Name: Protokół oceny funkcjonalnej bibliotek mutagenezy nasycenia całych białek wykorzystujących sekwencjonowanie o wysokiej przepustowości (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 36 s
Description: Poznaj metodę oceny funkcjonalnej bibliotek mutagenezy nasycenia całych białek z wykorzystaniem sekwencjonowania o wysokiej przepustowości. Technika ta pozwala badać ograniczenia strukturalne i ewolucyjne białek oraz inżynierię białek o nowych funkcjach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

R.R. dziękuje za wsparcie ze strony National Institutes of Health (RO1EY018720-05), Fundacji Roberta A. Welcha (I-1366) oraz Green Center for Systems Biology.

<ol><li>Hutchison, C. A. 3rd, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutagenesis+at+a+specific+position+in+a+DNA+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Mutagenesis at a specific position in a DNA sequence.</a> J Biol Chem. 253 (18), 6551-6560 (1978).</li>
<li>Mullis, K. B., Faloona, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+synthesis+of+DNA+in+vitro+via+a+polymerase-catalyzed+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction.</a> Methods Enzymol. 155, 335-350 (1987).</li>
<li>Papworth, C., Bauer, J. C., Braman, J., Wright, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-directed+mutagenesis+in+one+day+with+%3E80%25+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Strategies%22%5BJournal%5D)">Site-directed mutagenesis in one day with >80% efficiency.</a> Strategies. 9 (3), 3-4 (1996).</li>
<li>Higuchi, R., Krummel, B., Saiki, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+method+of+in+vitro+preparation+and+specific+mutagenesis+of+DNA+fragments%3A+study+of+protein+and+DNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A general method of in vitro preparation and specific mutagenesis of DNA fragments: study of protein and DNA interactions.</a> Nucleic Acids Res. 16 (15), 7351-7367 (1988).</li>
<li>Rennell, D., Bouvier, S. E., Hardy, L. W., Poteete, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+mutation+of+bacteriophage+T4+lysozyme%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Systematic mutation of bacteriophage T4 lysozyme.</a> J Mol Biol. 222 (1), 67-88 (1991).</li>
<li>Markiewicz, P., Kleina, L. G., Cruz, C., Ehret, S., Miller, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+studies+of+the+lac+repressor.+XIV.+Analysis+of+4000+altered+Escherichia+coli+lac+repressors+reveals+essential+and+non-essential+residues%2C+as+well+as+%27spacers%27+which+do+not+require+a+specific+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic studies of the lac repressor. XIV. Analysis of 4000 altered Escherichia coli lac repressors reveals essential and non-essential residues, as well as 'spacers' which do not require a specific sequence.</a> J Mol Biol. 240 (5), 421-433 (1994).</li>
<li>Kleina, L. G., Miller, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+studies+of+the+lac+repressor.+XIII.+Extensive+amino+acid+replacements+generated+by+the+use+of+natural+and+synthetic+nonsense+suppressors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic studies of the lac repressor. XIII. Extensive amino acid replacements generated by the use of natural and synthetic nonsense suppressors.</a> J Mol Biol. 212 (2), 295-318 (1990).</li>
<li>Huang, W., Petrosino, J., Hirsch, M., Shenkin, P. S., Palzkill, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino+acid+sequence+determinants+of+beta-lactamase+structure+and+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Amino acid sequence determinants of beta-lactamase structure and activity.</a> J Mol Biol. 258 (4), 688-703 (1996).</li>
<li>Fowler, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+mapping+of+protein+sequence-function+relationships%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">High-resolution mapping of protein sequence-function relationships.</a> Nat Methods. 7 (9), 741-746 (2010).</li>
<li>Hietpas, R. T., Jensen, J. D., Bolon, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+illumination+of+a+fitness+landscape%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Experimental illumination of a fitness landscape.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (19), 7896-7901 (2011).</li>
<li>McLaughlin, R. N., Poelwijk, F. J., Raman, A., Gosal, W. S., Ranganathan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spatial+architecture+of+protein+function+and+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The spatial architecture of protein function and adaptation.</a> Nature. 491 (7422), 138-142 (2012).</li>
