Interferencja RNA u kleszczy

Ogólnym celem tej procedury jest zademonstrowanie techniki interferencji RNA u kleszczy przez wstrzyknięcie. Osiąga się to poprzez pierwszą syntezę dwuniciowego RNA genu lub genów będących przedmiotem zainteresowania. RNA jest następnie wstrzykiwane kleszczom, po czym są one przetrzymywane w komorze wilgotnościowej przez 24 godziny.

Po tym okresie utrzymywania kleszcze mogą żywić się zwierzęciem, takim jak owca, w końcu kleszcz. Określa się parametry żywienia, takie jak waga, linienie i pozycja komórek jajowych oraz ekspresję docelowego genu lub genów będących przedmiotem zainteresowania przez R-T-P-C-R w czasie rzeczywistym. Ostatecznie można uzyskać wyniki, które pokazują wpływ wyciszania docelowych genów na biologię kleszczy poprzez ocenę parametrów biologicznych kleszczy i ekspresji genów za pomocą R-T-P-C-R w czasie rzeczywistym.

Nasza grupa pracuje z kleszczami, próbując scharakteryzować zdarzenia molekularne na styku patogenu kleszcza, aby wykorzystać te podstawowe informacje do opracowania metod kontroli inwazji kleszczy i przenoszenia patogenów na ludzi i zwierzęta. Interferencja RNA stała się niezbędnym narzędziem w tych badaniach, ponieważ jest to jedyna dostępna metoda manipulacji genetycznej kleszczy. Funkcja wielu genów kleszczy jest nieznana.

Interferencja RNA pozwala nam określić rolę genów kleszczy i ekspresję genów w wielu aspektach biologii kleszczy, w tym w kryciu, rozmnażaniu, karmieniu, trawieniu, funkcji gruczołów ślinowych oraz kompetencji wektora kleszczy do przenoszenia patogenów. Procedurę zademonstruje zespół zajmujący się interferencją RNA kleszcza z naszego laboratorium, dr Ed Lewin, doktorant oraz Busby i ja. Aby wygenerować dwuniciowy RNA, najpierw zsyntetyzuj startery oligonukleotydowe zawierające sekwencje promotorowe T siedem do transkrypcji RNA in vitro.

Na przykład derma center vari lesin. Użyj pokazanych tutaj starterów oligonukleotydowych D osiem A a T 75 i D osiem DVT 73. Amplifikuj gen docelowy przez R-T-P-C-R przy użyciu 10 pikomoli każdego startera oligonukleotydowego i od jednego do 10 nanogramów całkowitego RNA kleszcza.

Następnie oczyść produkt PCR. Następnie użyj ośmiu mikrolitrów lub około 100 nanogramów do syntezy dwuniciowego RNA. Aby przygotować kleszcze do wstrzyknięcia, najpierw umyj je w następującej serii roztworów, wodzie z kranu 3% wodzie destylowanej nadtlenku wodoru dwa razy, 70% etanolu i dwóch końcowych płukaniach wodą destylowaną.

Wykonuj każde mycie w jednorazowej probówce wirówkowej o pojemności 50 mililitrów, wstrząsając. Następnie dekantacja roztworu przez sito z drutu o drobnych oczkach. Zablokuj kleszcze do wyschnięcia na ręcznikach papierowych, a następnie podziel je na grupy od 20 do 50 w zależności od eksperymentu.

Umieść każdą grupę w plastikowym kubku o pojemności 1,25 uncji ze szczelnie dopasowaną pokrywką i oznacz każdy kubek grupą eksperymentalną. Następnie zbierz zespół RNAi składający się z trzech osób, który przeprowadzi proces iniekcji. Pierwsza osoba umieszcza każdy haczyk na podwójnej taśmie klejącej przymocowanej do arkusza czerwonego wosku dentystycznego o wymiarach trzy na sześć cali.

Druga osoba wstrzykuje kleszcze, a trzecia monitoruje kleszcze po wstrzyknięciu, wdycha dwutlenek węgla na kleszcze, aby je aktywować, a następnie liczy i przenosi żywe kleszcze do kubków oznaczonych numerem grupy eksperymentalnej. Wszyscy członkowie zespołu muszą nosić jednorazowe rękawiczki Aby rozpocząć proces wstrzykiwania kleszcza, złap kleszcza za pomocą drobnych kleszczy Dumont i umieść go brzuszną stroną do góry na podwójnej taśmie klejącej przymocowanej do arkusza czerwonego wosku dentystycznego ściśle Umieść kleszcze w grupach po pięć. Umieść mały pasek taśmy maskującej na częściach gębowych wszystkich pięciu kleszczy.

Aby jeszcze bardziej je unieruchomić, pozostaw większość ciała odsłoniętą, aby proces wstrzykiwania mógł być obserwowany przez wstrzykiwacz kleszczy. Aby wstrzyknąć kleszcza, przebij otwór w prawym dolnym kwadrancie brzusznej powierzchni egzoszkieletu za pomocą strzykawki insulinowej z mono wyrzutem wyposażonej w igłę o rozmiarze 29 i średnicy pół cala. Następnie natychmiast wstrzyknij kleszczom od 0,2 do 0,5 mikrolitra dwuniciowego roztworu RNA za pomocą specjalnie wykonanej strzykawki Hamiltona i jednocalowej igły o rozmiarze 33 z punktem ściętym pod kątem 45 stopni, umieść igłę dobrze w jamie kleszcza, aby zapewnić umieszczenie i utrzymanie dwuniciowego RNA.

