Name: Interferencja RNA u kleszczy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-20T19:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Poznaj metodę interferencji RNA u kleszczy poprzez wstrzyknięcie dwuniciowego RNA. Technika ta umożliwia badanie funkcji genów i biologii kleszczy w kontekście zwalczania chorób odkleszczowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy członkom naszych laboratoriów za owocne dyskusje i pomoc techniczną. Prezentacja wideo została wsparta przez Associate Dean for Research oraz Department of Veterinary Pathobiology w Center for Veterinary Health Sciences na Oklahoma State University. Badania były finansowane przez Ministerio de Ciencia e Innovación, Hiszpania (projekt BFU2008-01244/BMC), wewnętrzny projekt CSIC PA1002451 dla JF, Walter R. Sitlington Endowed Chair for Food Animal Research dla KMK, grant CVHS 2009 RAC, OAES Animal Health Funds oraz USDA, National Research Initiative Competitive Grant, nr 2007-04613.

1. Generowanie dsRNA.
<ol>
<li>Zsyntetyzować startery oligonukleotydowe zawierające sekwencje promotora T7 do transkrypcji in vitro i syntezy dsRNA (na przykład dla subolesiny Dermacentor variabilis należy użyć starterów oligonukleotydowych D8AAT75: 
5'-TAATACGACTCACTATAGGGTACTGACTGGGATCCCCTGCACAGT-3' oraz D8DVT73: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGTACTCGAGCTTGGTGGAAAGGACG-3').</li>
<li>Amplifikować gen docelowy metodą RT-PCR, wykorzystując 10 pmol każdego startera oligonukleotydowego oraz 1-10 ng całkowitego RNA kleszcza.</li>
<li>Oczyścić produkt PCR.</li>
<li>Zsyntetyzować dsRNA, wykorzystując 8 μL oczyszczonego produktu PCR.</li>
<li>Oznaczyć ilość dsRNA za pomocą spektrometrii.</li>
</ol>
2. Iniekcja dsRNA do kleszczy.
2.1. Przygotowanie kleszczy do iniekcji.
<ol>
<li>W pierwszej kolejności kleszcze należy przemyć w serii roztworów, wstrząsając nimi w jednorazowej probówce wirówkowej o pojemności 50 mL, a następnie odlewać roztwór przez gęste sito z drucianej siatki umieszczone nad probówką, aby zatrzymać kleszcze. Kolejność roztworów do mycia kleszczy to: woda z kranu, 3% nadtlenek wodoru, dwa płukania wodą destylowaną, 70% etanol i kolejne dwa płukania wodą destylowaną.</li>
<li>Kleszcze należy osuszyć, odciskając je w ręczniki papierowe.</li>
<li>Kleszcze należy odliczyć w grupy od 20 do 50 osobników, w zależności od eksperymentu, a następnie umieścić kleszcze z każdej grupy w plastikowym kubku o pojemności 1,25 oz z dopasowaną szczelną pokrywką i oznaczyć numerem grupy eksperymentalnej.</li>
</ol>
2.2. Zespół do iniekcji kleszczy.
Zespół RNAi składa się z trzech osób: (1) jednej osoby, która umieszcza każdego kleszcza na dwustronnej taśmie klejącej przytwierdzonej do arkusza czerwonego wosku dentystycznego, (2) jednej osoby, która wykonuje iniekcje kleszczom oraz (3) jednej osoby, która monitoruje kleszcze po iniekcji, aktywuje je poprzez wydmuchiwanie CO2 i przenosi żywe kleszcze do kubeczków oznaczonych numerem grupy eksperymentalnej. Wszyscy członkowie zespołu muszą nosić jednorazowe rękawiczki.
2.3. Umieszczenie kleszczy do iniekcji.
<ol>
<li>Chwyć kleszcza za pomocą precyzyjnej pęsety Dumont i umieść go stroną brzuszną do góry na dwustronnej taśmie klejącej przymocowanej do arkusza czerwonego wosku dentystycznego o wymiarach 3" x 6". Kleszcze należy rozmieścić blisko siebie w grupach po 5 osobników.</li>
<li>Na aparat gębowy wszystkich 5 kleszczy nałóż niewielki pasek taśmy maskującej, aby dodatkowo je unieruchomić, pozostawiając jednocześnie większość ciała odsłoniętą, co umożliwi osobie wykonującej iniekcję obserwację procesu wstrzykiwania (Rycina 1).</li>
</ol>
2.4. Iniekcja kleszczy.
<ol>
<li>Kleszcze zostaną wstrzyknięte w dolnym prawym kwadrancie brzusznej powierzchni egzoszkieletu.</li>
<li>W pierwszej kolejności należy wykonać otwór w egzoszkielecie, używając strzykawki insulinowej Monoject z igłą o rozmiarze 29 G i długości ½" (Rycina 2a).</li>
<li>Niezwłocznie wstrzyknąć kleszczom 0,2-0.5 μL roztworu dsRNA (5 x 1010 - 5 x 1011 cząsteczek na μL) przy użyciu specjalnie wykonanej strzykawki Hamiltona z igłą o długości 1 cala i średnicy 33 G z 45° ścięty czubek (rycina 2b). Igłę należy wprowadzić głęboko do jam ciała kleszcza, aby zapewnić prawidłowe umieszczenie i utrzymanie się dsRNA. Część płynu prawdopodobnie wypłynie z miejsca wstrzyknięcia (rycina 2c). Należy uważać, aby nie wstrzyknąć zbyt dużej ilości płynu, co spowodowałoby utratę hemolimfy i mogłoby doprowadzić do śmierci kleszcza.</li>
<li>Oczyść strzykawkę Hamiltona po zakończeniu iniekcji w każdej grupie eksperymentalnej, przed użyciem jej w kolejnej grupie. Napełnij strzykawkę z zlewki zawierającej 3% nadtlenek wodoru, a następnie wypuść zawartość do pojemnika na odpady; powtórz tę czynność 15 razy. Napełnij strzykawkę z zlewki zawierającej sterylną wodę, a następnie wypuść zawartość do pojemnika na odpady; powtórz tę czynność 15 razy. Należy uważać, aby nie wygiąć tłoka strzykawki Hamiltona, ponieważ w przypadku wygięcia tłok nie będzie poruszał się płynnie i nie będzie reagował na delikatny nacisk wymagany podczas iniekcji kleszczy.</li>
</ol>
2.5. Postępowe postępowanie z kleszczami po iniekcji.
<ol>
<li>Natychmiasty odbierz wstrzykniętego kleszcza z dwustronnej taśmy klejącej za pomocą pęsety precyzyjnej i umieść go w plastikowym pojemniku regeneracyjnym (o wymiarach około 6" x 6", oklejonym z brzegów taśmą maskującą, aby zapobiec ucieczce kleszczy). Kleszcze będą przez chwilę nieaktywne po wstrzyknięciu, ale wkrótce powinny zacząć pełzać po naczyniu.</li>
<li>Bezpośrednio po umieszczeniu kleszczy w pojemniku regeneracyjnym podaj im CO2, aby pomóc im się aktywować. Gdy kleszcze zaczną pełzać i staną się aktywne, rana po wstrzyknięciu szybko się zagoi i prawdopodobnie przeżyją.</li>
<li>Odlicz kleszcze zgodnie z liczbą przewidzianą dla każdej grupy eksperymentalnej i umieść je w opisanym plastikowym kubku z dopasowaną, szczelną pokrywką. Należy wstrzyknąć kleszcze zastępcze w miejsce tych, które padły przed wstrzyknięciem kolejnej grupy eksperymentalnej.</li>
</ol>
2.6. Unieruchomienie kleszcza.
<ol>
<li>Umieścić kleszcze w komorze wilgotnościowej (fotoperiod 12h światła: 12h ciemności, temperatura 22-25°C i wilgotność względna 95%) i utrzymywać przez 1 dobę.</li>