<li>Deng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+sequencing+of+systematic+combinatorial+libraries+reveals+beta-lactamase+sequence+constraints+at+high+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Deep sequencing of systematic combinatorial libraries reveals beta-lactamase sequence constraints at high resolution.</a> J Mol Biol. 424 (3-4), 150-167 (2012).</li>
<li>Stiffler, M. A., Hekstra, D. R., Ranganathan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolvability+as+a+Function+of+Purifying+Selection+in+TEM-1+beta-Lactamase%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Evolvability as a Function of Purifying Selection in TEM-1 beta-Lactamase.</a> Cell. 160 (5), 882-892 (2015).</li>
<li>Matagne, A., Lamotte-Brasseur, J., Frere, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catalytic+properties+of+class+A+beta-lactamases%3A+efficiency+and+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Catalytic properties of class A beta-lactamases: efficiency and diversity.</a> Biochem J. 330 (Pt2), 581-598 (1998).</li>
<li>Salverda, M. L., De Visser, J. A., Barlow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+evolution+of+TEM-1+beta-lactamase%3A+experimental+reconstruction+and+clinical+relevance%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Natural evolution of TEM-1 beta-lactamase: experimental reconstruction and clinical relevance.</a> FEMS Microbiol Rev. 34 (6), 1015-1036 (2010).</li>
<li>Weinreich, D. M., Delaney, N. F., Depristo, M. A., Hartl, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Darwinian+evolution+can+follow+only+very+few+mutational+paths+to+fitter+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Darwinian evolution can follow only very few mutational paths to fitter proteins.</a> Science. 312 (5770), 111-114 (2006).</li>
<li>Stewart, S. M., Fisher, M., Young, J. E., Lutz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ampicillin+levels+in+sputum%2C+serum%2C+and+saliva%5BTitle%5D)+AND+%22Thorax%22%5BJournal%5D)">Ampicillin levels in sputum, serum, and saliva.</a> Thorax. 25 (3), 304-311 (1970).</li>
<li>Giachetto, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ampicillin+and+penicillin+concentration+in+serum+and+pleural+fluid+of+hospitalized+children+with+community-acquired+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Infect+Dis+J%22%5BJournal%5D)">Ampicillin and penicillin concentration in serum and pleural fluid of hospitalized children with community-acquired pneumonia.</a> Pediatr Infect Dis J. 23 (7), 625-629 (2004).</li>
<li>Ambler, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+standard+numbering+scheme+for+the+class+A+beta-lactamases%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">A standard numbering scheme for the class A beta-lactamases.</a> Biochem J. 276 (Pt 1), 269-270 (1991).</li>
<li>Magoc, T., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FLASH%3A+fast+length+adjustment+of+short+reads+to+improve+genome+assemblies%29%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">FLASH: fast length adjustment of short reads to improve genome assemblies).</a> Bioinformatics. 27 (21), 2957-2963 (2011).</li>
<li>Melamed, D., Young, D. L., Gamble, C. E., Miller, C. R., Fields, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+mutational+scanning+of+an+RRM+domain+of+the+Saccharomyces+cerevisiae+poly%28A%29-binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Deep mutational scanning of an RRM domain of the Saccharomyces cerevisiae poly(A)-binding protein.</a> RNA. 19 (11), 1537-1551 (2013).</li>
<li>Bank, C., Hietpas, R. T., Jensen, J. D., Bolon, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+survey+of+an+intragenic+epistatic+landscape%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Evol%22%5BJournal%5D)">A systematic survey of an intragenic epistatic landscape.</a> Mol Biol Evol. 32 (1), 229-238 (2015).</li>
<li>Dove, S. L., Joung, J. K., Hochschild, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+prokaryotic+transcription+through+arbitrary+protein-protein+contacts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Activation of prokaryotic transcription through arbitrary protein-protein contacts.</a> Nature. 386 (6625), 627-630 (1997).</li>
<li>Romero, P. A., Tran, T. M., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+enzyme+function+with+microfluidic-based+deep+mutational+scanning%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Dissecting enzyme function with microfluidic-based deep mutational scanning.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (23), 7159-7164 (2015).</li>
</ol>

