ+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Zebrafish vasa homologue RNA is localized to the cleavage planes of 2- and 4-cell-stage embryos and is expressed in the primordial germ cells.</a> Development. 124 (16), Cambridge, England. 3157-3165 (1997).</li>
<li>Gagnon, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+mutagenesis+by+Cas9+protein-mediated+oligonucleotide+insertion+and+large-scale+assessment+of+single-guide+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Efficient mutagenesis by Cas9 protein-mediated oligonucleotide insertion and large-scale assessment of single-guide RNAs.</a> PLoS ONE. 9 (5), 98186(2014).</li>
<li>Labun, K., Montague, T. G., Gagnon, J. A., Thyme, S. B., Valen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CHOPCHOP+v2%3A+a+web+tool+for+the+next+generation+of+CRISPR+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">CHOPCHOP v2: a web tool for the next generation of CRISPR genome engineering.</a> Nucleic Acids Research. 44, 272-276 (2016).</li>
<li>Labun, K., Montague, T. G., Krause, M., Torres Cleuren, Y. N., Tjeldnes, H., Valen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CHOPCHOP+v3%3A+expanding+the+CRISPR+web+toolbox+beyond+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">CHOPCHOP v3: expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing.</a> Nucleic Acids Research. 47, 171-174 (2019).</li>
<li>Montague, T. G., Cruz, J. M., Gagnon, J. A., Church, G. M., Valen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CHOPCHOP%3A+a+CRISPR%2FCas9+and+TALEN+web+tool+for+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">CHOPCHOP: a CRISPR/Cas9 and TALEN web tool for genome editing.</a> Nucleic Acids Research. 42, 401-407 (2014).</li>
<li>Moravec, C. E., Pelegri, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+accessible+protocol+for+the+generation+of+CRISPR-Cas9+knockouts+using+INDELs+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">An accessible protocol for the generation of CRISPR-Cas9 knockouts using INDELs in zebrafish.</a> Methods in Molecular Biology. 1920, Clifton, N.J. 377-392 (2019).</li>
<li>White, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-resolution+mRNA+expression+time+course+of+embryonic+development+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A high-resolution mRNA expression time course of embryonic development in zebrafish.</a> eLife. 6, 30860(2017).</li>
<li>Aanes, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+mRNA+sequencing+deciphers+novelties+in+transcriptome+dynamics+during+maternal+to+zygotic+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Zebrafish mRNA sequencing deciphers novelties in transcriptome dynamics during maternal to zygotic transition.</a> Genome Research. 21 (8), 1328-1338 (2011).</li>
<li>Aken, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ensembl+gene+annotation+system%5BTitle%5D)+AND+%22Database%3A+The+Journal+of+Biological+Databases+and+Curation%22%5BJournal%5D)">The Ensembl gene annotation system.</a> Database: The Journal of Biological Databases and Curation. 2016, (2016).</li>
<li>Sorlien, E. L., Witucki, M. A., Ogas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+production+and+identification+of+CRISPR%2FCas9-generated+gene+knockouts+in+the+model+system+Danio+rerio%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Efficient production and identification of CRISPR/Cas9-generated gene knockouts in the model system Danio rerio.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), e56969(2018).</li>
<li>Kotani, H., Taimatsu, K., Ohga, R., Ota, S., Kawahara, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((efficient+multiple+genome+modifications+induced+by+the+crRNAs%2C+tracrRNA+and+Cas9+protein+complex+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">efficient multiple genome modifications induced by the crRNAs, tracrRNA and Cas9 protein complex in zebrafish.</a> PloS One. 10 (5), 0128319(2015).</li>
<li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (25), e1115(2009).</li>
<li>Xu, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+into+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Microinjection into zebrafish embryos.</a> Methods in Molecular Biology. 127, Clifton, N.J. 125-132 (1999).</li>
<li>Biology Mouse,, Zebrafish,, Chick, JoVE. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology%3A+Mouse%2C+Zebrafish%2C+and+Chick.+Zebrafish+Microinjection+Techniques%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE+Science+Education+Database%22%5BJournal%5D)">Biology: Mouse, Zebrafish, and Chick. Zebrafish Microinjection Techniques.</a> JoVE Science Education Database. , Cambridge, MA. (2021).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%3A+An+Official+Publication+of+the+American+Association+of+Anatomists%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 203 (3), 253-310 (1995).</li>
<li>D'Agostino, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+cheap+methodology+for+CRISPR%2FCas9+zebrafish+mutant+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A rapid and cheap methodology for CRISPR/Cas9 zebrafish mutant screening.</a> Molecular Biotechnology. 58 (1), 73-78 (2016).</li>
<li>Baars, D. L., Takle, K. A., Heier, J., Pelegri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ploidy+manipulation+of+zebrafish+embryos+with+Heat+Shock+2+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Ploidy manipulation of zebrafish embryos with Heat Shock 2 treatment.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (118), e54492(2016).</li>
<li>Nair, S., Lindeman, R. E., Pelegri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+oocyte+culture-based+manipulation+of+zebrafish+maternal+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%3A+An+Official+Publication+of+the+American+Association+of+Anatomists%22%5BJournal%5D)">In vitro oocyte culture-based manipulation of zebrafish maternal genes.</a> Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 242 (1), 44-52 (2013).</li>
<li>Kushawah, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas13d+induces+efficient+mRNA+knockdown+in+animal+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas13d induces efficient mRNA knockdown in animal embryos.</a> Developmental Cell. 54 (6), 805-817 (2020).</li>
<li>Kroeger, P. T., Poureetezadi, S. J., McKee, R., Jou, J., Miceli, R., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+haploid+zebrafish+embryos+by+in+vitro+fertilization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Production of haploid zebrafish embryos by in vitro fertilization.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (89), e51708(2014).</li>
<li>Xiao, T., Roeser, T., Staub, W., Baier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+GFP-based+genetic+screen+reveals+mutations+that+disrupt+the+architecture+of+the+zebrafish+retinotectal+projection%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A GFP-based genetic screen reveals mutations that disrupt the architecture of the zebrafish retinotectal projection.</a> Development. 132 (13), Cambridge, England. 2955-2967 (2005).</li>
<li>Riemer, S., Bontems, F., Krishnakumar, P., Gömann, J., Dosch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+Bucky+ball-GFP+transgene+visualizes+germ+plasm+in+living+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Expression+Patterns%3A+GEP%22%5BJournal%5D)">A functional Bucky ball-GFP transgene visualizes germ plasm in living zebrafish.</a> Gene Expression Patterns: GEP. 18 (1-2), 44-52 (2015).</li>
<li>Moreno-Mateos, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPRscan%3A+designing+highly+efficient+sgRNAs+for+CRISPR-Cas9+targeting+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">CRISPRscan: designing highly efficient sgRNAs for CRISPR-Cas9 targeting in vivo.</a> Nature Methods. 12 (10), 982-988 (2015).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Protokół przedstawiony w tym manuskrypcie pozwala na identyfikację i pierwszorzędową charakterystykę molekularną fenotypu efektu matczynego w jednym pokoleniu, a nie w wielu pokoleniach wymaganych zarówno dla technik genetycznych do przodu, jak i do tyłu. Obecnie rola wielu genów ulegających ekspresji matczynej jest nieznana. Ten brak wiedzy jest częściowo spowodowany dodatkowym pokoleniem wymaganym do wizualizacji fenotypu podczas identyfikacji genów efektu matczynego. W przeszłości szybką identyfikację genów efektu mat...