<li>Umieścić kleszcze w komórkach do karmienia kleszczy, po jednej na grupę eksperymentalną, przyklejonych do owcy, i pozwolić im żerować wraz z równą liczbą nieoinfekowanych kleszczy samców lub samic (zależnie od tego, która płeć nie została poddana iniekcji). Zebrać i zważyć samice kleszczy, które najadły się do sytości, te, które zostały usunięte z owcy po 10 dniach żerowania lub w momencie, gdy samice z grupy kontrolnej oddzieliły się od żywiciela.</li>
<li>Umieścić kleszcze w kartonikach i przechowywać w komorze wilgotnościowej do zakończenia składania jaj. Ocenić proces składania jaj poprzez zważenie masy jaj produkowanych przez wszystkie kleszcze w grupie.</li>
</ol>
2.7. Analiza fenotypu kleszczy po RNAi.
<ol>
<li>Oceń fenotyp kleszczy po żerowaniu, określając liczbę przeżyłych osobników, masę kleszczy, liczbę złożonych jaj oraz ich żywotność. W zależności od badanego genu i celów badania można przeprowadzić również inne analizy.</li>
</ol>
3. Analiza potwierdzająca wyciszenie genu za pomocą RT-PCR.
<ol>
<li>Po karmieniu wypreparować gruczoły ślinowe i jelita z poszczególnych kleszczy z grup kontrolnej (wstrzykniętej roztworem kontrolnym) oraz grupy wstrzykniętej dsRNA.</li>
<li>Wyizolować całkowity RNA z poszczególnych próbek tkanek.</li>
<li>Przeprowadzić analizę transkryptów genów docelowych w poszczególnych tkankach za pomocą real-time RT-PCR i znormalizować poziomy RNA względem 16S rRNA kleszcza, stosując metodę genNorm (metoda ddCT zaimplementowana w Bio-Rad iQ5 Standard Edition, wersja 2.0).</li>
<li>Na koniec reakcji przeprowadzić analizę krzywych dysocjacji, aby upewnić się, że powstał tylko jeden amplikon i że amplikony denaturują spójnie w tym samym zakresie temperatur dla każdej próbki.</li>
<li>Porównać poziomy mRNA (znormalizowane wartości Ct) pomiędzy kleszczami z grupy kontrolnej a kleszczami wstrzykniętymi dsRNA, stosując test t-Studenta (P=0,05).</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki:
Opisany tutaj protokół był stosowany w naszym laboratorium do RNAi u wielu różnych gatunków kleszczy z rodziny Ixodidae (tabela 1). Ilość wstrzykiwanego do kleszczy dsRNA zależy od wielkości kleszcza; większe gatunki kleszczy mogą przyjąć większą objętość. Kleszcze kontrolne negatywne powinny zostać wstrzyknięte z niepowiązanym dsRNA. Jako kontrole pozytywne można wykorzystać kilka rodzajów dsRNA, takich jak subolesyna14-19,22-25,27-32,34 oraz beta-aktyna20,21. Należy pamiętać, że ważne jest przemycie strzykawki pomiędzy zabiegami, aby uniknąć zmieszania roztworów dsRNA. Jeśli protokół zostanie wykonany prawidłowo, śmiertelność wynikająca z procedury wstrzykiwania po 24 godzinach powinna być niższa niż 5%. Typowy fenotyp po wyciszeniu genu u kleszczy przedstawiono na rysunku 3, ukazując grupę kleszczy wstrzykniętych z pulami dsRNA w celu przesiewania ochronnych antygenów kleszczy.
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Gatunki kleszczy</td>
 <td>wstrzyknięte dsRNA</td>
 <td>Bibliografia</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ixodes scapularis</td>
 <td>biblioteka cDNA, subolesyna, aktyna, nukleotydaza, NF-kB, akiryna</td>
 <td>21, 22, 29, 30</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dermacentor variabilis</td>
 <td>subolesyna, GST, ubikwityna, vATPase, selenoproteiny M i W2a, białko podobne do komórek macierzystych/progenitorowych układu krwiotwórczego, aktyna, podjednostka proteasomu 26S, ferrytyna 1, warysyna, akiryna </td>
 <td>15, 19, 22, 24, 26, 30-32</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dermacentor marginatus</td>
 <td>subolezyna</td>
 <td>22</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>*Amblyomma americanum*</td>
 <td>biblioteka cDNA, subolesyna, akiryna</td>
 <td>17, 22, 30</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>*Amblyomma hebraeum*</td>
 <td>subolesyna, voraksyna</td>
 <td>28</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Rhipicephalus sanguineus</td>
 <td>Rs86, subolesyna</td>
 <td>22, 23</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Rhipicephalus microplus</td>
 <td>GST, ubikwityna, selenoproteina, Bm86, Bm91, subolesyna, GI, GIII, EF1a, flagelliform silk protein, von Willebrand 
 czynnik </td>
 <td>16, 18, 25, 27</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Rhipicephalus annulatus</td>
 <td>ubikwityna, subolesyna, EF1a, GIII</td>
 <td>16</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
Tabela 1. Gatunki kleszczy, w których zastosowano protokół RNAi.
 <img src="/files/ftp_upload/2474/2474fig1.jpg" alt="Kleszcze żerujące na skórze, zbliżenie, badanie z zakresu parazytologii, analiza zachowania żerowania krwiopijnego." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Umieszczenie kleszczy stroną brzuszną do góry na dwustronnej taśmie klejącej przyklejonej do arkusza czerwonego wosku dentystycznego. Kleszcze są rozmieszczone w grupach po 5 osobników, po czym nad aparatem gębowym umieszcza się mały pasek taśmy maskującej, aby dodatkowo unieruchomić kleszcze, umożliwiając jednocześnie osobie wykonującej iniekcję obserwację ciała kleszcza podczas wstrzykiwania.
 <img src="/files/ftp_upload/2474/2474fig2.jpg" alt="Sekwencja procesu usuwania kleszcza, schemat przedstawiający kroki z użyciem pęsety w celu bezpiecznej ekstrakcji." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Procedura iniekcji obejmuje (a) przebicie dolnego prawego kwadrantu egzoszkieletu kleszcza za pomocą strzykawki insulinowej z igłą G 29 w celu stworzenia miejsca wstrzyknięcia, (b) natychmiastową iniekcję dsRNA w tym miejscu za pomocą strzykawki Hamiltona z igłą G 33, co (c) najprawdopodobniej spowoduje niewielki wyciek hemolimfy/płynów kleszcza.
 <img src="/files/ftp_upload/2474/2474fig3.jpg" alt="Test leczenia infestacji kleszczami na skórze zwierzęcia z kontrolami negatywną i pozytywną dla skuteczności subolesyny." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Panel sześciu grup kleszczy, w których zastosowano RNAi w celu przesiewania antygenów ochronnych kleszczy u Amblyomma americanum. Zmiany fenotypowe u kleszczy są widoczne w porównaniu z pozytywną kontrolą RNAi dla subolesyny oraz negatywną kontrolą z niespokrewnionym dsRNA. W tym doświadczeniu statystycznie przeanalizowano wpływ RNAi na śmiertelność, masę ciała i składanie jaj w każdej z grup kleszczy.