Autorzy deklarują, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych

W tym miejscu opisano protokół do przeprowadzania oceny funkcjonalnej bibliotek mutagenezy nasycenia całych białek, przy użyciu technologii sekwencjonowania o wysokiej przepustowości. Ważnym aspektem metody jest zastosowanie starterów ortogonalnych podczas procesu klonowania. Krótko mówiąc, każda pozycja aminokwasu jest losowo przydzielana przez mutagenny PCR i mieszana razem w grupy pozycji, których łączna długość sekwencji jest dostosowywana przez sekwencjonowanie o wysokiej przepustowości. Grupy te są klonowane do wek...

Mutageneza od dawna jest stosowana w laboratorium do badania właściwości systemów biologicznych i ich ewolucji, a także do produkcji zmutowanych białek lub organizmów o ulepszonych lub nowych funkcjach. Podczas gdy wczesne podejścia opierały się na metodach, które powodowały losowe mutacje w organizmach, pojawienie się technologii rekombinacji DNA umożliwiło naukowcom wprowadzenie wybranych zmian w DNA w sposób specyficzny dla danego miejsca, tj. mutageneza ukierunkowanana miejsce 1,2. Przy obecnych technikach, zazwyczaj wykorzystujących mutagenne oligonukleotydy w reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), stosunkowo łatwo jest stworzyć i ocenić niewielką liczbę mutacji (np. mutacji punktowych) w danym genie3,4. Jest to jednak o wiele trudniejsze, gdy cel zbliża się, na przykład, do stworzenia i oceny wszystkich możliwych mutacji jednomiejscowych (lub wyższego rzędu).
Chociaż wiele nauczyliśmy się z wczesnych badań próbujących ocenić dużą liczbę mutacji w genach, stosowane techniki były często pracochłonne, na przykład wymagały oceny każdej mutacji niezależnie przy użyciu bezsensownych szczepów supresorowych5-7, lub były ograniczone w swojej zdolności ilościowej ze względu na niską głębokość sekwencjonowania Sanger8. Techniki stosowane w tych badaniach zostały w dużej mierze wyparte przez metody wykorzystujące technologię sekwencjonowania o wysokiej przepustowości9-12. Te koncepcyjnie proste podejścia pociągają za sobą stworzenie biblioteki składającej się z dużej liczby mutacji, poddanie biblioteki badaniu przesiewowemu lub selekcji pod kątem funkcji, a następnie głębokie sekwencjonowanie (tj. w kolejności >106 odczytów sekwencjonowania) biblioteki uzyskanej przed i po selekcji. W ten sposób efekty fenotypowe lub dostosowawcze dużej liczby mutacji, reprezentowane jako zmiana częstości występowania każdego mutanta, mogą być oceniane jednocześnie i bardziej ilościowo.
Poprzednio wprowadziliśmy proste podejście do oceny bibliotek wszystkich możliwych mutacji pojedynczych aminokwasów w białkach (tj. bibliotek mutagenezy nasycenia całych białek), mające zastosowanie do genów o długości dłuższej niż długość odczytu sekwencjonowania11,13: Po pierwsze, każda pozycja aminokwasu jest losowo wybierana przez mutagenny PCR skierowany na miejsce. Podczas tego procesu gen jest dzielony na grupy złożone z przyległych pozycji o całkowitej długości pomieszczonej przez platformę sekwencjonowania. Mutagenne produkty PCR dla każdej grupy są następnie łączone, a każda grupa niezależnie poddawana selekcji i sekwencjonowaniu o wysokiej przepustowości. Zachowując zgodność między lokalizacją mutacji w sekwencji a długością odczytu sekwencjonowania, podejście to ma tę zaletę, że maksymalizuje głębokość sekwencjonowania: podczas gdy można po prostu sekwencjonować takie biblioteki w krótkich oknach bez dzielenia na grupy (np. za pomocą standardowego podejścia do sekwencjonowania typu shotgun), większość uzyskanych odczytów byłaby typu dzikiego, a zatem większość przepustowości sekwencjonowania zostałaby zmarnowana (np. W przypadku biblioteki mutagenezy nasycenia całych białek białka składającego się z 500 aminokwasów sekwencjonowanych w oknach 100 aminokwasów (300 pz), co najmniej 80% odczytów będzie sekwencją typu dzikiego).
Tutaj prezentowany jest protokół, który wykorzystuje sekwencjonowanie o wysokiej przepustowości do oceny funkcjonalnej bibliotek mutagenezy nasycenia całych białek, korzystając z powyższego podejścia (opisanego na rysunku 1). Co ważne, wprowadzamy zastosowanie starterów ortogonalnych w procesie klonowania biblioteki do kodowania kreskowego każdej grupy sekwencji, co pozwala na ich multipleksowanie do jednej biblioteki, jednoczesne poddawanie ich selekcji lub selekcji, a następnie demultipleksowanie w celu głębokiego sekwencjonowania. Ponieważ grupy sekwencji nie są poddawane selekcji niezależnie, zmniejsza to obciążenie pracą i zapewnia, że każda mutacja doświadcza tego samego poziomu selekcji. Jako system modelowy stosuje się TEM-1 β-laktamazę, enzym, który nadaje wysoki poziom oporności na antybiotyki β-laktamowe (np. ampicylinę) u bakterii14-16. Opisano protokół oceny biblioteki mutagenezy wysycenia całych białek TEM-1 u E. coli poddanych selekcji na przybliżonym poziomie surowicy dla klinicznej dawki ampicyliny (50 μg/ml)17,18.

