Name: Protokoły mutagenezy i selekcji funkcjonalnej dla ukierunkowanej ewolucji białek w E. coli (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-16T11:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: Poznaj protokół mutagenezy i selekcji funkcjonalnej dla ukierunkowanej ewolucji białek w Escherichia coli. Ta metoda umożliwia tworzenie bibliotek mutantów i identyfikację korzystnych mutacji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Niniejsza praca została sfinansowana z funduszy grantu K08 nr CA116429-04 przyznanego MC oraz z grantu fundacji Conquer Cancer Now (CONCERN) nr 8501

<ol><li>Camps, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+ColE1-like+plasmid+replication+for+recombinant+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Recent+Pat+DNA+Gene+Seq%22%5BJournal%5D)">Modulation of ColE1-like plasmid replication for recombinant gene expression.</a> Recent Pat DNA Gene Seq. 4, 58-73 (2010).</li>
<li>Itoh, T., Tomizawa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+of+replication+of+plasmid+ColE1+DNA+by+RNA+polymerase%2C+ribonuclease+H%2C+and+DNA+polymerase+I%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Symp+Quant+Biol%22%5BJournal%5D)">Initiation of replication of plasmid ColE1 DNA by RNA polymerase, ribonuclease H, and DNA polymerase I.</a> Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 43 Pt 1, 409-417 (1979).</li>
<li>Polisky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ColE1+replication+control+circuitry%3A+sense+from+antisense%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">ColE1 replication control circuitry: sense from antisense.</a> Cell. 55, 929-932 (1988).</li>
<li>Camps, M., Naukkarinen, J., Johnson, B. P., Loeb, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+evolution+in+Escherichia+coli+using+a+highly+error-prone+DNA+polymerase+I%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Targeted gene evolution in Escherichia coli using a highly error-prone DNA polymerase I.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 9727-9732 (2003).</li>
<li>Shinkai, A., Loeb, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+mutagenesis+by+Escherichia+coli+DNA+polymerase+I.+Ile%28709%29+in+motif+A+functions+in+base+selection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">In vivo mutagenesis by Escherichia coli DNA polymerase I. Ile(709) in motif A functions in base selection.</a> J Biol Chem. 276, 46759-46764 (2001).</li>
<li>Uyemura, D., Lehman, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+characterization+of+mutant+forms+of+DNA+polymerase+I+from+Escherichia+coli.+I.+The+polA12+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Biochemical characterization of mutant forms of DNA polymerase I from Escherichia coli. I. The polA12 mutation.</a> J Biol Chem. 251, 4078-4084 (1976).</li>
<li>Sedgwick, B., Robins, P., Lindahl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+removal+of+alkylation+damage+from+DNA+by+AlkB+and+related+DNA+dioxygenases%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Direct removal of alkylation damage from DNA by AlkB and related DNA dioxygenases.</a> Methods Enzymol. 408, 108-120 (2006).</li>
<li>Aharoni, A., Gaidukov, L., Khersonsky, O., Mc, Q. G. S., Roodveldt, C., Tawfik, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%27evolvability%27+of+promiscuous+protein+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">The 'evolvability' of promiscuous protein functions.</a> Nat Genet. 37, 73-76 (2005).</li>
<li>Elena, S. F., Lenski, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+experiments+with+microorganisms%3A+the+dynamics+and+genetic+bases+of+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Evolution experiments with microorganisms: the dynamics and genetic bases of adaptation.</a> Nat Rev Genet. 4, 457-469 (2003).</li>
<li>Itoh, T., Tomizawa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FoFormation+of+an+RNA+primer+for+initiation+of+replication+of+ColE1+DNA+by+ribonuclease+H%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">FoFormation of an RNA primer for initiation of replication of ColE1 DNA by ribonuclease H.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 77, 2450-2454 (1980).</li>