<ol><li>de la Fuente, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview%3A+Ticks+as+vectors+of+pathogens+that+cause+disease+in+humans+and+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Biosci%22%5BJournal%5D)">Overview: Ticks as vectors of pathogens that cause disease in humans and animals.</a> Front. Biosci. 13, 6938-6946 (2008).</li>
<li>Peter, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mosquito+control-Lessons+from+the+past%2C+solutions+for+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Vet.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">mosquito control-Lessons from the past, solutions for the future.</a> Vet. Parasitol. 132, 205-215 (2005).</li>
<li>Barker, S. C., Murrell, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematics+and+evolution+of+ticks+with+a+list+of+valid+genus+and+species+names%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol%22%5BJournal%5D)">Systematics and evolution of ticks with a list of valid genus and species names.</a> Parasitol. 129, S15-S36 (2004).</li>
<li>Willadsen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tick+control%3A+Thoughts+on+a+research+agenda%5BTitle%5D)+AND+%22Vet.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Tick control: Thoughts on a research agenda.</a> Vet. Parasitol. 138, 161-168 (2006).</li>
<li>de la Fuente, J., Kocan, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+development+of+vaccines+for+control+of+ixodid+tick+species%5BTitle%5D)+AND+%22Parasite+Immunol%22%5BJournal%5D)">Strategies for development of vaccines for control of ixodid tick species.</a> Parasite Immunol. 28, 275-283 (2006).</li>
<li>Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391, 806-811 (1998).</li>
<li>Cerutti, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference%3A+traveling+in+the+cell+and+gaining+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">RNA interference: traveling in the cell and gaining functions.</a> Trends Genet. 19, 39-46 (2003).</li>
<li>Kavi, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+silencing+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">RNA silencing in Drosophila.</a> FEBS Lett. 579, 5940-5949 (2005).</li>
<li>Mello, C. C., Conte, D. J. r <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revealing+the+world+of+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Revealing the world of RNA interference.</a> Nature. 431, 338-342 (2004).</li>
<li>Zhou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+and+potential+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Top.+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">RNA interference and potential applications.</a> Curr. Top. Med. Chem. 6, 901-911 (2006).</li>
<li>Ramakrishnan, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+RNA+interference+in+tick+salivary+gland+research%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Tech%22%5BJournal%5D)">Application of RNA interference in tick salivary gland research.</a> J. Biomol. Tech. 16, 297-305 (2005).</li>
<li>Aljamali, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference%3A+applicability+in+tick+research%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Appl.+Acarol%22%5BJournal%5D)">RNA interference: applicability in tick research.</a> Exp. Appl. Acarol. 28, 89-96 (2002).</li>
<li>Aljamali, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+in+ticks%3A+a+study+using+histamine+binding+protein+dsRNA+in+the+female+tick+Amblyomma+americanum%5BTitle%5D)+AND+%22Insect.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">RNA interference in ticks: a study using histamine binding protein dsRNA in the female tick Amblyomma americanum.</a> Insect. Mol. Biol. 12, 299-305 (2003).</li>
<li>de la Fuente, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+for+the+study+and+genetic+manipulation+of+ticks%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Parasitol%22%5BJournal%5D)">RNA interference for the study and genetic manipulation of ticks.</a> Trends Parasitol. 23, 427-433 (2007).</li>
<li>de la Fuente, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genomic+studies+of+tick+cells+in+response+to+infection+with+the+cattle+pathogen%2C+Anaplasma+marginale%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">Functional genomic studies of tick cells in response to infection with the cattle pathogen, Anaplasma marginale.</a> Genomics. 90, 712-722 (2007).</li>
<li>AlmazäN, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+Rhipicephalus+%28Boophilus%29+microplus+candidate+protective+antigens+for+the+control+of+cattle+tick+infestations%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol.+Res%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of Rhipicephalus (Boophilus) microplus candidate protective antigens for the control of cattle tick infestations.</a> Parasitol. Res. 106, 471-479 (2010).</li>
<li>de la Fuente, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+protective+antigens+by+RNA+interference+for+control+of+the+lone+star+tick%2C+Amblyomma+americanum%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Identification of protective antigens by RNA interference for control of the lone star tick, Amblyomma americanum.</a> Vaccine. 28, 1786-1795 (2010).</li>
<li>Zivkovic, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+genes+in+salivary+glands+of+male+Rhipicephalus+%28Boophilus%29+microplus+in+response+to+infection+with+Anaplasma+marginale%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Differential expression of genes in salivary glands of male Rhipicephalus (Boophilus) microplus in response to infection with Anaplasma marginale.</a> BMC Genomics. 11, 186-186 (2010).</li>
<li>de la Fuente, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduction+of+tick+infections+with+Anaplasma+marginale+and+A.+phagocytophilum+by+targeting+the+tick+protective+antigen+subolesin%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol.+Res%22%5BJournal%5D)">Reduction of tick infections with Anaplasma marginale and A. phagocytophilum by targeting the tick protective antigen subolesin.</a> Parasitol. Res. 100, 85-91 (2006).</li>
<li>Narasimhan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+Ixodes+scapularis+anticoagulation+by+using+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Disruption of Ixodes scapularis anticoagulation by using RNA interference.</a> Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 101, 1141-1146 (2004).</li>
<li>de la Fuente, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+screening+in+ticks+for+identification+of+protective+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol.+Res%22%5BJournal%5D)">RNA interference screening in ticks for identification of protective antigens.</a> Parasitol. Res. 96, 137-141 (2005).</li>
<li>de la Fuente, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tick+protective+antigen%2C+4D8%2C+is+a+conserved+protein+involved+in+modulation+of+tick+blood+ingestion+and+reproduction%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">The tick protective antigen, 4D8, is a conserved protein involved in modulation of tick blood ingestion and reproduction.</a> Vaccine. 24, 4082-4095 (2006).</li>
<li>de la Fuente, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+effect+of+silencing+the+expression+of+tick+protective+antigens+4D8+and+Rs86+in+Rhipicephalus+sanguineus+by+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol.+Res%22%5BJournal%5D)">Synergistic effect of silencing the expression of tick protective antigens 4D8 and Rs86 in Rhipicephalus sanguineus by RNA interference.</a> Parasitol. Res. 99, 108-113 (2006).</li>
<li>de la Fuente, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autocidal+control+of+ticks+by+silencing+of+a+single+gene+by+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Autocidal control of ticks by silencing of a single gene by RNA interference.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 344, 332-338 (2006).</li>
<li>Nijhof, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bm86%2C+Bm91+and+subolesin%2C+in+the+silencing+of+the+tick+protective+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Bm86, Bm91 and subolesin, in the silencing of the tick protective antigens.</a> Int. J. Parasitol. 37, 653-662 (2007).</li>
<li>Kocan, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+of+the+defensin%2C+varisin%2C+in+male+Dermacentor+variabilis+by+RNA+interference+results+in+reduced+Anaplasma+marginale+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Appl.+Acarol%22%5BJournal%5D)">Silencing of the defensin, varisin, in male Dermacentor variabilis by RNA interference results in reduced Anaplasma marginale infections.</a> Exp. Appl. Acarol. 46, 17-28 (2008).</li>
<li>de la Fuente, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+of+the+role+of+tick+subolesin+in+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Evidence of the role of tick subolesin in gene expression.</a> BMC Genomics. 9, 372-372 (2008).</li>
<li>Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+RNA+interference+of+the+subolesin+and+voraxin+genes+in+male+Amblyomma+hebraeum+%28Acari%3A+Ixodidae%29+on+female+engorgement+and+oviposition%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Appl.+Acarol%22%5BJournal%5D)">The impact of RNA interference of the subolesin and voraxin genes in male Amblyomma hebraeum (Acari: Ixodidae) on female engorgement and oviposition.</a> Exp. Appl. Acarol. 47, 71-86 (2009).</li>
<li>Galindo, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tick+subolesin+is+an+ortholog+of+the+akirins+described+in+insects+and+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Comp.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Tick subolesin is an ortholog of the akirins described in insects and vertebrates.</a> Dev. Comp. Immunol. 33, 612-617 (2009).</li>
<li>Canales, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conservation+and+immunogenicity+of+the+mosquito+ortholog+of+the+tick+protective+antigen%2C+subolesin%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol.+Res%22%5BJournal%5D)">Conservation and immunogenicity of the mosquito ortholog of the tick protective antigen, subolesin.</a> Parasitol. Res. 105, 97-111 (2009).</li>
<li>Kocan, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+of+genes+involved+in+Anaplasma+marginale-tick+interactions+affects+the+pathogen+developmental+cycle+in+Dermacentor+variabilis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Silencing of genes involved in Anaplasma marginale-tick interactions affects the pathogen developmental cycle in Dermacentor variabilis.</a> BMC Dev. Biol. 9, 42-42 (2009).</li>
<li>Zivkovic, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subolesin+expression+in+response+to+pathogen+infection+in+ticks%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Immunol%22%5BJournal%5D)">Subolesin expression in response to pathogen infection in ticks.</a> BMC Immunol. 11, 7-7 (2010).</li>
<li>Karim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genomics+tool%3A+gene+silencing+in+Ixodes+scapularis+eggs+and+nymphs+by+electroporated+dsRNA%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Functional genomics tool: gene silencing in Ixodes scapularis eggs and nymphs by electroporated dsRNA.</a> BMC Biotechnol. 10, 1-1 (2010).</li>
<li>Kocan, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transovarial+silencing+of+the+subolesin+gene+in+three-host+ixodid+tick+species+after+injection+of+replete+females+with+subolesin+dsRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol.+Res%22%5BJournal%5D)">Transovarial silencing of the subolesin gene in three-host ixodid tick species after injection of replete females with subolesin dsRNA.</a> Parasitol. Res. 100, 1411-1415 (2007).</li>
<li>de la Fuente, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+tick-pathogen+interface+for+novel+control+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Biosci%22%5BJournal%5D)">Targeting the tick-pathogen interface for novel control strategies.</a> Front. Biosci. 13, 6947-6956 (2008).</li>
<li>Kurscheid, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+of+a+tick+RNAi+pathway+by+comparative+genomics+and+reverse+genetics+screen+of+targets+with+known+loss-of-function+phenotypes+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Evidence of a tick RNAi pathway by comparative genomics and reverse genetics screen of targets with known loss-of-function phenotypes in Drosophila.</a> BMC Mol. Biol. 10, 26-26 (2009).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Choć opisano inne metody RNAi u kleszczy14, 33, iniekcja dsRNA opisana w niniejszym materiale jest najszerzej stosowana zarówno u kleszczy nieżywionych (Tabela 1), jak i żywionych16,25,34. Wykazano, że RNAi jest cennym narzędziem do badania funkcji genów kleszczy, charakterystyki interfejsu kleszcz-patogen oraz przesiewania i charakterystyki ochronnych antygenów kleszczy14,35. W szczególności RNAi stało się najcenniejszym narzędziem do analiz funkcjonalnych u kleszczy35.
Pod względem metodologicznym RNAi prawdopodobnie ewoluuje w kierunku bardziej wydajnych metod, które mogą umożliwić wyciszanie genów u dużej liczby osobników. Mechanizm RNAi indukowanego przez dsRNA u kleszczy powinien zostać dopracowany, aby przyczynić się do lepszego zrozumienia i wykorzystania tego podejścia genetycznego u tego gatunku35,36. Zakres efektów poza celowych (off-target) RNAi u kleszczy jest również istotną kwestią, która wymaga pełnego wyjaśnienia14,27. Wreszcie, RNAi najprawdopodobniej wniesie znaczący wkład w badania nad regulacją genów i biologią systemową kleszczy oraz nad interakcjami na styku kleszcz-patogen, co może mieć wpływ na opracowanie szczepionek służących do zwalczania infestacji kleszczami oraz transmisji patogenów przenoszonych przez kleszcze.