<table><tbody><tr><td></td><td>Typtone Research Products Intl. Corp.</td><td>T60060-1000.0</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy</td><td>Research Products Intl. Corp.</td><td>Y20020-500.0</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333-500G</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan magnezu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506-500G</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1423-500</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek tetracykliny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7660-5G</td><td></td></tr><tr><td>Płytki Petriego</td><td>Corning</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB&nbsp;</td><td>Mathworks</td><td>http://www.mathworks.com/products/matlab/</td><td></td></tr> <tr><td>Startery oligonukleotydowe</td><td>Zintegrowane technologie DNA</td><td>https://www.idtdna.com/pages/products/dna-rna/custom-dna-oligos</td><td>skali 25 nmol, standardowe pBR322_AvrII odsalania</td></tr><tr><td></td><td>dostępne na żądanie</td><td></td><td>plazmid pBR322 zmodyfikowany tak, aby zawierał miejsce restrykcyjne AvrII za genem TEM-1</td></tr><tr><td>pBR322_OP1 &ndash; pBR322_OP5</td><td>dostępne na życzenie</td><td></td><td>pięć zmodyfikowanych plazmidów pBR322, z których każdy zawiera parę ortogonalnych miejsc primingu</td></tr><tr><td>Polimeraza DNA o wysokiej wierności Q5</td><td>New England Biolabs</td><td>M0491L</td><td>zawiera 5x bufor PCR i dodatek PCR (wzmacniacz GC)</td></tr><tr><td>15 ml stożkowa probówka</td><td>Corning</td><td>430025</td><td></td></tr><tr><td>Pipety wielokanałowe (Eppendorf ResearchPlus)</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Płytka PCR, 96-dołkowa</td><td>Fisher Scientific</td><td>14230232</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa uszczelka Excel</td><td>Scientific</td><td>F-96-100</td><td></td></tr><tr><td>Veriti 96-dołkowy termocykler</td><td>Applied Biosystems</td><td>4375786</td><td></td></tr><tr><td>6x barwnik ładujący żel</td><td>New England Biolabs</td><td>B7024S</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Research Products Intl. Corp.</td><td>20090-500.0</td><td></td></tr><tr><td>Bromek etydyny</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0433</td><td></td></tr><tr><td>Oświetlacz UV (FOTO/Analyst ImageTech)</td><td>Fotodyne Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>http://www.fotodyne.com/content/ImageTech_gel_documentation Bufor EB</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowe, czarnościenne, przezroczyste płytki testowe z dnem</td><td>Corning</td><td>3651</td><td></td></tr><tr><td>Lambda phage DNA</td><td>New England Biolabs</td><td>N3011S</td><td></td></tr><tr><td>PicoGreen dsDNA Odczynnik</td> do oznaczania ilościowego dsDNA <td>Invitrogen</td><td>P7581</td>, <td>używany w kroku protokołu 2.2.4</td></tr><tr><td>Czytnik mikropłytek Victor 3 V</td> Zestaw do oczyszczania DNA <td>PerkinElmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Zymo Research</td><td>D4003</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek</td><td>Corning</td><td>3621</td><td></td></tr><tr><td>Oświetlacz UV o długich falach</td><td>Fisher Scientific</td><td>FBUVLS-80</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do ekstrakcji DNA w żelu agarozowym</td><td>Zymo Research</td><td>D4001-1-100</td><td></td></tr><tr><td>AatII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0117S</td><td></td></tr><tr><td>AvrII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0174L</td><td></td></tr><tr><td>Ligaza DNA T4</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>EVB100 elektrokompetentny elektroporator E. coli</td><td>Avidity</td><td>EVB100</td><td></td></tr><tr><td>(E. coli Pulser)</td><td>Bio-Rad</td><td>1652102</td><td></td></tr><tr><td>Kuwety do elektroporacji</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2089</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr (Ultrospec 3100 pro)</td><td>Amersham Biosciences</td><td>80211237</td><td></td></tr><tr><td>50 ml probówki stożkowe</td><td>Corning</td><td>430828</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oczyszczania plazmidu</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740588.25</td><td></td></tr><tr><td>8-dołkowe probówki paskowe do PCR</td><td>Axygen</td><td>321-10-551</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw testowy Qubit dsDNA