Pula produktów zdeponowanych przez matkę (np. RNA, białka i inne biomolekuły) jest niezbędna dla wszystkich wczesnych procesów komórkowych, dopóki nie zostanie aktywowany genom zygotyczny zarodka1. Przedwczesne wyczerpanie tych produktów z oocytu jest zazwyczaj śmiertelne dla zarodka. Pomimo znaczenia tych genów w rozwoju, rola wielu genów ulegających ekspresji matczynej jest obecnie nieznana. Postęp w technologii edycji genów u danio pręgowanego, taki jak CRISPR-Cas9, umożliwia celowanie w geny o ekspresji matczynej2,3,4. Jednak identyfikacja fenotypu efektu matczynego wymaga dodatkowego pokolenia w porównaniu z fenotypem zygotycznym, a zatem wymaga więcej zasobów. Ostatnio zdolność edycji biallelicznej CRISPR-Cas9 została wykorzystana do badań przesiewowych pod kątem fenotypów embrionalnych w tkankach somatycznych wstrzykniętych zarodków (F0), znanych jako "crispants"5,6,7,8,9,10. Technika crispant pozwala na zasobooszczędne badania przesiewowe genów kandydujących w komórkach somatycznych, ułatwiając zrozumienie konkretnych aspektów rozwoju. Protokół opisany w tym artykule pozwala na identyfikację fenotypów efektu matczynego, czyli "matczynych chrupków", w jednym pokoleniu11. Schemat ten można osiągnąć poprzez multipleksowanie przewodnikowych RNA do jednego genu i promowanie zdarzeń edycji biallelicznej w linii zarodkowej. Te matczyne zarodki chrupiące mogą być identyfikowane na podstawie ogólnych fenotypów morfologicznych i poddawane podstawowej charakterystyce, takiej jak etykietowanie granic komórkowych i wzorcowanie DNA11. Połączona analiza obserwowalnego fenotypu i podstawowa charakterystyka molekularna indukowanych INDELs pozwala na przewidzenie roli docelowego genu we wczesnym rozwoju.
U danio pręgowanego, podczas pierwszych 24 godzin po zapłodnieniu (hpf), niewielka grupa komórek przekształca się w pierwotne komórki rozrodcze, prekursor linii zarodkowej12,13,14,15. W lęgach złożonych przez samice F0 odsetek odzyskanych matczynych zarodków chrupkujących zależy od tego, ile komórek rozrodczych zawiera zdarzenie edycji biallelicznej w docelowym genie. Ogólnie rzecz biorąc, im wcześniej dojdzie do edycji zarodka, tym większe prawdopodobieństwo zaobserwowania mutacji CRISPR-Cas9 w linii zarodkowej. W większości przypadków fenotypy matczynych zarodków chrupkujących wynikają z utraty funkcji dwóch matczynych alleli obecnych w rozwijającym się oocycie. Gdy oocyt kończy mejozę, jeden z matczynych alleli jest wytłaczany z zarodka przez ciało biegunowe, podczas gdy drugi allel zostaje włączony do matczynego przedjądrza. Sekwencjonowanie wielu matczynych haploidów chrupkujących będzie reprezentować mieszaninę mutacji (insercji i/lub delecji (INDEL)) obecnych w linii zarodkowej, które przyczyniają się do fenotypu11.
Poniższy protokół opisuje niezbędne kroki do stworzenia mutacji CRISPR-Cas9 w genach efektu matczynego i zidentyfikowania odpowiadającego im fenotypu przy użyciu metody matczynego crispantu (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Sekcja pierwsza wyjaśni, jak skutecznie projektować i tworzyć przewodnikowe RNA, podczas gdy sekcje druga i trzecia zawierają kluczowe etapy tworzenia matczynych chrupek za pomocą mikroiniekcji. Po wstrzyknięciu mieszaniny CRISPR-Cas9 wstrzyknięte zarodki są badane pod kątem zmian somatycznych metodą PCR (sekcja czwarta). Gdy wstrzyknięte zarodki F0 rozwiną się i osiągną dojrzałość płciową, samice F0 są krzyżowane z samcami typu dzikiego, a ich potomstwo jest badane pod kątem fenotypów efektu matczynego (sekcja piąta). Sekcja szósta zawiera instrukcje dotyczące wytwarzania matczynych chrupiących haploidów, które można połączyć z sekwencjonowaniem Sangera w celu identyfikacji INDELs indukowanych przez CRISPR-Cas9. Ponadto Dyskusja zawiera modyfikacje, które można wprowadzić do protokołu, aby zwiększyć czułość i moc tej metody.