<table><tbody><tr><td>System do RT-PCR Access</td><td>Promega</td><td>A1250</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oczyszczania PCR Purelink</td><td>Invitrogen</td><td>K3100-02</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw Megascript RNAi</td><td>Ambion</td><td>AM1626M</td><td></td></tr><tr><td>Czerwony wosk dentystyczny</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72674</td><td></td></tr><tr><td>Kubki plastikowe z pokrywkami, 1,25 oz</td><td>Solo Cup Company, Urbana Ill.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pęseta precyzyjna</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>Różne</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka insulinowa</td><td>Monoject</td><td></td><td>Wyposażona w igłę &amp;#189;&quot;, 29 G</td></tr><tr><td>Strzykawka Hamiltona</td><td>Hamilton</td><td>701SN,33/.375&amp;#8221;/45DGR</td><td>Wykonana na zamówienie</td></tr><tr><td>TriReagent</td><td>Sigma</td><td>93289</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw iScript One-Step RT-PCR z SYBR Green</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8892</td><td></td></tr><tr><td>System do detekcji PCR w czasie rzeczywistym</td><td>Bio-Rad</td><td>Kilka</td><td>Prosimy odnieść się do &lt;a href=&quot;http://www.bio-rad.com/">http://www.bio-rad.com/&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

