Określanie roli genów ulegających ekspresji matki we wczesnym rozwoju za pomocą matczynych chrupek

Rola wielu genów ulegających ekspresji matczynej we wczesnym okresie rozwoju jest obecnie nieznana. Ta matczyna technika CRISPR pozwala na szybką identyfikację genów efektu matczynego i ich roli w rozwoju. Multipleksowanie prowadzi RNA do pojedynczego genu, co pozwala naukowcom zidentyfikować nowe fenotypy efektu matczynego w jednym pokoleniu.

Badania te są korzystne dla zrozumienia funkcji transkryptów mRNA w gametach, które są niezbędne do wczesnej embriogenezy. Kluczem do tej techniki jest mikroiniekcja zarodków na wczesnym etapie jednej komórki i sprawdzenie, czy większość przewodnikowych RNA może powodować mutacje somatyczne w wstrzykniętych zarodkach. Aby stworzyć matrycę przewodnika RNA dla każdego oligonukleotydu specyficznego dla genu, należy przeprowadzić analit do stałego oligonukleotydu i wypełnić nawisy polimerazą DNA T4.

Po złożeniu czterech szablonów prowadzącego RNA, oczyść je i skoncentruj razem za pomocą zestawu do oczyszczania i koncentratora DNA. Zsyntetyzuj mieszaninę sgRNA z połączonej matrycy RNA faceta, używając zestawu do transkrypcji T7 in vitro i wykonaj transkrypcję in vitro zgodnie z opisem w manuskrypcie. Aby zweryfikować integralność sgRNA, odlej 1% agarozę 0,5 mikrograma na mililitr, żel Tris-Boran-EDTA z bromku etydyny.

Umieść zestalony żel w buforze do pracy Tris-Borate-EDTA. Wymieszaj jedną mikrolitrową mieszaninę sgRNA i jeden mikrolitrowy bufor ładujący żel RNA. Załaduj tę próbkę do żelu i uruchom żel pod napięciem 100 woltów przez pięć minut.

Wizualizuj pasma za pomocą światła ultrafioletowego. Ustaw krzyżówki dzikich typów i pudełka godowe danio pręgowanego. Trzymaj samca i samicę w tym samym zbiorniku, ale oddziel je za pomocą przegrody do puli godowej lub, jak pokazano tutaj, umieszczając samicę we wkładce do składania jaj.

Po złożeniu koktajlu do wstrzykiwań należy pozwolić samcowi i samicy na kopulację, usuwając przegrodę pudełka do krycia lub, jak pokazano tutaj, umieszczając samca w tej samej wkładce do składania jaj co samica. Aby zsynchronizować zarodki, zbierz je po 10 minutach za pomocą plastikowego sitka i opłucz na szalkę Petriego za pomocą pożywki 1XE3. Usunąć od 10 do 15 zarodków i umieścić je na oddzielnej szalce Petriego, aby były przechowywane jako niewstrzyknięte grupy kontrolne.

Przenieść pozostałe zarodki do studzienek na płytkę iniekcyjną. Wstrzyknąć jeden nanolitrowy roztwór białka sgRNA do rozwijającego się dysku blasto zarodka jednokomórkowego. Użyj kleszczyków, aby złamać końcówkę zatkanej igły i ponownie skalibrować igłę, aby wysunąć bolus o pojemności jednego nanolitra.

Następnego dnia po wstrzyknięciu należy pobrać sześć zdrowych zarodków, którym wstrzyknięto zarodki i dwa zarodki kontrolne z płytki, której nie wstrzyknięto. Umieść każdy zarodek indywidualnie w jednym dołku probówki paskowej do PCR i oznacz górną część probówek. Zaprojektuj unikalne startery przesiewowe dla każdego miejsca prowadzącego, aby amplifikować fragment DNA parzysty od 100 do 110 zasad, który zawiera miejsce docelowe CRISPR-Cas9.

Jeśli to możliwe, umieść miejsce docelowe w środku amplifikowanego fragmentu, co pozwoli na identyfikację większych delecji. Dla każdego z czterech docelowych miejsc prowadzenia należy przeprowadzić osiem reakcji PCR o pojemności 25 mikrolitrów, używając pięciu mikrolitrów przygotowanego pojedynczego embrionomicznego DNA i 20 mikrolitrów mieszanki PCR, a następnie poprowadzić specyficzną mieszaninę starterów przesiewowych, aby zidentyfikować mutacje somatyczne w miejscu docelowym. Odlej 2,5% agarozy, 0,5 mikrograma na mililitr bromku etydyny Tris-Boran-EDTA za pomocą grzebieni, które tworzą studzienki o szerokości około 0,625 centymetra.

Następnie umieść zestalony żel w komorze elektroforetycznej zawierającej bufor do pracy Tris-Boran-EDTA. Dodaj pięć mikrolitrów barwnika o 6-krotnym obciążeniu do produktu PCR. Załaduj 25 mikrolitrów tej mieszaniny do żelu, upewniając się, że wstrzyknięta i kontrolna próbka znajdują się w tym samym rzędzie żelu.

Po załadowaniu wszystkich próbek dodać pięć mikrolitrów bromku etydyny na jeden litr buforu biegowego Tris-Borate-EDTA do dodatniego końca pudełka żelowego. Uruchom żel pod napięciem 120 woltów, aż zakazy DNA znikną lub DNA zbliży się do końca pasa. Aby zidentyfikować fenotypy efektu matczynego i zarodki matczynego CRISPR, należy ustawić wstrzyknięte samice F0 przeciwko samcom typu dzikiego i kontrolować krzyżówki typu dzikiego w standardowych skrzynkach godowych zebry w godzinach popołudniowych przed eksperymentem.