HS</td><td>Invitrogen</td><td>Q32854</td><td>dsDNA odczynnik do oznaczania</td></tr><tr><td>ilościowego Probówki do oznaczania kubitów</td><td>Invitrogen</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Fluorometr kubitowy</td><td>Invitrogen</td><td>Q32866</td><td></td></tr><tr><td>Sól sodowa ampicyliny</td><td>Akron Biotechnology</td><td>50824296</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq zestaw odczynników v2 (500 cykli)</td><td>Illumina</td><td>MS-102-2003</td><td></td></tr><tr><td>Sekwencer biurkowy MiSeq</td><td>Illumina</td><td>http://www.illumina.com/systems/miseq.html</td><td>alternatywnie można sekwencjonować na platformie Illumina HiSeq</td></tr><tr><td>Oprogramowanie FLASh</td><td>John Hopkins University - oprogramowanie open source</td><td>http://ccb.jhu.edu/software/FLASH/</td> <td>do łączenia odczytów sparowanych końców z danych sekwencjonowania nowej generacji</td></tr><tr><td>AatII_F</td><td></td><td></td><td>GATAATAATGGTTTCTTAGACG TCAGGTGGC</td></tr><tr><td>AvrII_R</td><td></td><td></td><td>CTTCACCTAGGTCCTTTTAAAT TAAAAATGAAG</td></tr><tr><td>AvrII_F</td><td></td><td></td><td>CTTCATTTTTAATTTAAAAGGA CCTAGGTGAAG</td></tr><tr><td>AatII_OP1_R</td><td></td><td></td><td>ACCTGACGTCCGTATTTCAAC 
TGTCCGGTCTAAGAAACCATT 
ATTATCATGACATTAAC</td></tr><tr><td>AatII_OP2_R</td><td></td><td></td><td>ACCTGACGTCCGCTCACGGA 
GTGTACTAATTAAGAAACCATT 
ATTATCATGACATTAAC</td></tr><tr><td>AatII_OP3_R</td><td></td><td></td><td>ACCTGACGTCGTACGTCTGA 
ACTTGGGACTTAAGAAACCA 
TTATTATCATGACATTAAC</td></tr><tr><td>AatII_OP4_R</td><td></td><td></td><td>ACCTGACGTCCCGTTCTCGAT 
ACCAAGTGATAAGAAACCATT 
ATTATCATGACATTAAC</td></tr><tr><td>AatII_OP5_R</td><td></td><td></td><td>ACCTGACGTCGTCCGTCGGA 
GTAACAATCTTAAGAAACCAT 
TATTATCATCATGACATTAAC</td></tr><tr><td>OP1_F</td><td></td><td></td><td>GACCGGACAGTTGAAATACG</td></tr><tr><td>OP1_R</td><td></td><td></td><td>CGACGTACAGGACAATTTCC</td></tr><tr><td>OP2_F</td><td></td><td></td><td>ATTAGTACACTCCGTGAGCG</td></tr><tr><td>OP2_R</td><td></td><td></td><td>AGTATTAGGCGTCAAGGTCC</td></tr><tr>OP3_F <td>AGTCCCAAGTTCAGACGTAC</td><td>OP3_R</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>GAAAAGTCCCAATGAGTGCC</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> OP4_F <td>TCACTTGGTATCGAGAACGG</td></tr><tr><td>OP4_R</td><td></td><td></td><td>TATCACGGAAGGACTCAACG</td></tr><tr><td>OP5_F</td><td></td><td></td><td>AGATTGTTACTCCGACGGAC</td></tr><tr><td>OP5_R</td><td></td><td></td><td>TATAACAGGCTGCTGCTGAGACC</td></tr><tr><td>Group1_F</td><td></td><td></td><td>ACACTCTCTCCCTACACGAC 
GCTCTTCCGATCTNNNNNGC 
ATTTTGCCTACCGGTTTTTGC</td></tr><tr><td>Group1_R</td><td></td><td></td><td>GTGACTGGAGTTCAGACGTG 
TGCTCTCCGATCTNNNNNTC 
TTGCCCGGCGTCAAC</td></tr><tr><td>Group2_F</td><td></td><td></td><td>ACACTCTTTCCCTACACGAC 
GCTCTTCCGATCTNNNNNGA 
ACGTTTTCCAATGATGAGCAC</td></tr><tr><td>Group2_R</td><td></td><td></td><td>GTGACTGGAGTTCAGACGTG 
TGCTCTTCCGATCTNNNNNGT 
CCTCCGATCGTTGTCAGAAG</td></tr><tr><td>Group3_F</td><td></td><td></td><td>ACACTCTTTCCCTACACGAC 
GCTCTTCCGATCTNNNNNAG 
TAAGAGAATTATGCAGTGCTGCC</td></tr><tr><td>Group3_R</td><td></td><td></td><td>GTGACTGGAGTTCAGACGTG 
TGCTCTCCGATCTNNNNNTC 
GCCAGTTAATAGTTTGCGC</td></tr><tr><td>Group4_F</td><td></td><td></td><td>ACACTCTTTCCCTACACGAC 
GCTCTTCCGATCTNNNNNCC 
AAACGACGAGCGTGACAC</td></tr><tr><td>Group4_R</td><td></td><td></td><td>GTGACTGGAGTTCAGACGTG 
TGCTCTTCCGATCTNNNNNGC 
AATGATACCGCGAGACCC</td></tr><tr><td>Group5_F</td><td></td><td></td><td>ACACTCTTTCCCTACACGAC 
GCTCTTCCGATCTNNNNNCG 
GCTGGCTGGTTTATTGC</td></tr><tr><td>Group5_R</td><td></td><td></td><td>GTGACTGGAGTTCAGACGTG 
TGCTCTTCCGATCTNNNNNNTAT 
ATGAGTAAACTTGGTCTGACAG</td></tr><tr><td>501_F</td><td></td><td></td><td>AATGATACGGCGACCGA 
GATCTACACTATAGCCTACAC 
TCTTTCCCTACACGAC</td></tr><tr><td>502_F</td><td></td><td></td><td>AATGATACGGCGACCACCGA 
GATCTACACATAGAGGCACA 
CTCTTTCCCTACACGAC</td></tr><tr><td>503_F</td><td></td><td></td><td>AATGATACGGCGACCACCGA 
GATCTACACCCTATCCTACAC 
TCTTTCCCTACACGAC</td></tr><tr><td>504_F</td><td></td><td></td><td>AATGATACGGCGACCACCGA 
GATCTACACGGCTCTGAACA 
CTCTTTCCCTACACGAC</td></tr><tr><td>505_F</td><td></td><td></td><td>AATGATACGGCGACCACCGA 
GATCTACACAGGCGAAGACA 
CTCTTTCCCTACACGAC</td></tr><tr><td>701_R</td><td></td><td></td><td>CAAGCAGAAGACGGCATAC 
GAGATCGAGTAATGTGACTG 
GAGTTCAGACGTG</td></tr><tr><td>702_R</td><td></td><td></td><td>CAAGCAGAAGACGGCATAC 
GAGATTCTCCGGAGTGACTG 
GAGTTCAGACGTG powiedział:</td></tr></tbody></table>