interferencja rna u kleszczy

RNA Interference in Ticks

Kleszcze są obligatoryjnymi hematofagicznymi ektopasożytami zwierząt dzikich i domowych oraz ludzi i po komarach są uważane za drugie najważniejsze na świecie wektory chorób ludzkich1 oraz za najważniejsze wektory wpływające na przemysł hodowli bydła na całym świecie2. Kleszcze są klasyfikowane w podklasie Acari, rzędzie Parasitiformes, podrzędzie Ixodida i występują na całym świecie, od regionów arktycznych po tropikalne3. Pomimo wysiłków w celu opanowania infestacji kleszczami, ektopasożyty te pozostają poważnym problemem dla zdrowia ludzi i zwierząt4,5.
Interferencja RNA (RNAi)6 to oparta na kwasach nukleinowych metoda genetyki odwrotnej, która polega na zaburzaniu ekspresji genów w celu określenia funkcji genu lub jego wpływu na ścieżkę metaboliczną. Małe interferujące RNA (siRNA) są cząsteczkami efektorowymi ścieżki RNAi, która jest inicjowana przez dwuniciowe RNA (dsRNA) i prowadzi do silnej, swoistej sekwencyjnie degradacji cytoplazmatycznych mRNA zawierających tę samą sekwencję co wyzwalacz dsRNA7-9. Mechanizmy posttranskrypcyjnego wyciszania genów inicjowane przez dsRNA odkryto u wszystkich dotychczas badanych eukariotów, a RNAi zostało szybko rozwinięte w wielu organizmach jako narzędzie do badań z zakresu genomiki funkcjonalnej oraz innych zastosowań10.
RNAi stała się najszerzej stosowaną techniką wyciszania genów u kleszczy i innych organizmów, w których alternatywne podejścia do manipulacji genetycznych są niedostępne lub niewiarygodne5,11. Charakterystyka genetyczna kleszczy była ograniczona aż do niedawnego zastosowania RNAi12,13. W krótkim czasie, odkąd RNAi jest dostępna, okazała się ona cennym narzędziem do badania funkcji genów kleszczy, charakterystyki interfejsu kleszcz-patogen oraz przesiewania i charakterystyki ochronnych antygenów kleszczy14. W niniejszym opracowaniu opisano metodę RNAi poprzez wstrzykiwanie dsRNA do niekarmionych kleszczy. Prawdopodobne jest, że wiedza uzyskana dzięki temu podejściu eksperymentalnemu w znacznym stopniu przyczyni się do zrozumienia podstawowych systemów biologicznych i opracowania szczepionek w celu zwalczania infestacji kleszczami oraz zapobiegania transmisji patogenów przenoszonych przez kleszcze15-19.