<li>Bryan, S. K., Moses, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sufficiency+of+the+Klenow+fragment+for+survival+of+polC%28Ts%29+pcbA1+Escherichia+coli+at+43+degrees%5BTitle%5D)+AND+%22C.+J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Sufficiency of the Klenow fragment for survival of polC(Ts) pcbA1 Escherichia coli at 43 degrees.</a> C. J Bacteriol. 170, 456-458 (1988).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Niniejszy artykuł przedstawia protokół mutagenezy umożliwiający generowanie dużych, losowych bibliotek mutantów bez konieczności klonowania lub stosowania PCR. Metoda ta opiera się na replikacji z błędami plazmidu kodującego sekwencję budzącą zainteresowanie. Teoretycznie mutacje powinny być w dużej mierze ograniczone do regionu 100-300 bp znajdującego się bezpośrednio w dół nurtu przełącznika RNA/DNA, co odpowiada rozmiarowi produktu pośredniego nici liderowej wytwarzanego przez Pol I 2,10. Stwierdzono, że w warunkach przedstawionych w niniejszym protokole mutacje Pol I występują w całym plazmidzie, choć ich częstotliwość maleje wraz ze wzrostem odległości od ori plazmidu (Rysunek 3). Wynik ten sugeruje, że przejście lub „przełączenie” z Pol I na Pol III podczas replikacji plazmidu ColE1 jest znacznie bardziej stopniowe, niż zgłaszano wcześniej, przynajmniej w naszych warunkach eksperymentalnych 2, co jest zgodne z wcześniejszymi badaniami sugerującymi funkcjonalną redundancję między Pol I a Pol III 11.
Nasz pierwotny protokół opisywał mutogenezę w kulturach płynnych (4). Protokół ten daje 0,41 mutacji/kb dla d&lt;1000, tj. w obrębie 1000 bp sąsiadujących z przełącznikiem RNA/DNA (Tabela 1). Hipersaturacja poprzez pozostawienie kultury płynnej w inkubatorze z wytrząsaniem przez 3 dni bez dodawania świeżych mediów zwiększa częstotliwość mutacji do 0,70 mutacji/kb, ale skutkuje bardzo niską wydajnością plazmidów (mniej niż 1% w porównaniu z dniem 1.; dane nie pokazano) (Tabela 1). Przedstawiamy tutaj uproszczony protokół oparty na bezpośrednim wysiewaniu transformacji docelowego plazmidu na stały agar w temperaturze 37 °C (Rycina 1). Procedura ta generuje najwyższą częstotliwość mutacji/cykl mutogenezy (0,92 mutacji/kb dla d&lt;1000) i znacznie ułatwia iterację. Zmiana warunków hodowli na media stałe wpływa również na spektrum mutacji (Tabela 2). Mutogeneza z bezpośrednim wysiewem zmniejsza wyraźną asymetrię między substytucjami komplementarnych par zasad obserwowaną w kulturze płynnej (porównaj C→T vs. G→A oraz A→G vs. T→C). Z drugiej strony, bezpośredni wysiew spowodował powstanie większej liczby indeli (wzrost z mniej niż 0,5% do 4%) i 3-krotne zmniejszenie liczby mutacji A→G, co doprowadziło do nadreprezentacji mutacji G/C (74%). Ogólnie uważamy, że większa prostota i zwiększona wydajność przedstawionego tutaj protokołu z bezpośrednim wysiewem przeważają nad korzyściami wynikającymi z nieco bardziej zrównoważonego spektrum mutacji uzyskiwanego w mutogenezie płynnej.
W obrębie plazmidu docelowego mutacje generowane naszą metodą nie są ograniczone wyłącznie do pożądanej sekwencji docelowej. Jednak ewolucja nowych aktywności biochemicznych powinna zależeć od mutacji w obrębie genu docelowego, ponieważ stanowią one zmianę jakościową, a nie ilościową. Zatem połączenie naszej mutagenezy plazmidowej z przesiewaniem mutantów na płytkach z gradientem wykorzystuje atuty naszego systemu (rozległe biblioteki oraz możliwość selekcji) w celu ewolucji nowych właściwości biochemicznych. Inne zastosowania randomowej mutagenezy, takie jak optymalizacja istniejących aktywności enzymatycznych lub randomizacja specyficznych obszarów genu, wymagają klonowania po przeprowadzeniu randomowej mutagenezy. W takim przypadku posiadanie biblioteki w plazmidzie, w przeciwieństwie do produktu amplifikacji PCR, zwiększa efektywność klonowania poprzez ułatwienie amplifikacji i restrykcji.
Podsumowując, prezentujemy prosty protokół tworzenia losowej biblioteki mutantów dla danego genu docelowego, który wyróżnia się prostotą oraz różnorodnością generowanych bibliotek. Pokazujemy, w jaki sposób metoda ta może być powiązana z selekcjami funkcjonalnymi w celu efektywnej ewolucji nowych aktywności biochemicznych. Ponadto nasze biblioteki generowane in vivo mogą być łatwo klonowane, co umożliwia mutogenezę specyficzną dla miejsca lub optymalizację istniejących aktywności.