<table><tbody><tr><td>1 M Tris-HCl (pH 8,4)</td><td>Invirogen</td><td>15568025</td><td>Do mieszanki PCR</td></tr><tr><td>1,5 ml probówek Eppendorf</td><td>Any Maker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mM dNTP</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>18427013</td><td>Synteza gRNA</td></tr><tr><td>100 BP drabinka</td><td>Dowolny producent</td><td></td><td>Do elektroforezy żelowej</td></tr><tr><td>100% etanol wolny od RNAzy</td><td>Dowolny producent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100% RNAzy wolny etanol</td><td>Any Maker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100ml Zlewka</td><td>Dowolna maszyna</td><td></td><td>do IVF</td></tr><tr><td>5 M Ammonium Accetate</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>Znaleziony w zestawie transkrypcyjnym MEGAshortscript T7</td><td>Synteza gRNA</td></tr><tr><td>70%</td><td></td><td></td><td>etanolu Synteza gRNA (70 ml etanolu + 30 ml &nbsp; wody wolnej od nukleaz)</td></tr><tr><td>Borosil 1,0 mm OD x 0,5 mm ID</td><td>FHC INC</td><td>27-30-1</td><td>do mikroiniekcji</td></tr><tr><td>Bulk Pharma Wodorowęglan sodu 35 funtów</td><td>Bulk Reef Supply</td><td>255</td><td>Zaopatrzenie ryb</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>MiliporeSigma</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>Cas9 Białko z NLS</td><td>PNABio</td><td>CP01</td><td></td></tr><tr><td>ChopChop</td><td></td><td></td><td>https://chopchop.cbu.uib.no/</td></tr> <tr><td>Stały oligonukleotyd</td><td>Zintegrowane DNA Technologie (IDT)</td><td></td><td>AAAAGCACCGACTCGGTGCCAC TTTTTCAAGTTGATAACGGACTA GCCTTATTTTAACTTGCTATTTC TAGCTCTAAAAC</td></tr><tr><td>Depresyjna szklana płyta</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>13-748B</td><td>do IVF</td></tr><tr><td>Kleszcze preparacyjne</td><td>Dumont</td><td>SS</td><td>do IVF</td></tr><tr><td>Nożyczki preparacyjne</td><td>Fine Science Tools</td><td>14091-09</td><td>Do IVF</td></tr><tr><td>Steroskop preparacyjny (ze źródłem światła przechodzącego)</td> <td>Dowolny producent</td><td></td><td>do IVF</td></tr><tr><td>DNA Clean & Koncentrator -5</td><td>Zymo Research</td><td>D4014</td><td>Synteza gRNA</td></tr><tr><td>DNA Gel Loading Dye (6x)</td><td>Dowolny producent</td><td></td><td>Do elektroforezy żelowej</td></tr><tr><td>EconoTaq DNA Polymerase</td><td>Lucigen</td><td>30032-1</td><td>Do PCR mix</td></tr><tr><td>Elektrofereza Zasilacz</td><td>Dowolny producent</td><td></td><td>Do elektroforezy żelowej</td></tr><tr><td>Ensemble</td><td></td><td></td><td>https://useast.ensembl.org/index.html</td></tr><tr><td>Eppendorf&nbsp; Końcówki do mikroładowarek Femtojet do mikrowtryskiwaczy Femtojet</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>E5242956003</td><td>do mikroiniekcji</td></tr><tr><td>Etanol (200 proof, bez nukleazy)</td><td>Any Maker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FemtoJet 4i</td><td>Eppendorf</td><td>5252000021</td><td>do mikroiniekcji</td></tr><tr><td>Sieć rybacka</td><td>Any Maker</td><td></td><td>Zaopatrzenie ryb</td></tr><tr><td>Mrożone krewetki solankowe</td><td>Solanka Krewetki bezpośrednie</td><td></td><td>Zaopatrzenie w ryby</td></tr><tr><td>Ogólna uniwersalna agaroza</td><td>Dowolna producentka</td><td></td><td>Do elektroforezy żelowej</td></tr><tr><td>Specyficzne dla genów oligonukleotydy</td><td>Zintegrowane technologie DNA (IDT)</td><td></td> <td>TAATACGACTCACTATA- N20 -GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG</td></tr><tr><td></td><td>Rękawice Any Maker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wiadro na lód</td><td>Dowolny producent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Natychmiastowa sól oceaniczna</td><td>Dowolny producent</td><td></td><td>Zaopatrzenie w ryby</td></tr><tr><td>Invitrogen UltraPure Ethidium Bromde, 10 mg/mL</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>15-585-011</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>MiliporeSigma</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>MiliporeSigma</td><td>7778-77-0</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>06-666</td><td></td></tr><tr><td>Męski i Samica danio</td><td></td><td></td><td></td>pręgowanego</tr><tr><td>MEGAshortscript T7 Zestaw do transkrypcji</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>AM1354</td><td>Synteza gRNA</td></tr><tr><td>Błękit metylenowy</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>AC414240250</td><td>dla E3</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>MiliporeSigma</td><td>7791-18-6</td><td>Do mieszanki PCR</td></tr><tr><td>MgSO2&middot; 7H2O</td><td>MiliporeSigma</td><td>M2773</td><td></td></tr><tr><td>Plastikowa forma do mikroiniekcji</td><td>Świat Precyzyjne instrumenty</td><td>Z-Molds</td><td>do mikroiniekcji</td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Dowolny producent</td><td>mikropipet do mikroiniekcji</td>Dowolny producent <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ściągacz do mikropipet</td><td>Sutter</td><td>P-87</td><td>do mikroiniekcji</td></tr><tr><td>Końcówki do mikropipeterów z filtrami (wszystkie rozmiary)</td><td>Any Maker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do mikropipet bez filtrów (wszystkie rozmiary)</td><td>Any Maker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microwave</td><td>Any Maker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mineral Oil</td><td>MiliporeSigma</td><td>m5904-5ml</td><td>do mikroiniekcji</td></tr><tr><td>MS-222 (Tricaine-D)</td><td>Any Maker</td><td></td><td>zatwierdzony przez FDA</td></tr><tr><td>Na2 HPO4</td><td>MiliporeSigma</td><td>S3264</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>MiliporeSigma</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>NaHC03</td><td>MiliporeSigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Any Maker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>MiliporeSigma</td><td>567530</td><td></td></tr><tr><td>Nieprzywierające, wolne od RNaz probówki do mikrofuge, 1,5 ml</td><td>Ambion</td><td>AM12450</td><td>Synteza</td></tr><tr><td>wody wolnej od nukleaz</td> gRNA <td>Dowolny producent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ręcznik papierowy</td><td>Dowolny producent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipety Pastro</td><td>Dowolny producent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Probówki paskowe PCR</td><td>Dowolny producent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Płytki Petriego o średnicy 100 mm</td><td>Dowolny producent Roztwór</td><td></td><td></td></tr><tr><td>czerwieni fenolowej</td><td>MiliporeSigma</td><td>P0290</td><td>do mikroiniekcji</td></tr><tr><td>Plastikowe pestale</td><td>VWR</td><td>47747-358</td><td>Do</td></tr><tr><td>plastikowej łyżki</td> IVF <td>Dowolny producent</td><td></td><td>Do IVF</td></tr><tr><td>Premium Grade Solanka Krewetki</td><td>Krewetki