Opisano metodę interferencji RNA (RNAi) poprzez wstrzykiwanie dsRNA do niekarmionych kleszczy. RNAi jest najszerzej stosowaną techniką wyciszania genów u kleszczy, w przypadku których zastosowanie innych metod manipulacji genetycznych było ograniczone.

Interferencja RNA u kleszczy

Kleszcze są obligatoryjnymi hematofagicznymi ektopasożytami zwierząt dzikich i hodowlanych oraz ludzi i po komarach uważane są za najważniejsze na świecie wektory...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zaprezentowanie techniki interferencji RNA u kleszczy poprzez wstrzyknięcie. Osiąga się to najpierw poprzez syntezę dwuniciowego RNA genu lub genów będących przedmiotem zainteresowania. Następnie RNA jest wstrzykiwane kleszczom, po czym są one przetrzymywane w komorze wilgotnościowej przez 24 godziny.Po tym okresie przetrzymania kleszcze są dopuszczane do żerowania na zwierzęciu, np. owcy. Następnie określane są parametry żerowania, takie jak masa ciała, linienie i pozycja jaj oraz poziom ekspresji docelowego genu lub genów zainteresowania za pomocą real-time R-T-P-C-R. W rezultacie można uzyskać dane wykazujące wpływ wyciszenia wybranych genów na biologię kleszczy poprzez ocenę parametrów biologicznych kleszczy oraz ekspresji genów za pomocą real-time R-T-P-C-R.Nasz zespół pracuje z kleszczami, starając się scharakteryzować zdarzenia molekularne na styku kleszcz-patogen, aby wykorzystać te podstawowe informacje do opracowania metod kontroli infestacji kleszczami oraz transmisji patogenów na ludzi i zwierzęta. Interferencja RNA stała się niezbędnym narzędziem w tych badaniach, ponieważ jest to jedyna dostępna metoda manipulacji genetycznej kleszczy. Funkcja wielu genów kleszczy pozostaje nieznana.Interferencja RNA pozwala nam zdefiniować rolę genów kleszczy oraz ekspresję genów w wielu aspektach biologii kleszczy, w tym w procesach kojarzenia, rozmnażania, żerowania, trawienia, funkcjonowania gruczołów ślinowych oraz w kompetencji kleszczy jako wektorów w transmisji patogenów. Procedurę zaprezentuje zespół ds. interferencji RNA u kleszczy z naszego laboratorium: dr Ed Lewin, student studiów doktoranckich, Busby oraz ja. Aby wygenerować dwuniciowy RNA, należy najpierw zsyntetyzować startery oligonukleotydowe zawierające sekwencje promotora T7 do transkrypcji RNA in vitro.Na przykład, derma center vari lesin. Należy użyć starterów oligonukleotydowych D eight A a T 75 oraz D eight DVT 73 przedstawionych tutaj. Amplifikację genu docelowego należy przeprowadzić metodą RT-PCR, wykorzystując 10 pmoli każdego startera oligonukleotydowego oraz od 1 do 10 ng całkowitego RNA kleszcza.Następnie należy oczyścić produkt PCR. Potem użyj 8 µL lub około 100 ng w celu syntezy dwuniciowego RNA. Aby przygotować kleszcze do iniekcji, najpierw przemyj je w następującej serii roztworów: woda z kranu, 3% nadtlenek wodoru, dwukrotnie woda destylowana, 70% etanol oraz dwa końcowe płukania wodą destylowaną.Każde płukanie należy przeprowadzić w jednorazowej probówce wirówkowej o pojemności 50 mililitrów poprzez wstrząsanie. Następnie roztwór należy odlać przez drobne sito z drucianej siatki. Kleszcze należy osuszyć na ręcznikach papierowych, a następnie podzielić na grupy po 20 do 50 osobników, w zależności od planowanego eksperymentu.Każdą grupę umieść w plastikowym kubku o pojemności 1,25 uncji z dopasowaną pokrywką i oznacz każdy kubek zgodnie z grupą eksperymentalną. Następnie sformuj zespół RNAi składający się z trzech osób, które przeprowadzą proces iniekcji. Pierwsza osoba umieszcza każdego kleszcza na dwustronnej taśmie klejącej przytwierdzonej do arkusza czerwonego wosku dentystycznego o wymiarach trzy na sześć cali.Druga osoba wykonuje iniekcje kleszczom, a trzecia monitoruje je po wstrzyknięciu, wydmuchuje dwutlenek węgla na kleszcze w celu ich aktywacji, a następnie zlicza i przenosi żywe osobniki do kubków oznaczonych numerem grupy eksperymentalnej. Wszyscy członkowie zespołu muszą nosić jednorazowe rękawiczki. Aby rozpocząć proces iniekcji kleszczy, należy chwycić kleszcza za pomocą precyzyjnej pęsety Dumonta i umieścić go stroną brzuszną do góry na dwustronnej taśmie klejącej przytwierdzonej do arkusza czerwonego wosku dentystycznego. Kleszcze należy ułożyć blisko siebie w grupach po pięć osobników. Na części gębowe wszystkich pięciu kleszczy należy nałożyć wąski pasek taśmy maskującej.Aby dodatkowo je unieruchomić, pozostaw większość ciała odsłoniętą, tak aby osoba wykonująca wstrzykiwanie mogła obserwować proces iniekcji. W celu wstrzyknięcia preparatu kleszczowi, wykonaj otwór w dolnym prawym kwadrancie brzusznej powierzchni egzoszkieletu, używając jednorazowej strzykawki insulinowej z igłą 29G o długości pół cala. Następnie niezwłocznie wstrzyknij kleszczom od 0,2 do 0,5 µl roztworu dwuniciowego RNA, używając specjalnie wykonanej strzykawki Hamiltona z igłą 33G o długości jednego cala i ściętym pod kątem 45 stopni wierzchołkiem; wprowadź igłę głęboko do wnętrza kleszcza, aby zapewnić prawidłowe umieszczenie i zatrzymanie dwuniciowego RNA.Mimo że po wstrzyknięciu następuje wyciek płynu, głębokie