Protokoły mutagenezy i selekcji funkcjonalnej dla ukierunkowanej ewolucji białek w E. coli

Ogólnym celem tej procedury jest stworzenie losowej biblioteki mutantów dla danej docelowej sekwencji DNA oraz szybka identyfikacja i charakterystyka mutantów przy użyciu półilościowej selekcji funkcjonalnej. Osiąga się to poprzez najpierw przekształcenie plazmidu z coli, jednym z początków replikacji zawierającym sekwencję docelową w szczep mutatora. Po posianiu i inkubacji komórek przez noc, są one zbierane, a docelowy plazmid jest izolowany w celu uzyskania biblioteki mutantów, biblioteka zmutowanych jest następnie przekształcana w szczep odczytowy w celu scharakteryzowania mutacji w drugiej części protokołu, Konstruowana jest gradientowa płytka wzrostu, a kultury bakteryjne odczytanego szczepu są ładowane do oddzielnej szalki Petriego zawierającej miękki aer.

Ostatnim krokiem procedury jest stemplowanie transferem tych kultur bakteryjnych do gradientu. Ostatecznie można uzyskać wyniki, które pokazują zmiany w profilu fenotypowym danej sekwencji docelowej poprzez różnice we wzroście na gradionym leku. Ten film przedstawia metodę ukierunkowanej ewolucji białek w E. coli.

Proces ten naśladuje naturalną ewolucję w generowaniu losowych bibliotek składników odżywczych, po której następuje selekcja, która ogranicza tę różnorodność. W ten sposób poprawia naszą zdolność do generowania nowych działań biochemicznych do celów przemysłowych lub biomedycznych. Procedura ta składa się z dwóch elementów, generowania losowej biblioteki mutantów i selekcji funkcjonalnej w celu uzyskania mutacji wzmocnienia funkcji, którą zademonstruje Jennifer Allen, technik z mojego laboratorium.

Przed rozpoczęciem tego protokołu uważano, że elektrokompetentne komórki JS 200 wyrażają wariant polimerazy DNA o niskiej wierności jeden lub biegun o niskiej wierności, który został wcześniej przygotowany zgodnie z opisem w pisemnym protokole, komórki te zawierają wrażliwy na temperaturę allel pierwszego bieguna, tak że aktywność pierwszego bieguna o niskiej wierności dominuje w temperaturze 37 stopni Celsjusza, konstruować. Docelowy plazmid zawierający coli, jeden początek replikacji ze sklonowaną sekwencją docelową sąsiadującą z początkiem replikacji, biegun niskiej wierności inicjuje coli, jeden plazmid replikacja. W ten sposób wprowadza mutacje w celu zainicjowania mutagenezy.

Połącz 40 mikrolitrów elektrokompetentnych komórek i od 30 do 250 nanogramów docelowego DNA osocza w dwumilimetrowej przerwie. Impuls weterynarza do elektroporacji, mieszanina w elektro o napięciu 1800 woltów. Należy sprawdzić stałą czasową lub TC, aby zapewnić jednolite warunki dla każdej próbki.

Idealnie TC wynosi od pięciu do sześciu milisekund. Pozwól, aby mieszanina DNA komórkowego odzyskała się w jednym mililitrze bulionu LB przez 40 minut w temperaturze od 37 do stopni Celsjusza, wstrząsając przy 250 obr./min. Uzyskać 100-milimetrową szalkę agro Petriego LV podgrzaną do 37 stopni Celsjusza, zawierającą odpowiednie antybiotyki, aby wybrać dla obu plazmidów płytkę odzyskane komórki w odpowiednim rozcieńczeniu, aby uzyskać stężenie bliskie trawnikowi, które definiuje się jako wyraźną, ale niepoliczalną liczbę kolonii, jak pokazano w tym przykładzie.

Po całonocnej inkubacji zbierz kolonie bakteryjne z szalek Petriego bulionem LB. Wyizolować plazmid, DNA z pobranych komórek, powstały plazmid. DNA stanowi losową bibliotekę mutantów.

Wykonaj trawienie restrykcyjne, przecinając bibliotekę plazmidów enzymem restrykcyjnym, który linearyzuje zarówno plazmid docelowy, jak i biegun. Jeden plazmid przeprowadza analityczny żel aro na izolowanym plazmidowym DNA, aby potwierdzić jakość i ilość. Po zweryfikowaniu plazmidów należy przetrawić jeden mikrogram biblioteki za pomocą enzymu restrykcyjnego, który linearyzuje plazmid biegunowy o jeden, ale nie przecina plazmidu docelowego.

Po zakończeniu trawienia ograniczeń wyczyść bibliotekę za pomocą zestawu do oczyszczania DNA. Na koniec przekształć czystą bibliotekę w szczep odczytowy, aby scharakteryzować mutacje. Aby rozpocząć przygotowanie gradientu, zaznacz 10 pasów rozmieszczonych równomiernie na jednej krawędzi dna kwadratowej szalki Petriego.

Umieść naczynie na pochyłości tak, aby dolna zaznaczona krawędź była podniesiona o siedem milimetrów. Wlać 25 mililitrów ciepłego agaru lb dobrze wymieszanego z odpowiednim stężeniem środka selekcyjnego do naczynia pochyłego. Jest to dolna warstwa gradientu.