protokół oceny funkcjonalnej bibliotek mutagenezy nasycenia całych białek wykorzystujących sekwencjonowanie o wysokiej przepustowości

A Protocol for Functional Assessment of Whole-Protein Saturation Mutagenesis Libraries Utilizing High-Throughput Sequencing

Mutageneza ukierunkowana na miejsce od dawna jest stosowana jako metoda badania struktury, funkcji i ewolucji białek. Niedawne postępy w technologii sekwencjonowania masowo równoległego otworzyły możliwość oceny efektów funkcjonalnych lub sprawności dużej liczby mutacji jednocześnie. W tym miejscu przedstawiamy protokół eksperymentalnego określania skutków wszystkich możliwych mutacji pojedynczych aminokwasów w białku będącym przedmiotem zainteresowania przy użyciu technologii sekwencjonowania o wysokiej przepustowości, na przykładzie enzymu oporności na antybiotyki 263 aminokwasów TEM-1 β-laktamazy. W tym podejściu biblioteka mutagenezy nasycenia całych białek jest konstruowana za pomocą ukierunkowanego na miejsce mutagennego PCR, losowo przydzielając każdą pozycję indywidualnie do wszystkich możliwych aminokwasów. Biblioteka jest następnie przekształcana w bakterie i selekcjonowana pod kątem zdolności do nadawania oporności na antybiotyki β-laktamowe. Efekt dopasowania każdej mutacji jest następnie określany przez głębokie sekwencjonowanie biblioteki przed i po selekcji. Co ważne, protokół ten wprowadza metody, które maksymalizują głębokość odczytu sekwencjonowania i pozwalają na jednoczesny wybór całej biblioteki mutacji, poprzez mieszanie sąsiednich pozycji w grupy o długości dostosowanej do długości odczytu sekwencjonowania o wysokiej przepustowości i wykorzystanie starterów ortogonalnych do kodowania kreskowego każdej grupy. Reprezentatywne wyniki przy użyciu tego protokołu uzyskano poprzez ocenę wpływu na dopasowanie wszystkich mutacji pojedynczych aminokwasów w TEM-1 przy klinicznie istotnej dawce ampicyliny. Metodę tę powinno można łatwo rozszerzyć na inne białka, dla których stosuje się wysokoprzepustowy test selekcyjny.