Bezpośrednie</td><td></td><td>Drobnokomórkowe</td></tr><tr><td>RNA Gel Loading Dye</td><td></td><td>znalezione w zestawie do transkrypcji MEGAshortscript T7</td><td>Do elektroforezy żelowej</td></tr><tr><td>RNAse AWAY</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>21-402-178</td><td></td></tr><tr><td>Skala</td><td>dowolnego producenta</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sharpie</td><td>dowolnego producenta</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Szpatułka</td><td>Dowolny producent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterylny H2O</td><td>Dowolny ekspres</td><td></td><td>do mieszanki PCR</td></tr><tr><td>Polimeraza DNA T4</td><td>NEB</td><td>M0203</td><td>Synteza taśmy gRNA</td></tr><tr><td></td><td>Dowolny producent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TBE (Tris-Boran-EDTA) 10x</td><td>Dowolna maszyna</td><td></td><td>Do elektroforezy żelowej</td></tr><tr><td>Tea Stainer</td><td>Amazon</td><td>IMU-71133W</td><td>Zaopatrzenie ryb</td></tr><tr><td>Grzebień Thermo Scientific Owl 12-zębny, grubość 1,0/1,5 mm, dwustronny do B2</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>B2-12</td><td>do elektroforezy żelowej</td></tr><tr><td>Thermo Scientific&nbsp; Owl EasyCast B2 Mini żelowe systemy elektroforezy</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>09-528-110B</td><td>Do elektroforezy żelowej</td></tr><tr><td>Termocykler</td><td>Dowolny producent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Termocykler</td><td>Dowolny producent</td> Transilluminator Dowolny producent <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lampa UV</td><td></td><td>UVP Model XX-15 (nr kat. UVP18006201)</td>Do <td></td></tr><tr><td>okularów ochronnych UVF UVF</td><td>Dowolny producent</td><td></td> do <td></td></tr><tr><td>butelki do mycia</td> IVF <td>Thermo Fischer Scientific</td><td>S39015</td><td>Zaopatrzenie ryb</td></tr><tr><td>Pudełka godowe danio pręgowanego</td><td>Aqua Schwarz</td><td>SpawningBox1</td><td>Zaopatrzenie ryb</td></tr><tr><td>1,5 ml Probówki Eppendorf</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-402-11</td><td></td></tr><tr><td>10 dNTP trzonowych Drabina</td><td></td><td></td> Thermo Fischer Scientific 18427013 <td></td></tr><tr><td>100 BP</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>15628019</td><td></td></tr><tr><td>100% etanol wolny od RNAzy</td><td>dowolny producent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5m Ammonium Accetate</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>70% etanolu</td><td></td><td></td><td>70ml etanolu i 30 ml wody wolnej od nukleaz</td></tr><tr><td>Akcesoria do poziomego pudełka żelowego</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>0,625 mm</td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>dowolny producent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>10043-52-4</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2, dwuwodny</td><td>Sigma</td><td>10035-04-8</td><td>E3 Średnia</td></tr><tr><td>rurka kapilarna</td><td>Cole-Parmer</td><td>UX-03010-68</td><td>do igieł iniekcyjnych</td></tr><tr><td>Cas9 Protein</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>A36496</td><td></td></tr><tr><td>ChopChop</td><td>https://chopchop.cbu.uib.no/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Komputer</td><td>dowolny producent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sekcja Forcepts</td><td>dowolny producent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny</td><td>dowolny producent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki preparacyjne</td><td>dowolny producent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNA Clean & Koncentrator -5</td><td>Zymo Research</td><td>D4014</td><td></td></tr><tr><td>Barwnik ładujący żel DNA (6X)</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>R0611</td><td></td></tr><tr><td>EconoTaq Polimeraza DNA</td><td>Lucigen</td><td>30032-1</td><td></td></tr><tr><td>Ensemble</td><td>https://useast.ensembl.org/index.html</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Microloader PipetTips</td><td>Fischer Scientific</td><td>10289651</td><td>20 mikrolitrów</td></tr><tr><td>Etanol (200 proof, bez nukleaz)</td> <td>dowolny producent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bromek etydyny</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>15585011</td><td></td></tr><tr><td>Sieć na ryby</td><td>dowolnego producenta</td><td></td><td>drobna siatka</td></tr><tr><td>Mrożone krewetki solankowe</td><td>LiveAquaria</td><td>CD-12018</td><td>pokarm dla ryb</td></tr><tr><td>Grzebień żelowy (0,625 mm)</td><td>dowolny producent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>System elektroferezy żelowej</td><td>dowolny producent</td><td></td><td></td></tr><tr>Zintegrowane technologie DNA <td>z oligonukleotydami specyficznymi dla genów</td><td>(IDT)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szklana igła kapilarna</td><td>Grainger</td><td>21TZ99</td><td>https://www.grainger.com/product/21TZ99?ef_id=Cj0KCQjw8Ia GBhCHARIsAGIRRYpqsyA3-LUXbpZVq7thnRbroBqQTbrZ_a88 VVcI964LtOC6SFLz4ZYaAhZzEAL w_wcB:G:s& s_kwcid=AL!2966!3! 264955916096!!! g!438976 780705!& gucid=N:N:PS:Płatny :GGL:CSM-2295:4P7A1P:20501 231& gclid=Cj0KCQjw8IaGBh CHARIsAGIRRYpqsyA3-LUXbp ZVq7thnRbroBqQTbrZ_a88VVcI 964LtOC6SFLz4ZYaAhZzEALw _wcB& gclsrc=aw.ds</td></tr><tr><td>Naczynia szklane</td><td>dowolny producent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rękawice</td><td>dowolnego producenta</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Końcowe Rozwiązanie</td><td></td><td></td> Robocze <td>Hanka Połącz 9,9 ml Premiksu Hanka z 0,1 ml Bulionu HS #6</td></tr><tr><td>Hank's Premix</td><td></td><td></td><td>połącz następujące elementy w kolejności: (1) 10,0 ml HS #1, (2) 1,0 ml HS#2, (3) 1,0 ml HS#4, (4) 86 ml ddH2O, (5) 1,0 ml HS#5. Przechowuj wszystkie solotiony HS w 4C</td></tr><tr>Roztwór <td></td><td></td><td></td><td>Hanksa</td></tr><tr>Roztwór <td></td><td></td><td>Hanksa</td><td>https://www.jove.com/pdf-materials/51708/jove-materials-51708-production-of-haploid-zebrafish-embryos-by-in-vitro-fertilization</td></tr><tr><td>Podstawowy roztwór Hanka #1</td><td></td><td></td><td>8,0 g NaCl, 0,4 g KCl w 100 ml ddH2O</td></tr><tr><td>Roztwór podstawowy Hanka #2</td><td></td><td></td><td>0,358 g Na2HPO4 bezwodny; 0,60 g K2H2PO4 w 100 ml ddH2O</td></tr><tr><td>Roztwór podstawowy Hanka #4</td><td></td><td></td><td>0,72 g CaCl2 w 50 ml ddH2O</td></tr><tr><td>Roztwór podstawowy Hanka #5</td><td></td><td></td><td>1,23 g MgSO47H2O w 50 ml ddH20</td></tr><tr><td>Roztwór podstawowy Hanka #6</td><td></td><td></td><td>0,35 g NaHCO3 w 10,0 ml ddH20; Zrób świeży dzień użytkowania</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma</td><td>7647-01-0</td><td></td></tr><tr><td>Wiadro na lód</td><td>dowolny