wprowadzenie igły zapewni odłożenie do jam ciała kleszcza wystarczającej ilości dwuniciowego RNA, aby wywołać wyciszenie genu; należy jednak uważać, aby nie wstrzyknąć zbyt dużej objętości, co spowodowałoby utratę hemolimfy i śmierć kleszcza. Natychmiast po wstrzyknięciu należy zebrać kleszcze z dwustronnej taśmy klejącej za pomocą precyzyjnej pęsety i umieścić je w plastikowym pojemniku regeneracyjnym.Kleszcze pozostaną przez krótką chwilę nieaktywne po wstrzyknięciu, lecz wkrótce powinny zacząć pełzać po szalce. Aktywuj kleszcze, wydmuchując na nie dwutlenek węgla. Gdy kleszcze zaczną pełzać i staną się aktywne, rana po wstrzyknięciu szybko się zagoi i najprawdopodobniej przeżyją.Należy policzyć kleszcze w każdej grupie eksperymentalnej i umieścić każdą grupę w oznakowanym plastikowym kubku z dopasowaną szczelnie pokrywką. Kleszcze, które padną w aktualnej grupie, należy zastąpić przed wykonaniem iniekcji w następnej grupie eksperymentalnej. Strzykawkę Hamiltona należy oczyścić przed iniekcją w następnej grupie eksperymentalnej poprzez napełnienie, a następnie opróżnienie jej świeżym 3% nadtlenkiem wodoru.15 razy, a następnie 15 razy płukać sterylną wodą. Należy uważać, aby nie wygiąć tłoka strzykawki Hamiltona, w przeciwnym razie tłok nie będzie poruszał się płynnie i nie będzie reagował na delikatny nacisk wymagany podczas wstrzykiwania kleszczom. Po wstrzyknięciu umieścić kleszcze na jeden dzień w komorze z pojemnikiem wypełnionym wodą i siarczanem potasu, co zapewni im wysoką wilgotność.Następnie umieść poszczególne kleszcze w komórkach do żywienia przyklejonych do owcy i pozwól im żywić się wraz z równą liczbą niezatrzymanych kleszczy samców lub samic, w zależności od tego, która płeć nie została poddana zastrzykowi. Zbierz i zważ kleszcze samice z komórki do żywienia po zakończeniu żywienia, co trwa około 10 dni, lub w momencie, gdy samice kontrolne opadły z żywiciela. Inkubuj każdą grupę kleszczy w komorze wilgotnościowej aż do zakończenia składania jaj. Oceń składanie jaj dla każdej grupy poprzez zważenie masy jaj wyprodukowanych przez wszystkie kleszcze w grupie, aby ocenić fenotyp kleszczy po żywieniu.Określ liczbę kleszczy, które przeżyły, a następnie oblicz masę kleszczy, pozycję jaj oraz ich płodność. W zależności od wybranego genu i celów badania można przeprowadzić dodatkowe analizy w celu potwierdzenia wyciszenia genu za pomocą R-T-P-C-R. Po karmieniu wypreparuj gruczoły ślinowe i jelita z poszczególnych kleszczy z grup kontrolnej (wstrzykniętej) oraz grupy wstrzykniętej dwuniciowym RNA, a następnie wyizoluj całkowite RNA z poszczególnych próbek tkanek.Przeanalizuj transkrypty genu docelowego w poszczególnych tkankach metodą real-time R-T-P-C-R i znormalizuj poziomy RNA względem 16 s RNA rybosomalnego kleszcza. Stosując metodę gen norm, przeprowadź analizę krzywych dysocjacji na końcu reakcji, aby upewnić się, że powstał tylko jeden amplikon i że amplikony denaturują konsekwentnie w tym samym zakresie temperatur dla każdej próbki, a następnie porównaj znormalizowane wartości CT dla poziomów mRNA między kleszczami wstrzykniętymi kontrolnie a kleszczami wstrzykniętymi dwuniciowym RNA, wykorzystując test t Studenta.Protokół opisany w niniejszym opracowaniu był stosowany w naszym laboratorium do RNAi u wielu różnych gatunków kleszczy. Ilość dwuniciowego RNA wstrzykiwanego do kleszczy zależy od wielkości osobnika. Większe gatunki kleszczy mogą przyjąć większą objętość.Bibliografia znajduje się w towarzyszącej pisemnej części protokołu. Jeśli protokół zostanie przeprowadzony prawidłowo, śmiertelność wynikająca z procedury iniekcji po 24 godzinach powinna być niższa niż 5%. Przedstawiono tutaj typowy fenotyp po wyciszeniu genów u kleszczy, w którym panel kleszczy został poddany iniekcji pulami dwuniciowego RNA wykorzystanego do przesiewania ochronnych antygenów kleszczy.W kleszczach badanych za pomocą mikroskopii świetlnej można zaobserwować degenerację komórkową w tkankach. Zmiany fenotypowe mogą być również powiązane z utratą funkcji. Na przykład, RNAI genu SUBIN prowadzi do powstania sterylnych samców, które nie są w stanie skutecznie kopulować z samicami po zastosowaniu interferencji RNA u kleszczy.Do określenia wpływu wyciszania genów na ekspresję genów i białek oraz na biologię kleszczy można wykorzystać inne metody, w tym R-T-P-C-R w czasie rzeczywistym, mikroskopię świetlną, elektronową lub konfokalną, genomikę lub proteomikę. Interferencję RNA można przeprowadzić również w kulturach komórek kleszczy, co stanowi metodę in vitro do badania interakcji między komórkami kleszczy a patogenami.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Interferencja RNA w kleszczach

Badania nad boreliozą często wymagają uzyskania kleszczy zakażonych patogenem Borrelia burgdorferi, co jest procesem trwającym zazwyczaj kilka tygodni. W niniejszym materiale prezentujemy procedurę zakażania kleszczy metodą mikroiniekcji, którą można przeprowadzić w ciągu kilku godzin. Przedstawiamy również metodę immunofluorescencji do lokalizacji in situ B. burgdorferi wewnątrz kleszczy.