<table><tbody><tr><td>karbenycylina</td><td>Cellgro</td><td>46100R6</td><td>stężenie końcowe 0,1 mg/ml</td></tr><tr><td>tetracyklina</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP7640</td><td>stężenie końcowe 0,05 mg/ml</td></tr><tr><td>chloramphenikol</td><td>Genlantis</td><td>M120100</td><td>stężenie końcowe 0,03 mg/ml</td></tr><tr><td>Agar LB Miller</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1425</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka LB Miller</td><td>Difco Laboratories</td><td>244620</td><td></td></tr><tr><td>Miękki agar</td><td>Difco Laboratories</td><td>214580</td><td>Przygotowano we własnym zakresie</td></tr><tr><td>Pomarańcz akrydynowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A38401-1</td><td></td></tr><tr><td>emulsja przeciwpieniąca Antifoam B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5757</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Acros Organics</td><td>332030025</td><td></td></tr><tr><td>szalka kwadratowa 100x100x15mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>0875711A</td><td></td></tr><tr><td>szalka Petriego 100 mm </td><td>Fisher Scientific</td><td>0875712A</td><td></td></tr><tr><td>Przedmiot szkiełko przedmiotowe 25x75x1mm</td><td>Złota Pieczęć</td><td>3048</td><td></td></tr><tr><td>Elektroporator 2510</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elektroporator 2510</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>probówki z 2-milimetrową przerwą</td><td>Molecular BioProducts</td><td>5520</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw Zippy mini prep</td><td>Zymo Research Corp.</td><td>D4020</td><td></td></tr></tbody></table>

protokoły mutagenezy i selekcji funkcjonalnej dla ewolucji sterowanej białek w e. coli

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

Efektywne generowanie różnorodności genetycznej stanowi nieocenione narzędzie molekularne, które może być wykorzystywane do znakowania syntezy DNA, tworzenia unikalnych sygnatur molekularnych lub ewolucji białek w warunkach laboratoryjnych. Przedstawiamy tutaj protokół umożliwiający generowanie dużych (>1011) bibliotek mutantów dla danej sekwencji docelowej. Metoda ta opiera się na replikacji plazmidu ColE1 kodującego pożądaną sekwencję przez wariant polimerazy DNA I o niskiej wierności (LF-Pol I). Plazmid docelowy jest transformowany do szczepu mutatora E. coli i wysiewany na podłoża stałe, co pozwala uzyskać od 0,2 do 1 mutacji/kb, w zależności od lokalizacji genu docelowego. Wyższe częstotliwości mutacji osiąga się poprzez iteracyjne powtarzanie tego procesu mutagenezy. W porównaniu z alternatywnymi metodami mutagenezy, nasz protokół wyróżnia się prostotą, ponieważ nie wymaga klonowania ani PCR. W związku z tym nasza metoda jest idealna do znakowania mutacyjnego plazmidów lub innych matryc Pol I, a także do eksploracji dużych obszarów przestrzeni sekwencyjnej w celu ewolucji aktywności nieobecnych w oryginalnym celu. Ścisłą kontrolę przestrzenną, którą oferuje PCR lub metody oparte na randomizowanych oligonukleotydach, można również osiągnąć poprzez późniejsze klonowanie specyficznych fragmentów biblioteki. Dostarczamy tutaj protokoły pokazujące, jak stworzyć losową bibliotekę mutantów oraz jak wprowadzić selekcję opartą na lekach w E. coli w celu zidentyfikowania mutantów wykazujących nowe aktywności biochemiczne.

W niniejszym materiale przedstawiamy prosty protokół tworzenia losowej biblioteki mutantów dla określonej sekwencji docelowej. Pokazujemy, w jaki sposób metoda ta, realizowana in vivo w Escherichia coli, może być łączona z selekcją funkcjonalną w celu wyewoluowania nowych aktywności enzymatycznych.