producent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Natychmiastowa sól oceaniczna</td><td>dowolna maszyna</td><td></td><td>do wody dla ryb</td></tr><tr><td>Zestaw do transkrypcji in vitro Mega Short Script</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>AM1354</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen&trade; UltraPure&handel; Woda destylowana bez DNaz/RNaz</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-977-023</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>7447-40-7</td><td>E3 Medium</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>7778-77-0</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666</td><td></td></tr><tr><td>Samce i samice danio</td><td></td><td></td><td></td>pręgowanego</tr><tr><td>Mega Short Script T7 Zestaw do transkrypcji</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>AM1354</td><td></td></tr><tr><td>błękit metylenowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC414240250</td><td>E3 Medium</td></tr><tr><td>MgSO2-7H2O</td><td>Sigma</td><td>M2773</td><td></td></tr><tr><td>Mikroimikromanipulator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plastikowa forma do mikroiniekcji</td><td>Świat Precision</td><td>Instruments Z-Molds</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowtryskiwacz</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Suwak</td> <td>mikroigłowy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikropipeter (1-10) z końcówkami,</td> których potrzebuje <td>każdy producent</td><td></td><td>Filtrowane końcówki P10</td></tr><tr><td>Mikropipeter (20-200) z końcówkami</td><td>dowolnego producenta</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikropipeter (100-1000) z końcówkami</td><td>dowolnego producenta</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko</td><td></td><td></td><td></td>do mikroplastiku</tr><tr><td>Kuchenka mikrofalowa</td><td>dowolnego producenta</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MiliQ Woda</td><td>dowolna Maker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olej mineralny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5904-5ml</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>NaHC02</td><td>Sigma</td><td>223441</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma</td><td>567530</td><td></td></tr><tr><td>Wąska szpatułka</td><td>dowolny producent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ściągacz do igieł</td> Ręcznik papierowy <td>Sutter</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td></td><td>dowolnego producenta</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipety Pastro</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>Miejsce prowadzenia startera PCR</td><td>Zintegrowane technologie DNA (IDT)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Startery PCR prowadnica flankująca miejsce cięcia RNA</td><td>Zintegrowane technologie DNA (IDT)</td><td></td> <td>Standard odsalany</td></tr><tr><td>Probówki paskowe do PCR</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>AB0771W</td><td></td></tr><tr><td>szalki Petriego</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875714</td><td>10 cm średnica 100mm x 15mm</td></tr><tr><td>Fenol Red</td><td>Fisher Science</td><td>S25464</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/phenol-red-indicator-solution-0-02-w-v-2/S25464</td></tr><tr><td>Końcówki do pipet</td><td>dowolnego producenta</td><td></td><td>Końcówki 10ul, 200ul i 1000ul</td></tr><tr><td>Plastikowe pestki</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-141-364</td><td></td></tr><tr><td>Plastikowa łyżka</td><td>dowolnego producenta</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Przewodnik po podkładach Zintegrowane</td><td>technologie DNA (IDT)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Żyletka</td><td>Uline</td><td>H-595B</td><td></td></tr><tr><td>Żel RNA Ładowanie barwnika</td><td>w megakrótkim zestawie skryptów (zestaw do transkrypcji in vitro)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>RNAzyj od</td><td>Fishera</td><td>21-402-178</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek polipropylenowych bez RNA</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>AM12400</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AM12400#/AM12400</td></tr><tr><td>Woda wolna od RNAzy</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-977-023</td><td></td></tr><tr><td>Skala</td><td>dowolnego producenta</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sharpie</td><td>dowolny producent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu (komórka testowane pod kątem kultur)</td> <td>Sigma</td><td>S5761</td><td>woda rybna</td></tr><tr><td>Bromek sodu Solotion</td><td>Sigma</td><td>E1510</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do sekwencjonowania Sangera Analiza</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterlie H2O</td><td>dowolnej marki</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Polimeraza</td><td>NEB</td><td>M0203S</td><td>https://www.neb.com/products/m0203-t4-dna-polymerase#Product%20Information</td></tr><tr><td>Taśma</td><td>dowolnej marki</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TBE (Tris-Borate-EDTA) 10X</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>B52</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/B52#/B52</td></tr><tr><td>Tea Stainer</td><td>amazon</td><td>IMU-71133W</td><td>dostępny w większości sklepów kuchennych</td></tr><tr><td>Termocykler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipeta transferowa</td><td>Uline</td><td>S-24320</td><td></td></tr><tr><td>Transilluminator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>fisher scientific</td><td>NC0872873</td><td></td></tr><tr><td>Tris HCl 7.5</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>15567027</td><td></td></tr><tr><td>Uniwersalny podkład</td><td>Zintegrowane technologie DNA (IDT)</td><td></td><td>AAAAGCACCGACTCGGTGCCAC TTTTTCAAGTTGATAACGGACTAG CCTTATTTTAACTTGCTATTTCTA GCTCTAAAAC</td></tr><tr><td>Lampa UV</td> Okulary ochronne <td>UVP</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UVP dowolnego producenta</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Butelka do mycia</td><td>fisher scientific</td><td>S39015</td><td></td></tr><tr><td>Pudełka godowe danio pręgowanego</td><td>dowolny producent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Przepis na</td> <td>bufor PCRDodać 171,12 ml sterylnego H20; 0,393 ml 1M MgCl2; 2,616 ml 1 mln MgCl2; 2,618 ml 1M Tris-HCl (pH 8,4) 13,092 ml 1M KCl; 0,262 ml 1% żelatyny. Autoklaw przez 20 minut, a następnie schłodź solotion na lodzie. Następnie dodaj 3,468 ml 100 mg/ml BSA; 0,262 ml dATP (100 mM), 0,262 ml dCTP (100 mM); 0,262 ml dGTP (100 mM); &nbsp; 0,262 ml dTTP (100 ml). Alliquote do sterylnych probówek eppendorfa</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