Mapa plazmidów dla pięciu zmodyfikowanych plazmidów pBR322 zawierających ortogonalne miejsca primingu (pBR322_OP1 - pBR322_OP5) jest pokazana na rysunku 2A. Aby sprawdzić, czy startery ortogonalne są specyficzne, PCR przeprowadzono przy użyciu każdej pary starterów ortogonalnych indywidualnie, wraz ze wszystkimi pięcioma plazmidami pBR322_OP1-5 lub ze wszystkimi plazmidami bez plazmidu pasującego do ortogonalnej pary starterów. Właściwy produkt uzyskano tylko wtedy, gdy u...

Przedstawiamy protokół do oceny funkcjonalnej kompleksowych bibliotek mutagenezy saturacji pojedynczym miejscem białek wykorzystujących sekwencjonowanie wysokoprzepustowe. Co ważne, podejście to wykorzystuje ortogonalne pary starterów do budowy i sekwencjonowania bibliotek multipleksowych. Przedstawiono reprezentatywne wyniki przy użyciu TEM-1 β-laktamazy dobranej w klinicznie istotnej dawce ampicyliny.

Protokół oceny funkcjonalnej bibliotek mutagenezy nasycenia całych białek wykorzystujących sekwencjonowanie o wysokiej przepustowości

Site-directed mutagenesis has long been used as a method to interrogate protein structure, function and evolution. Recent advances in massively-parallel ...

Ogólnym celem tego protokołu jest opisanie funkcjonalnej oceny kompleksowych, jednomiejscowych bibliotek mutagenezy saturacji białek, wykorzystujących sekwencjonowanie o wysokiej przepustowości. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biochemii i ewolucji molekularnej. Na przykład, jakie są biochemiczne, strukturalne i ewolucyjne ograniczenia białek?I jak możemy zmodyfikować białka o nowych funkcjach? Główną zaletą tej techniki jest to, że maksymalizuje ona liczbę użytecznych odczytów sekwencjonowania w badaniu mutagenezy nasycenia całych białek, poprzez wielokrotne konstruowanie bibliotek i sekwencjonowanie. Po przygotowaniu płytki PCR Master Mix zgodnie z protokołem zawartym w tekście, za pomocą pipety wielokanałowej przenieść 10 mikrolitrów z 96-dołkowych płytek zawierających uprzednio rozcieńczone startery mutagenezy sensacyjnej do pokrewnych dołków w płytkach PCR.Za pomocą uszczelki płytkowej przykryć każdą płytkę PCR i odwirować w temperaturze 200 G przez dwie minuty. Następnie przenieś płytki PCR do termocyklera i uruchom następujący program. Po przeprowadzeniu dodatkowej reakcji PCR i rozcieńczeniu reakcji, od jednego do 100, przenieść jeden mikro

a-protocol-for-functional-assessment-whole-protein-saturation

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W niniejszym materiale przedstawiamy prosty protokół tworzenia losowej biblioteki mutantów dla określonej sekwencji docelowej. Pokazujemy, w jaki sposób metoda ta, realizowana in vivo w Escherichia coli, może być łączona z selekcją funkcjonalną w celu wyewoluowania nowych aktywności enzymatycznych.

Protokoły mutagenezy i selekcji funkcjonalnej dla ewolucji sterowanej białek w E. coli

Opracowaliśmy kompleksowe, nieobciążone systematycznie badania przesiewowe całego genomu, aby zrozumieć interakcje gen-lek oraz gen-środowisko. Przedstawiono metody przesiewania tych kolekcji mutantów.

Konkurencyjne przesiewy genomiczne z zastosowaniem bibliotek drożdży z kodami kreskowymi

Opisujemy przygotowanie bibliotek DNA z kodami kreskowymi i późniejsze przechwytywanie eksonów oparte na hybrydyzacji do wykrywania kluczowych mutacji związanych z rakiem w klinicznych próbkach guzów poprzez masowo równoległe sekwencjonowanie "nowej generacji". Celowane sekwencjonowanie eksonów oferuje korzyści w postaci wysokiej przepustowości, niskich kosztów i głębokiego pokrycia sekwencji, zapewniając w ten sposób wysoką czułość wykrywania mutacji o niskiej częstotliwości.

Wykrywanie somatycznych zmian genetycznych w próbkach nowotworowych poprzez wychwytywanie eksonów i masowo równoległe sekwencjonowanie

Korzystając z mikromacierzy białkowych zawierających prawie cały proteom S. cerevisiae, sonduje się szybkie, bezstronne badanie tysięcy równoległych interakcji białko-białko. Metoda ta może być stosowana do małych cząsteczek białek, modyfikacji potranslacyjnych i innych testów o wysokiej przepustowości.