Protokoły mutagenezy i selekcji funkcjonalnej dla ewolucji sterowanej białek w E. coli

Efektywne generowanie różnorodności genetycznej stanowi nieocenione narzędzie molekularne, które może być wykorzystywane do znakowania syntezy DNA, tworzenia unikalnych cząsteczek...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest stworzenie losowej biblioteki mutantów dla danej docelowej sekwencji DNA oraz szybka identyfikacja i charakterystyka mutantów przy użyciu półilościowej selekcji funkcjonalnej. Osiąga się to poprzez transformację szczepu mutatora plazmidem z jednym punktem początku replikacji zawierającym sekwencję docelową. Po wysianiu i inkubowaniu komórek przez noc, są one zbierane, a docelowy plazmid jest izolowany w celu uzyskania biblioteki mutantów; następnie biblioteka mutantów jest transformowana do szczepu odczytującego, aby scharakteryzować mutacje w drugiej części protokołu. Przygotowuje się płytkę z gradientem wzrostu, a kultury bakteryjne szczepu odczytującego nanosi się na oddzielną szalkę Petriego zawierającą miękkie agar.Ostatnim krokiem procedury jest przeniesienie tych kultur bakteryjnych na gradient za pomocą stemplowania. W efekcie można uzyskać wyniki wykazujące zmiany w profilu fenotypowym danej sekwencji docelowej poprzez różnice w tempie wzrostu na gradiencie leku. Niniejszy film prezentuje metodę ukierunkowanej ewolucji białek w e coli.Proces ten naśladuje naturalną ewolucję poprzez generowanie losowych bibliotek składników odżywczych, po której następuje selekcja ograniczająca tę różnorodność. W ten sposób zwiększa on naszą zdolność do generowania nowych aktywności biochemicznych do celów przemysłowych lub biomedycznych. Procedura ta składa się z dwóch etapów: generowania losowej biblioteki mutantów oraz selekcji funkcjonalnej w celu uzyskania mutacji prowadzących do zwiększenia funkcji; procedurę tę zaprezentuje Jennifer Allen, technik z mojego laboratorium.Przed rozpoczęciem niniejszego protokołu przygotowano elektrokompetentne komórki JS 200 wykazujące ekspresję wariantu o niskiej wierności polimerazy DNA I (low fidelity pol I), zgodnie z opisem w protokole pisemnym. Komórki te zawierają allel pol I wrażliwy na temperaturę, dzięki czemu w temperaturze 37 °C dominuje aktywność niskiej wierności pol I. Skonstruowano plazmid docelowy zawierający replikon coli 1 z sekwencją docelową sklonowaną w sąsiedztwie miejsca rozpoczęcia replikacji. Niska wierność pol I inicjuje replikację plazmidu coli 1, wprowadzając tym samym mutacje w celu zapoczątkowania procesu mutagenezy.Połącz 40 µL komórek elektrokompetentnych oraz od 30 do 250 ng docelowego plazmidowego DNA w szczelinie o szerokości 2 mm. Przeprowadź elektroporację mieszaniny w elektroporatorze przy napięciu 1800 V. Sprawdź stałą czasową (TC), aby zapewnić jednorodne warunki elektroporacji dla każdej próbki.W idealnym przypadku TC wynosi od pięciu do sześciu milisekund. Pozostaw mieszaninę DNA komórek do regeneracji w 1 ml pożywki LB przez 40 minut w temperaturze 37 °C przy wytrząsaniu z prędkością 250 RPM. Przygotuj 100 mm płytkę Petri z agarem LV, uprzednio ogrzaną do 37 °C i zawierającą odpowiednie antybiotyki do selekcji obu plazmidów; wysiej zregenerowane komórki w odpowiednim rozcieńczeniu, aby uzyskać stężenie bliskie trawnikowi, co definiuje się jako wyraźną, lecz nieliczalną liczbę kolonii, jak pokazano w tym przykładzie.Po inkubacji nocnej zebrać kolonie bakterii z szalek Petri do bulionu LB. Wyizolować plazmidowe DNA z zebranych komórek; otrzymane plazmidowe DNA stanowi losową bibliotekę mutantów.Przeprowadź trawienie restrykcyjne, przecinając bibliotekę plazmidów enzymem restrykcyjnym, który linearyzuje zarówno plazmid docelowy, jak i plazmid pole. Przeprowadź analityczną elektroforezę w żelu agarozowym dla wyizolowanego DNA plazmidowego, aby potwierdzić jego jakość i ilość. Po zweryfikowaniu plazmidów poddaj jeden mikrogram biblioteki trawieniu enzymem restrykcyjnym, który linearyzuje plazmid pole, ale nie przecina plazmidu docelowego.Po zakończeniu trawienia restrykcyjnego oczyść bibliotekę za pomocą zestawu do oczyszczania DNA. Na koniec przeprowadź transformację oczyszczonej biblioteki do szczepu odczytowego w celu charakterystyki mutacji. Aby rozpocząć przygotowanie gradientu, wyznacz 10 ścieżek rozmieszczonych równomiernie wzdłuż jednej krawędzi dna kwadratowej płytki Petriego.Umieść płytkę pod kątem tak, aby dolna zaznaczona krawędź była uniesiona o siedem milimetrów. Wlej do płytki pod kątem 25 mililitrów ciepłego agaru lb, dobrze wymieszanego z odpowiednim stężeniem