określanie roli genów ulegających ekspresji matki we wczesnym rozwoju za pomocą matczynych chrupek

Determining the Role of Maternally-Expressed Genes in Early Development with Maternal Crispants

Wczesny rozwój zależy od puli czynników matczynych włączonych do dojrzałego oocytu podczas oogenezy, które spełniają wszystkie funkcje komórkowe niezbędne do rozwoju, aż do aktywacji genomu zygotycznego. Zazwyczaj genetyczne ukierunkowanie tych czynników matczynych wymaga dodatkowego pokolenia w celu zidentyfikowania fenotypów efektu matczynego, co utrudnia określenie roli genów o ekspresji matczynej podczas rozwoju. Odkrycie możliwości edycji biallelicznej CRISPR-Cas9 umożliwiło badania przesiewowe fenotypów embrionalnych w tkankach somatycznych wstrzykniętych zarodków lub "crispantów", pogłębiając zrozumienie roli, jaką geny wyrażane zygotycznie odgrywają w programach rozwojowych. W tym artykule opisano protokół, który jest rozszerzeniem metody crispant. W tej metodzie bialleliczny montaż komórek rozrodczych pozwala na wyizolowanie fenotypu efektu matczynego w jednym pokoleniu, czyli "matczynych chrupania". Multipleksowanie prowadzących RNA do jednego celu sprzyja wydajnej produkcji matczynych chrupków, podczas gdy analiza sekwencji matczynych chrupiących haploidów zapewnia prostą metodę potwierdzania zmian genetycznych, które wytwarzają fenotyp efektu matczynego. Stosowanie matczynych chrupek wspomaga szybką identyfikację niezbędnych genów ulegających ekspresji matczynej, ułatwiając w ten sposób zrozumienie wczesnego rozwoju.

Podejście eksperymentalne opisane w niniejszym protokole pozwala na szybką i efektywną pod względem zasobów identyfikację fenotypów efektu macierzyńskiego (Rysunek 1).
Generowanie macierzystych crispantów: 
Projektując cztery gRNA nakierowane na jeden kandydujący gen efektu macierzyńskiego, szczególną uwagę należy zwrócić na miejsca wiązania gRNA z DNA. Zasadniczo powinny one być zgrupowane razem, z minimalnymi lub brakiem obszarów nakładania s...

Wczesny rozwój zależy od produktów dziedziczonych po matce, a rola wielu z tych produktów jest obecnie nieznana. W tym miejscu opisaliśmy protokół, który wykorzystuje CRISPR-Cas9 do identyfikacji fenotypów efektu matczynego w jednym pokoleniu.

Określanie roli genów ulegających ekspresji matki we wczesnym rozwoju za pomocą matczynych chrupek

Early development depends on a pool of maternal factors incorporated into the mature oocyte during oogenesis that perform all cellular functions necessary ...