Umieść samca i samicę w tym samym zbiorniku, ale oddziel je przegrodą do łączenia się z pudełkiem godowym lub umieść samicę we wkładce do składania jaj. Rankiem w dniu eksperymentu pozwól samcowi i samicy rozpocząć kopulację, usuwając przegrodę pudełka godowego lub umieszczając samca w tej samej wkładce do składania jaj co samica. Zbieraj zarodki co 10 minut, przenosząc wkładkę do składania jaj do nowego dna zbiornika godowego, który zawiera świeżą wodę systemową, i oznacz zbiornik znacznikiem identyfikującym pojedynczą samicę F0.

Weź stary zbiornik godowy i przelej wodę przez sitko T, aby zebrać zarodki z jednego osobnika 10-minutowego lęgu. Pod mikroskopem preparacyjnym z transcendentnym źródłem światła obserwuj zarodki w procesie rozwoju co godzinę, przez pierwsze sześć do ośmiu godzin i codziennie przez następne pięć dni. Przenieś potencjalne matczyne zarodki CRISPR na szalkę Petriego, która zawiera pożywkę 1XE3, i oznacz fenotyp morfologiczny po 24 godzinach od zapłodnienia i żywotność po pięciu dniach od zapłodnienia.

Po południu przed eksperymentem należy ustawić pary godowe samic F0, utrzymując samce typu dzikiego fizycznie oddzielone od samic, używając przegrody do puli godowej lub umieszczając samicę we wkładce do składania jaj. Rankiem w dniu eksperymentu usuń fizyczną przegrodę, aby zainicjować krycie. Przy pierwszych oznakach składania jaj przerwij rozmnażanie, oddzielając samca i samice F0, a każdą oddzieloną samicę F0 trzymaj w indywidualnych boksach godowych.

Po zapłodnieniu in vitro pozwól haploidalnym zarodkom rozwijać się do momentu zaobserwowania matczynego fenotypu CRISPR i umieść te zarodki na innej szalce Petriego. Po zidentyfikowaniu matczynych haploidalnych zarodków CRISPR pozwól im rozwijać się przez co najmniej sześć godzin po zapłodnieniu. Aby wyekstrahować genomowe DNA z co najmniej 10 matczynych haploidalnych zarodków CRISPR, umieść pojedynczy haploidalny zarodek w indywidualnym dołku probówki paskowej do PCR, usuń nadmiar pożywki E3 ze studzienki i dodaj 50 mikrolitrów 50-milimolowego wodorotlenku sodu.

Inkubuj zarodki przez 20 minut w temperaturze 95 stopni Celsjusza i schładzaj je do czterech stopni Celsjusza. Następnie dodaj pięć mikrolitrów jednego molowego kwasu solnego tris-solnego o pH 7,5 i wiruj przez pięć do 10 sekund. Aby zidentyfikować, które miejsca przewodnika zawierają indele, zaprojektuj startery sekwencjonowania w celu amplifikacji fragmentu DNA, w tym wszystkich czterech miejsc docelowych CRISPR/Cas9.

Ustaw dwie reakcje PCR o pojemności 25 mikrolitrów na zarodek, używając pięciu mikrolitrów przygotowanego genomowego DNA i starterów sekwencjonowania. Po zakończeniu PCR oczyść i skoncentruj dwie próbki za pomocą zestawu do oczyszczania i koncentratora DNA, a następnie prześlij fragment DNA do sekwencjonowania Sangera, używając starterów sekwencjonowania do przodu i do tyłu. Wszystkie przewodnikowe RNA powinny być zgrupowane razem, z minimalnymi lub żadnymi nakładającymi się regionami między przewodnikowymi RNA podczas generowania matczynego CRISPR.

Jeśli powstały indele, należy zaobserwować rozmaz w próbkach wstrzykniętych na żelu agarozowym, ale nie w niewstrzykniętej kontroli. Metoda matczynego CRISPR może być stosowana do fenokopii znanych mutacji efektu matczynego, takich jak pstrokacizna, TMI i aura. Aby zidentyfikować zmiany genetyczne, które przyczyniają się do matczynego fenotypu CRISPR, plemniki poddane działaniu promieniowania UV i zapłodnienie in vitro są łączone w celu stworzenia matczynych haploidów CRISPR.

Stworzenie haploidalnego pozwala na sekwencjonowanie allelu matczynego przez Sangera i identyfikację matczynych indeli CRISPR. Podczas identyfikacji fenotypu efektu matczynego ważne jest, aby móc go zaobserwować u wielu samic F0, ponieważ zwiększa to prawdopodobieństwo, że fenotyp jest spowodowany utratą funkcji, a nie efektami niezamierzonymi lub niespecyficznymi. Po zidentyfikowaniu fenotypu wpływu matki, zarodki matki CRISPR mogą być wykorzystane do zbadania wpływu na różne aspekty wczesnej embriogenezy, takie jak szkielet zatokowy lub segregacja DNA.

Pozwala to naukowcom zrozumieć molekularną przyczynę fenotypu. Metoda ta bezpośrednio testuje funkcję nieznanych genów ulegających ekspresji matczynej w jednym pokoleniu, poszerzając nasze zrozumienie procesów zachodzących we wczesnej embriogenezie.