Sondowanie funkcjonalnych mikromacierzy białkowych o dużej gęstości w celu wykrycia interakcji białko-białko

Modele proteinopatii drożdży są cennymi narzędziami do oceny toksyczności i agregacji białek związanych z chorobą. W tym miejscu przedstawiamy metody badań przesiewowych bibliotek wariantów Hsp104 pod kątem supresorów toksyczności. Protokół ten można dostosować do badań przesiewowych dowolnej biblioteki białek pod kątem supresorów toksyczności dowolnego białka, które jest toksyczne w drożdżach.

Izolowanie wzmocnionych wariantów Hsp104 przy użyciu modeli proteinopatii drożdżowej

Ten manuskrypt opisuje protokoły kliniczne dla dwóch paneli sekwencjonowania nowej generacji. Jeden panel bada nowotwory hematologiczne, podczas gdy drugi panel koncentruje się na genach powszechnie zmutowanych w guzach litych. Klasyfikacja molekularna mutacji powodujących nowotwory złośliwe u ludzi dostarcza cennych informacji prognostykujących i predykcyjnych.

Sekwencjonowanie nowej generacji do wykrywania mutacji, które można podjąć w celu działania, w guzach litych i płynnych

Oporność na leki celowane jest powszechna, a potrzeba identyfikacji mechanizmów oporności - przed lub po rozpoczęciu badań klinicznych - jest kluczowa dla kierowania alternatywnymi strategiami leczenia klinicznego. W tym miejscu przedstawiamy protokół parowania wyprowadzenia linii lekoopornych in vitro z sekwencjonowaniem, aby przyspieszyć odkrycie tych mechanizmów.

Implementacja testów oporności na leki in vitro: maksymalizacja potencjału w zakresie odkrywania klinicznie istotnych mechanizmów oporności

Białka, które wiążą określone sekwencje RNA, odgrywają kluczową rolę w ekspresji genów. Szczegółowa charakterystyka tych miejsc wiązania ma kluczowe znaczenie dla naszego zrozumienia regulacji genów. W tym miejscu opisano jednoetapowe podejście do mutagenezy saturacji miejsc wiązania białek w RNA. Podejście to jest istotne dla wszystkich miejsc wiązania białek w RNA.

Nowe podejście do mutagenezy saturacji: jednoetapowa charakterystyka miejsc wiązania białek regulatorowych w RNA przy użyciu fosforotionianów

Ten protokół przedstawia metodę oceny aktywności proteolitycznej proteazy o niskiej aktywności i pojedynczej rotacji w kontekście komórkowym. W szczególności metoda ta jest stosowana do oceny aktywności proteolitycznej PCSK9, kluczowego czynnika napędzającego metabolizm lipidów, którego aktywność proteolityczna jest wymagana do jego ostatecznej funkcji hipercholesterolemicznej.

Wysokoprzepustowy test lucyferazy do oceny proteolizy proteazy jednoobrotowej PCSK9

W artykule opisano metodę identyfikacji zmian klonalnych i subklonalnych wśród różnych próbek od danego pacjenta. Chociaż opisane tutaj eksperymenty koncentrują się na określonym typie nowotworu, podejście to ma szerokie zastosowanie do innych guzów litych.

Analiza porównawcza zmian chorobowych za pomocą ukierunkowanego podejścia sekwencjonowania

Osoby z mutacjami BRCA1 mają wyższe ryzyko zachorowania na raka, co gwarantuje dokładną ocenę funkcji wariantów BRCA1. W tym artykule opisaliśmy protokół oceny funkcjonalnej wariantów BRCA1 przy użyciu edytorów zasad cytozyny za pośrednictwem CRISPR, które umożliwiają ukierunkowaną konwersję C:G do T:A w żywych komórkach.

Ocena funkcjonalna wariantów BRCA1 za pomocą edytorów bazowych za pośrednictwem CRISPR

Poznaj metodę oceny funkcjonalnej bibliotek mutagenezy nasycenia całych białek z wykorzystaniem sekwencjonowania o wysokiej przepustowości. Technika ta pozwala badać ograniczenia strukturalne i ewolucyjne białek oraz inżynierię białek o nowych funkcjach.

Protokół oceny funkcjonalnej bibliotek mutagenezy nasycenia całych białek wykorzystujących sekwencjonowanie o wysokiej przepustowości (Wideo) | JoVE Journal

Protokół oceny funkcjonalnej bibliotek mutagenezy nasycenia całych białek wykorzystujących sekwencjonowanie o wysokiej przepustowości

Przeglądaj więcej filmów