Rola wielu genów ulegających ekspresji matczynej we wczesnym okresie rozwoju jest obecnie nieznana. Ta matczyna technika CRISPR pozwala na szybką identyfikację genów efektu matczynego i ich roli w rozwoju. Multipleksowanie prowadzi RNA do pojedynczego genu, co pozwala naukowcom zidentyfikować nowe fenotypy efektu matczynego w jednym pokoleniu.Badania te są korzystne dla zrozumienia funkcji transkryptów mRNA w gametach, które są niezbędne do wczesnej embriogenezy. Kluczem do tej techniki jest mikroiniekcja zarodków na wczesnym etapie jednej komórki i sprawdzenie, czy większość przewodnikowych RNA może powodować mutacje somatyczne w wstrzykniętych zarodkach. Aby stworzyć matrycę przewodnika RNA dla każdego oligonukleotydu specyficznego dla genu, należy przeprowadzić analit do stałego oligonukleotydu i wypełnić nawisy polimerazą DNA T4.Po złożeniu czterech szablonów prowadzącego RNA, oczyść je i skoncentruj razem za pomocą zestawu do oczyszczania i koncentratora DNA. Zsyntetyzuj mieszaninę sgRNA z połączonej matrycy RNA faceta, używając zestawu do transkrypcji T7 in vitro i wykonaj transkrypcję in vitro zgodnie z opisem w manuskrypcie. Aby zweryfikować integralność sgRNA, odlej 1% agarozę 0,5 mikrograma na mililitr, żel Tris-Boran-EDTA z bromku etydyny.Umieść zestalony żel w buforze do pracy Tris-Borate-EDTA. Wymieszaj jedną mikrolitrową mieszaninę sgRNA i jeden mikrolitrowy bufor ładujący żel RNA. Załaduj tę próbkę do żelu i uruchom żel pod napięciem 100 woltów przez pięć minut.Wizualizuj pasma za pomocą światła ultrafioletowego. Ustaw krzyżówki dzikich typów i pudełka godowe danio pręgowanego. Trzymaj samca i samicę w tym samym zbiorniku, ale oddziel je za pomocą przegrody do puli godowej lub, jak pokazano tutaj, umieszczając samicę we wkładce do składania jaj.Po złożeniu koktajlu do wstrzykiwań należy pozwolić samcowi i samicy na kopulację, usuwając przegrodę pudełka do krycia lub, jak pokazano tutaj, umieszczając samca w tej samej wkładce do składania jaj co samica. Aby zsynchronizować zarodki, zbierz je po 10 minutach za pomocą plastikowego sitka i opłucz na szalkę Petriego za pomocą pożywki 1XE3. Usunąć od 10 do 15 zarodków i umieścić je na oddzielnej szalce Petriego, aby były przechowywane jako niewstrzyknięte grupy kontrolne.Przenieść pozostałe zarodki do studzienek na płytkę iniekcyjną. Wstrzyknąć jeden nanolitrowy roztwór białka sgRNA do rozwijającego się dysku blasto zarodka jednokomórkowego. Użyj kleszczyków, aby złamać końcówkę zatkanej igły i ponownie skalibrować igłę, aby wysunąć bolus o pojemności jednego nanolitra.Następnego dnia po wstrzyknięciu należy pobrać sześć zdrowych zarodków, którym wstrzyknięto zarodki i dwa zarodki kontrolne z płytki, której nie wstrzyknięto. Umieść każdy zarodek indywidualnie w jednym dołku probówki paskowej do PCR i oznacz górną część probówek. Zaprojektuj unikalne startery przesiewowe dla każdego miejsca prowadzącego, aby amplifikować fragment DNA parzysty od 100 do 110 zasad, który zawiera miejsce docelowe CRISPR-Cas9.Jeśli to możliwe, umieść miejsce docelowe w środku amplifikowanego fragmentu, co pozwoli na identyfikację większych delecji. Dla każdego z czterech docelowych miejsc prowadzenia należy przeprowadzić osiem reakcji PCR o pojemności 25 mikrolitrów, używając pięciu mikrolitrów przygotowanego pojedynczego embrionomicznego DNA i 20 mikrolitrów mieszanki PCR, a następnie poprowadzić specyficzną mieszaninę starterów przesiewowych, aby zidentyfikować mutacje somatyczne w miejscu docelowym. Odlej 2,5% agarozy, 0,5 mikrograma na mililitr bromku etydyny Tris-Boran-EDTA za pomocą grzebieni, które tworzą studzienki o szerokości około 0,625 centymetra.Następnie umieść zestalony żel w komorze elektroforetycznej zawierającej bufor do pracy Tris-Boran-EDTA. Dodaj pięć mikrolitrów barwnika o 6-krotnym obciążeniu do produktu PCR. Załaduj 25 mikrolitrów tej mieszaniny do żelu, upewniając się, że wstrzyknięta i kontrolna próbka znajdują się w tym samym rzędzie żelu.Po załadowaniu wszystkich próbek dodać pięć mikrolitrów bromku etydyny na jeden litr buforu biegowego Tris-Borate-EDTA do dodatniego końca pudełka żelowego. Uruchom żel pod napięciem 120 woltów, aż zakazy DNA znikną lub DNA zbliży się do końca pasa. Aby zidentyfikować fenotypy efektu matczynego i zarodki matczynego CRISPR, należy ustawić wstrzyknięte samice F0 przeciwko samcom typu dzikiego i kontrolować krzyżówki typu dzikiego w standardowych skrzynkach godowych zebry w godzinach popołudniowych przed eksperymentem.Umieść samca i samicę w tym samym zbiorniku, ale oddziel je przegrodą do łączenia się z pudełkiem godowym lub umieść samicę we wkładce do składania jaj. Rankiem w dniu eksperymentu pozwól samcowi i samicy rozpocząć kopulację, usuwając przegrodę pudełka godowego lub umieszczając samca w tej samej wkładce do składania jaj co samica. Zbieraj zarodki co 10 minut, przenosząc wkładkę do składania jaj do nowego dna zbiornika godowego, który zawiera świeżą wodę systemową, i oznacz zbiornik znacznikiem identyfikującym pojedynczą samicę F0.Weź stary zbiornik godowy i przelej wodę przez sitko T, aby zebrać zarodki z jednego osobnika 10-minutowego lęgu. Pod mikroskopem preparacyjnym z transcendentnym źródłem światła obserwuj zarodki w procesie rozwoju co godzinę, przez pierwsze sześć do ośmiu godzin i codziennie przez następne pięć dni. Przenieś potencjalne matczyne zarodki CRISPR na szalkę Petriego, która zawiera pożywkę 1XE3, i oznacz fenotyp morfologiczny po 24 godzinach od zapłodnienia i żywotność po pięciu dniach od zapłodnienia.Po południu przed eksperymentem należy ustawić pary godowe samic F0, utrzymując samce typu dzikiego fizycznie oddzielone od samic, używając przegrody do puli godowej lub umieszczając samicę we wkładce do składania jaj. Rankiem w dniu eksperymentu usuń fizyczną przegrodę, aby zainicjować krycie. Przy pierwszych oznakach składania jaj przerwij rozmnażanie, oddzielając samca i samice F0, a każdą oddzieloną samicę F0 trzymaj w indywidualnych boksach godowych.Po zapłodnieniu in vitro pozwól haploidalnym zarodkom rozwijać się do momentu zaobserwowania matczynego fenotypu CRISPR i umieść te zarodki na innej szalce Petriego. Po zidentyfikowaniu matczynych haploidalnych zarodków CRISPR pozwól im rozwijać się przez co najmniej sześć godzin po zapłodnieniu. Aby wyekstrahować genomowe DNA z co najmniej 10 matczynych haploidalnych zarodków CRISPR, umieść pojedynczy haploidalny zarodek w indywidualnym dołku probówki paskowej do PCR, usuń nadmiar pożywki E3 ze studzienki i dodaj 50 mikrolitrów 50-milimolowego wodorotlenku sodu.Inkubuj zarodki przez 20 minut w temperaturze 95 stopni Celsjusza i schładzaj je do czterech stopni Celsjusza. Następnie dodaj pięć mikrolitrów jednego molowego kwasu solnego tris-solnego o pH 7,5 i wiruj przez pięć do 10 sekund. Aby zidentyfikować, które miejsca przewodnika zawierają indele, zaprojektuj startery sekwencjonowania w celu amplifikacji fragmentu DNA, w tym wszystkich czterech miejsc docelowych CRISPR/Cas9.Ustaw dwie reakcje PCR o pojemności 25 mikrolitrów na zarodek, używając pięciu mikrolitrów przygotowanego genomowego DNA i starterów sekwencjonowania. Po zakończeniu PCR oczyść i skoncentruj dwie próbki za pomocą zestawu do oczyszczania i koncentratora DNA, a następnie prześlij fragment DNA do sekwencjonowania Sangera, używając starterów sekwencjonowania do przodu i do tyłu. Wszystkie przewodnikowe RNA powinny być zgrupowane razem, z minimalnymi lub żadnymi nakładającymi się regionami między przewodnikowymi RNA podczas generowania matczynego CRISPR.Jeśli powstały indele, należy zaobserwować rozmaz w próbkach wstrzykniętych na żelu agarozowym, ale nie w niewstrzykniętej kontroli. Metoda matczynego CRISPR może być stosowana do fenokopii znanych mutacji efektu matczynego, takich jak pstrokacizna, TMI i aura. Aby zidentyfikować zmiany genetyczne, które przyczyniają się do matczynego fenotypu CRISPR, plemniki poddane działaniu promieniowania UV i zapłodnienie in vitro są łączone w celu stworzenia matczynych haploidów CRISPR.Stworzenie haploidalnego pozwala na sekwencjonowanie allelu matczynego przez Sangera i identyfikację matczynych indeli CRISPR. Podczas identyfikacji fenotypu efektu matczynego ważne jest, aby móc go zaobserwować u wielu samic F0, ponieważ zwiększa to prawdopodobieństwo, że fenotyp jest spowodowany utratą funkcji, a nie efektami niezamierzonymi lub niespecyficznymi. Po zidentyfikowaniu fenotypu wpływu matki, zarodki matki CRISPR mogą być wykorzystane do zbadania wpływu na różne aspekty wczesnej embriogenezy, takie jak szkielet zatokowy lub segregacja DNA.Pozwala to naukowcom zrozumieć molekularną przyczynę fenotypu. Metoda ta bezpośrednio testuje funkcję nieznanych genów ulegających ekspresji matczynej w jednym pokoleniu, poszerzając nasze zrozumienie procesów zachodzących we wczesnej embriogenezie.