Metody szybkiego przenoszenia i lokalizacji patogenów choroby z Lyme w jelicie kleszcza

Borelioza jest najczęściej zgłaszaną chorobą przenoszoną przez wektory w Ameryce Północnej.  Czynnik sprawczy, Borrelia burgdorferi, jest bakterią krętkową przenoszoną przez kleszcze Ixodid.  Przenoszenie i wykrywanie infekcji w modelach zwierzęcych jest optymalizowane przez zastosowanie żywienia kleszczy, które opisujemy tutaj.

Karmienie kleszczy zwierząt w celu przeniesienia i ksenodiagnozy w badaniach nad boreliozą

Produkcja zdrowych kleszczy hodowanych w laboratorium jest niezbędna do badań nad biologią kleszczy i interakcjami kleszcz-patogen. Tutaj pokazujemy prosty protokół karmienia niedojrzałych kleszczy, który jest opłacalny i mniej stresujący dla myszy.

Hodowla Ixodes scapularis, kleszcza czarnonogiego: karmienie niedojrzałych stadiów na myszach

Zagnieżdżony PCR to czuła, specyficzna i prosta technika, którą można zastosować do ekstraktów DNA kleszczy w celu zbadania Borrelia burgdorferi, czynnika wywołującego boreliozę. Początkowy eksperyment PCR wykorzystuje startery specyficzne dla genu do generowania długich amplikonów, które następnie stają się matrycami do późniejszej reakcji przy użyciu wewnętrznych starterów.

Wykrywanie krętka boreliozy, Borrelia burgdorferi, u kleszczy za pomocą zagnieżdżonego PCR

Tutaj prezentujemy protokół sekwencjonowania nowej generacji dla sekwencjonowania 16S rRNA, który umożliwia identyfikację i charakterystykę społeczności mikrobiologicznych w wektorach. Metoda ta obejmuje ekstrakcję DNA, amplifikację i kodowanie kreskowe próbek za pomocą PCR, sekwencjonowanie na komórce przepływowej oraz bioinformatykę w celu dopasowania danych sekwencji do informacji filogenetycznej.

Charakterystyka mikrobiomu kleszczowego za pomocą sekwencjonowania amplikonów 16S rRNA nowej generacji

W tym badaniu, system żywienia dla nimfalnych i larwalnych stadiów kleszcza twardego został opracowany za pomocą kapsułki dołączonej do myszy laboratoryjnej. Kapsuła do karmienia jest wykonana z elastycznych materiałów i pozostaje mocno przymocowana do myszy przez co najmniej tydzień i umożliwia wygodne monitorowanie żerowania kleszczy.

Oparty na kapsułkach model do infestacji niedojrzałych stadiów kleszczy twardych na myszach laboratoryjnych

Obecny protokół opisuje izolację mikroRNA z gruczołów ślinowych kleszczy i oczyszczonych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych. Jest to uniwersalna procedura, która łączy w sobie powszechnie używane odczynniki i materiały eksploatacyjne. Metoda pozwala również na użycie niewielkiej liczby kleszczy, co skutkuje wysokiej jakości mikroRNA, które można łatwo zsekwencjonować.

Izolacja mikroRNA z kultur gruczołów ślinowych ex vivo kleszczy i pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

Obecny protokół opisuje metodę wstrzykiwania zarodków kleszczy. Wstrzyknięcie zarodka jest preferowaną techniką manipulacji genetycznej w celu wytworzenia linii transgenicznych.

Technika iniekcji zarodka do edycji genów u kleszcza czarnonogiego, Ixodes scapularis

Przedstawiona tutaj jest metoda nawożenia kleszczy krwią in vitro za pomocą systemu sztucznej błony, aby umożliwić częściowe lub pełne zagęszczenie różnych etapów życia kleszcza.

Karmienie sztuczną membraną kleszcza dla Ixodes scapularis

Ten artykuł przedstawia metodologię wystawiania ludzi na działanie larw Ixodes scapularis do badań klinicznych. Technika jest stosunkowo prosta, tolerowana przez ochotników biorących udział w badaniu i może być modyfikowana w zależności od potrzeb eksperymentalnych. Takie badania z udziałem ludzi muszą być prowadzone zgodnie z protokołami badań klinicznych zatwierdzonymi przez właściwe organy regulacyjne.

Model eksperymentalnego narażenia ludzi na larwy kleszczy Ixodes scapularis

Przedstawiamy protokół polegający na zbieraniu śliny, hemolimfy, gruczołów ślinowych oraz śródjelita po sekcji pojedynczego karmionego kleszcza, aby badać specyficzną lokalizację patogenów przenoszonych przez kleszcze w tkankach i pogłębić zrozumienie kompetencji wektorów oraz interakcji patogen-mikrobiom.

Ekstrakcja śliny, hemolimfy, gruczołów ślinowych i jelita środkowego od pojedynczych kleszczy (Acari: Ixodidae)

Poznaj metodę interferencji RNA u kleszczy poprzez wstrzyknięcie dwuniciowego RNA. Technika ta umożliwia badanie funkcji genów i biologii kleszczy w kontekście zwalczania chorób odkleszczowych.

Interferencja RNA u kleszczy

Przeglądaj więcej filmów