czynnika selekcyjnego. Jest to dolna warstwa gradientu.Upewnij się, że agar LB pokrywa płytkę Petriego w taki sposób, aby w podniesionym, zaznaczonym końcu płytki znajdowała się warstwa agaru LB o grubości około jednego milimetra, a w części obniżonej około ośmiu milimetrów. Przykryj płytkę pokrywką KU w celu wentylacji i pozostaw agar do zastygnięcia na 10 do 15 minut. Po stwardnieniu dolnej warstwy agaru LB przenieś płytkę na płaską powierzchnię.Następnie wlej 25 mililitrów ciepłego agar lb bez czynnika selekcyjnego, aby pokryć pierwszą powierzchnię agaru, upewniając się, że cała warstwa spodnia została przykryta. Przykryj płytkę pokrywką KU w celu wentylacji, a następnie pozostaw agar do zastygnięcia na 10 do 15 minut przed wykonaniem transferu bakterii metodą stemplowania. Najpierw przygotuj kultury bakteryjne szczepu odczytowego i rozcieńcz je tak, aby miały identyczną gęstość komórkową przy gęstości optycznej przy 600 nanometrach poniżej 1,0.Następnie przenieś 2 mL płynnego miękkiego agaru o temperaturze 42 °C na dno 100 mm okrągłej szalki Petriego, pipetuj 40 µL kultury bakteryjnej do miękkiego agaru, a następnie wymieszaj, kołysząc szalką. Pokryj dłuższą krawędź szklanego preparatu do mikroskopu mieszaniną miękkiego agaru. Następnie wyrównaj pokrytą krawędź szkiełka z dolnym znacznikiem na naczyniu do tworzenia gradientu.Dotknij szkiełka powierzchni agaru. Delikatny dotyk jest wystarczający, aby przenieść smugę miękkiego agaru na powierzchnię gradientu. Następnie szkiełko odkładamy w celu oczyszczenia i ponownego użycia.Powtórz ten proces. Pozostałe próbki oraz kontrole eksperymentalne powinny zostać umieszczone na każdej płytce gradientowej. W przypadku prowadzenia wielu gradientów, inkubuj płytkę gradientową odwróconą dnem do góry przez noc w temperaturze 37 °C; czas i temperatura inkubacji mogą się różnić w zależności od szczepów bakterii stosowanych do odczytu, jednak inkubacja przez noc w temperaturze 37 °C jest zazwyczaj wystarczająca do uzyskania widocznego wzrostu.Na koniec wykonaj obrazowanie i przeanalizuj wzrost komórek zgodnie z opisem w protokole pisemnym. Przedstawiono tutaj obrazy szczepu odczytującego po transformacji niezmodyfikowanym P-G-F-U-V lub biblioteką mutantów PG FPUV, które przeszły przez cztery rundy mutagenezy; ciemne lub słabo świecące kolonie wskazują na plazmidy zawierające mutacje inaktywujące GFP.Rysunek ten przedstawia częstotliwość mutacji w całej neutralnej sekwencji plazmidu docelowego w odstępach 100 par zasad. Należy zwrócić uwagę, że mutacje występują w całej sekwencji plazmidu, jednak z najwyższą częstotliwością w pobliżu miejsca inicjacji replikacji. Tutaj wzrost mutantów przedstawiono w zależności od gradientu stężenia leku.Odległość wzrostu w kierunku szczytu gradientu wskazuje na zróżnicowany profil oporności na lek wśród mutantów. W tym przykładzie biblioteki plazmidowe ludzkiej oksydacyjnej demetylazy ABH2 zostały przesiewane pod kątem mutantów o zwiększonej oporności na metanosulfonian metylu z wykorzystaniem gradientów selekcji lekiem. Przedstawiono porównanie bibliotek reprezentujących drugą i czwartą iterację protokołu mutagenezy z rodzimym typem dzikim oraz pustym wektorem.Biała linia oznacza próg, powyżej którego izolowano poszczególne kolonie mutantów. Do dalszej analizy fenotypowej wybrano mutanty beta-laktamazy: R 1 64 H oraz E 1 0 4 KR 1 64 HG 2 67 R, zidentyfikowane wcześniej za pomocą mutogenezy P one o niskiej wierności oraz selekcji astri i m, przedstawione na gradiencie cefotaksymu o stężeniach 0.4 µg/mL i 4 µg/mL. Ochrona przed cefotaksymem świadczy o aktywności beta-laktamaz o rozszerzonym spektrum.Należy zauważyć, że enzym beta-laktamaza typu dzikiego nie zapewnia żadnej ochrony w porównaniu z komórkami wykazującymi ekspresję pustego wektora. Zatem mutanty te reprezentują adaptację lub ewolucję nowej aktywności biochemicznej. W niniejszej pracy zaprezentowaliśmy skuteczne połączenie mutagenezy i selekcji funkcjonalnej w celu generowania nowych aktywności biochemicznych.Selekcję funkcjonalną można przeprowadzić albo poprzez selekcję lekami, albo za pomocą komplementacji genetycznej, co pozwala wykorzystać zdolność do generowania dużej różnorodności genetycznej. Mutagenezę może być konieczne ograniczyć do określonej sekwencji w celu optymalizacji istniejącej aktywności białka lub w przypadku mutagenezy ukierunkowanej. Może to zostać łatwo osiągnięte poprzez klonowanie.Ponadto mutagezę można oddzielić od selekcji funkcjonalnej w celu uzyskania ataków sygnaturowych lub śladów mutacyjnych.