determining-role-maternally-expressed-genes-early-development-with

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Los pojedynczej komórki embrionalnej może być determinowany przez cząsteczki dziedziczne i/lub sygnały pochodzące od sąsiednich komórek. Wykorzystując mapy losów embrionu Xenopus w stadium podziałów, można zidentyfikować pojedyncze blastomery w celu ich izolowanej hodowli, aby ocenić wpływ cząsteczek dziedzicznych w stosunku do oddziaływań międzykomórkowych.

Eksplanty blastomerów do badania determinacji losów komórek podczas rozwoju embrionalnego

Opisujemy metody manipulowania niedojrzałymi oocytami Xenopus laevis, dojrzewania in vitro oocytów do komórek jajowych oraz docytoplazmatycznego wstrzykiwania plemników. Protokół ten umożliwia degradację niektórych białek matczynych i nadekspresję genów będących przedmiotem zainteresowania podczas zapłodnienia, a zatem jest cenny dla badania ról określonych czynników we wczesnym rozwoju embrionalnym.

Manipulacja i dojrzewanie in vitro oocytów Xenopus laevis, a następnie docytoplazmatyczna iniekcja plemnika w celu zbadania rozwoju embrionalnego

Ten protokół przedstawia metodę przeprowadzania ilościowej, jednokomórkowej analizy in situ ekspresji białek w celu zbadania specyfikacji linii u mysich zarodków przedimplantacyjnych. Opisano procedury niezbędne do pobierania blastocyst, wykrywania białek metodą immunofluorescencyjną w całości montowanej, obrazowania próbek pod mikroskopem konfokalnym oraz segmentacji jądrowej i analizy obrazu.

Analiza ilościowa ekspresji białek w celu zbadania specyfikacji linii w zarodkach myszy przed implantacją

Zoptymalizowany protokół dojrzewania in vitro oocytów danio pręgowanego, używany do manipulacji produktami genów matki, jest prezentowany tutaj.

Funkcjonalna manipulacja matczynymi produktami genowymi z wykorzystaniem dojrzewania oocytów in vitro u danio pręgowanego

Konwencjonalne badania utraty funkcji genów przy użyciu zwierząt nokautujących często były kosztowne i czasochłonne. Mutageneza somatyczna oparta na CRISPR oparta na elektroporacji jest potężnym narzędziem do zrozumienia funkcji genów in vivo. W tym miejscu przedstawiamy metodę analizy fenotypów nokautu w proliferujących komórkach móżdżku.

Analiza utraty funkcji za pośrednictwem CRISPR w komórkach ziarnistych móżdżku przy użyciu transferu genów opartego na elektroporacji in utero

Ta praca opisuje protokół o średniej przepustowości, który umożliwia jednoczesne obrazowanie 3D poklatkowe embriogenezy u zarodków 80-100 C. elegans w ciągu jednej nocy. Dodatkowo dołączone są narzędzia do przetwarzania i wizualizacji obrazu, które usprawniają analizę danych. Połączenie tych metod z niestandardowymi szczepami reporterowymi umożliwia szczegółowe monitorowanie embriogenezy.

Metoda obrazowania półwysokoprzepustowego i zestaw narzędzi do wizualizacji danych do analizy rozwoju embrionalnego C. elegans

Opisujemy technikę profilowania mikroRNA we wczesnych zarodkach myszy. Protokół ten pozwala przezwyciężyć wyzwanie związane z niskim wkładem komórek i wzbogaceniem małego RNA. Test ten można wykorzystać do analizy zmian w ekspresji miRNA w czasie w różnych liniach komórkowych wczesnego zarodka myszy.

Przygotowanie małych bibliotek RNA do sekwencjonowania z wczesnych zarodków myszy

Tutaj opisujemy szybką i bezpośrednią metodologię badań przesiewowych in vivo CRISPR/Cas9 za pomocą ultrasonograficznych iniekcji embrionalnych lentiwirusów in utero w celu jednoczesnej oceny funkcji kilku genów w skórze i jamie ustnej myszy immunokompetentnych.

Badania przesiewowe in vivo CRISPR/Cas9 w celu jednoczesnej oceny funkcji genów w skórze myszy i jamie ustnej myszy

Tutaj opisujemy metodę efektywnego manipulowania krytycznymi ścieżkami rozwojowymi w łożysku myszy in vivo. Odbywa się to poprzez wstrzyknięcie i elektroporację plazmidów CRISPR do łożysk ciężarnych matek w 12,5 dniu embrionalnym.

Mysz In Vivo Ukierunkowana manipulacja CRISPR

W tym miejscu opisujemy protokół generowania matczynego mutanta, który łączy stabilną linię knock-in zpc: cas9 z dostarczaniem kaset ekspresyjnych sgRNA za pośrednictwem Tol2.

Generowanie matczynych mutantów przy użyciu zpc:cas9 Knock-in Danio pręgowanego

Artykuł zawiera kompleksowy protokół do wygenerowania modelu mysiego aktywacji immunologicznej matki (MIA) w celu zbadania wpływu wczesnego zapalenia w czasie ciąży na neurorozwój, w tym kluczowe wskaźniki, aby zapewnić niezawodność i powtarzalność.

Generowanie wczesno-ciążowego modelu aktywacji odporności matczynej u myszy w celu oceny prenatalnego stanu zapalnego na neurorozwój

Poznaj technikę CRISPR-Cas9 do identyfikacji genów matczynych we wczesnym rozwoju embrionalnym. Metoda multiplexingu guide RNA umożliwia szybkie odkrywanie nowych fenotypów matczynych w jednym pokoleniu.

Określanie roli genów ulegających ekspresji matki we wczesnym rozwoju za pomocą matczynych chrupek

Przeglądaj więcej filmów