Nawet jeśli płyn jest uwalniany po wstrzyknięciu, głębokie umieszczenie igły do wstrzykiwania zapewni, że wystarczająca ilość dwuniciowego RNA zostanie zdeponowana w jamie kleszcza, aby spowodować wyciszenie genów, należy zachować ostrożność, aby nie przesadzić. Wstrzyknąć kleszcze, co spowoduje utratę hemolimfy i śmierć kleszcza. Natychmiast po wstrzyknięciu kleszczy należy je podnieść z podwójnej taśmy klejącej za pomocą cienkich kleszczyków i umieścić w plastikowym pojemniku do odzysku.

Kleszcze pozostaną na krótko nieaktywne po wstrzyknięciu, ale wkrótce powinny zacząć pełzać po naczyniu. Aktywuj kleszcze, wdychając na nie dwutlenek węgla. Gdy kleszcze pełzają i są aktywne, rana po wstrzyknięciu szybko się zagoi i najprawdopodobniej przeżyją.

Policz kleszcze w każdej grupie eksperymentalnej i umieść każdą grupę w oznaczonym plastikowym kubku z ciasno dopasowaną pokrywką. Zastąp wszystkie znaczniki, które obumarły w bieżącej grupie przed wstrzyknięciem następnej grupy eksperymentalnej. Oczyść strzykawkę Hamiltona przed wstrzyknięciem następnej grupy eksperymentalnej, napełniając, a następnie usuwając strzykawkę świeżym 3% nadtlenkiem wodoru.

15 razy, a następnie 15 prań sterylną wodą. Należy uważać, aby nie zgiąć tłoka strzykawki Hamiltona, w przeciwnym razie tłok nie będzie się poruszał płynnie i nie będzie reagował na delikatny dotyk wymagany do wstrzyknięcia kleszcza. Po wstrzyknięciu kleszcze należy umieścić w komorze z pojemnikiem wypełnionym wodą i siarczanem potasu, który utrzymuje wysoką wilgotność i je przez jeden dzień.

Następnie umieść pojedyncze kleszcze w komórkach żerujących na kleszczach przyklejonych do owcy i pozwól im karmić się równą liczbą wstrzykniętych kleszczy męskich lub żeńskich, w zależności od płci, która nie została wstrzyknięta. Zbieraj i machaj samicami kleszczy z komórki żerowania po zakończeniu karmienia przez około 10 dni lub gdy samice kontrolne odpadną, gospodarz wysiaduje każdą grupę kleszczy w komorze wilgotnościowej, aż do zakończenia pozycji komórek jajowych. Oceń pozycję komórek jajowych według grup, ważąc masę jaj wytwarzaną przez wszystkie kleszcze w grupie, aby ocenić fenotyp kleszcza po karmieniu.

Określ liczbę kleszczy, które przeżyły i oblicz wagę kleszcza, a także pozycję komórek jajowych i płodność jaj. W zależności od docelowego genu i celów badania, można przeprowadzić inne analizy w celu potwierdzenia wyciszenia genów przez R-T-P-C-R. Po karmieniu należy wypreparować gruczoły ślinowe i jelita z pojedynczych kleszczy z grup kontrolnych, którym wstrzyknięto i wstrzyknięto dwuniciowe RNA, a następnie wyekstrahować całkowite RNA z poszczególnych próbek tkanek.

Analizuj docelowe transkrypty genów w poszczególnych tkankach za pomocą R-T-P-C-R w czasie rzeczywistym i normalizuj poziomy RNA względem rybosomalnego RNA ticka 16. Korzystając z metody norm genetycznych, uruchom krzywe dysocjacji na końcu reakcji, aby upewnić się, że powstaje tylko jeden amplikon i że amplikony konsekwentnie denaturują się w tym samym zakresie temperatur dla każdej próbki, porównaj znormalizowane wartości CT dla poziomów mRNA między kontrolą wstrzykniętą a dwuniciową. RNA wstrzyknięto kleszcze za pomocą testu T studenta.

Opisany tutaj protokół został zastosowany w naszym laboratorium do wykrywania RNAi u wielu różnych gatunków kleszczy egzotycznych. Ilość dwuniciowego RNA wstrzykniętego do kleszczy zmienia się w zależności od wielkości kleszcza. Większe gatunki kleszczy mogą pomieścić większą objętość.

Odniesienia znajdują się w dołączonej pisemnej części protokołu. Jeśli protokół zostanie wykonany prawidłowo, po 24 godzinach należy uzyskać mniej niż 5% śmiertelności po zabiegu wstrzyknięcia. Typowy fenotyp po knockucie genu u kleszczy jest pokazany tutaj, gdzie panelowi kleszczy wstrzyknięto pule dwuniciowego RNA, które zostały użyte do badania przesiewowego antygenów ochronnych przed kleszczami.

U kleszczy badanych za pomocą mikroskopii świetlnej można zaobserwować zwyrodnienie komórek w tkankach kleszcza. Zmianom fenotypowym może również towarzyszyć utrata funkcji. Na przykład RNAI SUBIN powoduje bezpłodne samce, które nie mogą pomyślnie kojarzyć się z samicami po interferencji RNA i kleszczach.

Inne metody mogą być wykorzystane do określenia wpływu wyciszania genów na ekspresję genów i białek oraz na biologię kleszczy, w tym R-T-P-C-R w czasie rzeczywistym, mikroskopia świetlna elektronowa lub konfokalna. Genomika lub proteomika. Interferencja RNA może być również przeprowadzana w hodowlach komórek kleszczowych i zapewnia metodę in vitro do badania interakcji patogenów komórek kleszczowych.