Upewnij się, że agar LB pokrywa szalkę Petriego w taki sposób, że podniesiony zaznaczony koniec naczynia zawiera około jednego milimetra agaru LB, a obniżona część zawiera około ośmiu milimetrów. Przykryj talerz pokrywką KU w celu wentylacji i pozwól warzywu zastygnąć przez 10 do 15 minut. Po stwardnieniu dolnej warstwy agaru LB przenieś naczynie na płaską powierzchnię.

Następnie wlej 25 mililitrów ciepłego agaru lb bez środka selekcyjnego, aby pokryć pierwszą powierzchnię rolniczą, upewniając się, że pokryłeś całą dolną warstwę. Przykryj płytkę pokrywką KU w celu wentylacji, a następnie pozwól agri zastygnąć na 10 do 15 minut, aby wykonać przeniesienie bakterii stempla. Najpierw należy uzyskać kultury bakterii odczytywanego szczepu i rozcieńczyć je, aby uzyskać identyczną gęstość komórek o gęstości optycznej przy 600 nanometrach mniejszej niż 1,0.

Następnie przenieś dwa mililitry płynnego miękkiego agaru o temperaturze 42 stopni Celsjusza na dno 100-milimetrowej okrągłej szalki Petriego, odpipetuj 40 mikrolitrów kultury bakteryjnej do bardziej miękkiej, a następnie wymieszaj, kołysząc płytką. Pokryj dłuższą krawędź szklanego szkiełka mikroskopowego bardziej miękką mieszanką. Następnie wyrównaj powlekaną krawędź szkiełka z dolnym znacznikiem na czaszy gradientowej.

Przyłóż szkiełko do powierzchni agaru. Wystarczy miękki dotyk, aby przenieść wstęgę miękkiego agaru na powierzchnię gradientu. Szkiełko jest następnie odkładane na bok do czyszczenia i ponownego użycia.

Powtórz ten proces. Pozostałe próbki, kontrole doświadczalne, powinny być włączone do każdej szalki gradientowej. Jeśli przeprowadzanych jest wiele gradientów, inkubuj naczynie gradientowe od góry do dołu przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza, a temperatury inkubacji mogą się różnić dla różnych szczepów bakterii odczytu, ale noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza jest zwykle wystarczająca do widocznego wzrostu.

Na koniec zobrazuj i przeanalizuj wzrost komórek zgodnie z opisem w pisemnym protokole. Pokazano. Poniżej znajdują się obrazy szczepu odczytowego przekształconego za pomocą niewyciszonej biblioteki mutantów P-G-F-U-V lub PG FPUV, które zostały przeprowadzone. Cztery rundy mutagenezy ciemnych lub ciemnych kolonii wskazują na plazmid zawierający mutacje inaktywujące GFP.

Liczba ta przedstawia częstość mutacji w całej neutralnej sekwencji docelowego plazmidu w odstępach 100 par zasad. Należy zauważyć, że mutacje zachodzą w całej sekwencji plazmidu, ale z najwyższą częstotliwością najbliższą początkowi replikacji. W tym przypadku wzrost mutantów jest pokazany w stosunku do gradientu leków.

Odległość rosnąca w kierunku szczytu gradientu wskazuje na zróżnicowany profil lekooporności wśród mutantów. W tym przykładzie biblioteki plazmidowe ludzkiej demetylazy oksydacyjnej ABH two zostały przebadane pod kątem mutantów o zwiększonej odporności na sulfonian metylosanu przy użyciu gradientów wyboru leków. Dwa. Takie biblioteki reprezentujące dwie i cztery iteracje protokołu mutagenezy są pokazane w porównaniu z rodzicielskim typem dzikim i pustym wektorem.

Biała linia oznacza próg, powyżej którego izolowano poszczególne kolonie mutantów. Do dalszej analizy fenotypowej mutanty beta-laktamazy, R 1 64 H i E 1 0 4 KR 1 64 HG 2 67 R wcześniej zidentyfikowane przy użyciu mutagenezy P one o niskiej wierności oraz selekcji astri i m są pokazane na 0,4 mikrograma na mililitr i czterech mikrogramów na mililitr. Ochrona gradientu cefotaksymu przed cefotaksymem wskazuje na rozszerzone spektrum działania beta-laktamazy.

Należy zauważyć, że enzym beta-laktamazy typu dzikiego nie zapewnia żadnej ochrony w stosunku do komórek wyrażających pusty wektor. Dlatego te mutanty reprezentują adaptację lub ewolucję nowej aktywności biochemicznej. Tutaj przedstawiliśmy potężną kombinację mutagenezy i selekcji funkcjonalnej dla tej generacji nowych aktywności biochemicznych.

Selekcja funkcjonalna może być uzyskana albo poprzez selekcję leków, albo poprzez komplementację genetyczną, i wykorzystuje naszą zdolność do generowania dużej różnorodności genetycznej. Patogeneza może być ograniczona do danej sekwencji w celu optymalizacji istniejącej wcześniej aktywności białek lub patogenezy ukierunkowanej na miejsce. Można to łatwo zrobić przez klonowanie.

Ponadto mutageneza może być oddzielona od selekcji funkcjonalnej w celu uzyskania ataków sygnaturowych lub śladów mutacji.