mutagenesis-functional-selection-protocols-for-directed-evolution

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Protokoły mutagenezy i selekcji funkcjonalnej do ukierunkowanej ewolucji białek w E. coli

Systematyczne, wielkoskalowe przesiewy syntetycznych interakcji genetycznych (gen-gen lub epistaza) mogą być wykorzystywane do badania redundancji genetycznej i wzajemnych powiązań między szlakami sygnałowymi. W niniejszej pracy opisujemy opracowaną przez nas technologię wysokoprzepustowych ilościowych przesiewów macierzy syntetycznych interakcji genetycznych, nazwaną eSGA, służącą do wyjaśniania relacji epistatycznych i badania sieci interakcji genetycznych w Escherichia coli.

Mapowanie bakteryjnych sieci funkcjonalnych i szlaków w Escherichia Coli z wykorzystaniem syntetycznych macierzy genetycznych

Opracowano nową metodę ewolucji kierowanej, specyficzną dla dziedziny inżynierii termostabilności, a następnie zwalidowano ją dla enzymów bakteriolitycznych. Po zaledwie jednej rundzie mutagenezy losowej ewoluowany enzym bakteriolityczny, PlyC 29C3, wykazał ponad dwukrotnie wyższą aktywność resztkową w porównaniu z białkiem typu dzikiego po inkubacji w podwyższonej temperaturze.

Nowa metoda przesiewowa dla ewolucji sterowanej termostabilnych enzymów bakterio();tycznych

Współekspresja białek jest potężną alternatywą dla rekonstytucji in vitro kompleksów białkowych i jest pomocna w przeprowadzaniu testów biochemicznych i genetycznych in vivo. W tym artykule informujemy o wykorzystaniu koekspresji białek w Escherichia coli do uzyskania kompleksów białkowych i dostrojenia częstotliwości mutacji komórek.

Wieloaspektowe korzyści płynące z koekspresji białek w Escherichia coli

Przedstawiamy szczegółowy protokół do konstruowania i sprawdzania bibliotek mutantów dla kampanii ukierunkowanej ewolucji u Saccharomyces cerevisiae.

Metoda ukierunkowanej ewolucji u Saccharomyces cerevisiae: tworzenie i badanie przesiewowe biblioteki mutantów

Przedstawiamy protokół do oceny funkcjonalnej kompleksowych bibliotek mutagenezy saturacji pojedynczym miejscem białek wykorzystujących sekwencjonowanie wysokoprzepustowe. Co ważne, podejście to wykorzystuje ortogonalne pary starterów do budowy i sekwencjonowania bibliotek multipleksowych. Przedstawiono reprezentatywne wyniki przy użyciu TEM-1 β-laktamazy dobranej w klinicznie istotnej dawce ampicyliny.

Protokół oceny funkcjonalnej bibliotek mutagenezy nasycenia całych białek wykorzystujących sekwencjonowanie o wysokiej przepustowości

Ten artykuł opisuje szczegółową metodologię losowej mutagenezy docelowego genu u drożdży rozszczepieniowych. Jako przykład celujemy w rpt4 +, który koduje podjednostkę proteasomu 19S i badamy pod kątem mutacji, które destabilizują heterochromatynę.

Mutageneza losowa ukierunkowana na geny w celu wyselekcjonowania mutantów proteasomów destabilizujących heterochromatynę w drożdżach rozszczepieniowych

Mutageneza ukierunkowana na miejsce jest techniką używaną do wprowadzania specyficznych mutacji w kwasie dezoksyrybonukleinowym (DNA). Protokół ten opisuje, jak przeprowadzić mutagenezę ukierunkowaną na miejsce za pomocą 2-etapowego i 3-etapowego podejścia opartego na reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), które ma zastosowanie do dowolnego fragmentu DNA będącego przedmiotem zainteresowania.

Mutageneza ukierunkowana na miejsce w eksperymentach in vitro i in vivo na przykładzie interakcji RNA w Escherichia coli

Celem tego manuskryptu jest przedstawienie zarysu kompleksowych badań biochemicznych i funkcjonalnych ligaz ubikwityny typu E3 typu RING. Ten wieloetapowy potok, ze szczegółowymi protokołami, weryfikuje aktywność enzymatyczną badanego białka i pokazuje, jak powiązać tę aktywność z funkcjonowaniem.

Charakterystyka funkcjonalna ligaz ubikwityny RING-Type E3 in vitro i in planta

Endonukleazy restrykcyjne o nowej specyficzności sekwencji mogą być rozwijane z enzymów rozpoznających częściowo zdegenerowaną sekwencję. Tutaj przedstawiamy szczegółowy protokół, który z powodzeniem wykorzystaliśmy do zmiany specyficzności sekwencji enzymu NlaIV. Kluczowymi składnikami protokołu są podział in vitro na przedziały reakcji transkrypcji/translacji oraz wybór wariantów o nowej specyficzności sekwencji.

Ukierunkowana ewolucja endonukleazy restrykcyjnej in vitro o bardziej rygorystycznej swoistości

Mutageneza celowana całych plazmidów to prosty sposób na stworzenie nieco odmiennych wariantów oryginalnego plazmidu. W niniejszej pracy demonstrujemy łatwą i kosztowo efektywną metodę wprowadzania substytucji zasad w plazmidzie przy użyciu standardowych odczynników.

Własna metoda mutagenezy celowanej całych plazmidów

Poznaj protokół mutagenezy i selekcji funkcjonalnej dla ukierunkowanej ewolucji białek w Escherichia coli. Ta metoda umożliwia tworzenie bibliotek mutantów i identyfikację korzystnych mutacji.

Protokoły mutagenezy i selekcji funkcjonalnej dla ewolucji sterowanej białek w E. coli

Przeglądaj więcej filmów