Protokół oceny funkcjonalnej bibliotek mutagenezy nasycenia całych białek wykorzystujących sekwencjonowanie o wysokiej przepustowości

Ogólnym celem tego protokołu jest opisanie funkcjonalnej oceny kompleksowych, jednomiejscowych bibliotek mutagenezy saturacji białek, wykorzystujących sekwencjonowanie o wysokiej przepustowości. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biochemii i ewolucji molekularnej. Na przykład, jakie są biochemiczne, strukturalne i ewolucyjne ograniczenia białek?

I jak możemy zmodyfikować białka o nowych funkcjach? Główną zaletą tej techniki jest to, że maksymalizuje ona liczbę użytecznych odczytów sekwencjonowania w badaniu mutagenezy nasycenia całych białek, poprzez wielokrotne konstruowanie bibliotek i sekwencjonowanie. Po przygotowaniu płytki PCR Master Mix zgodnie z protokołem zawartym w tekście, za pomocą pipety wielokanałowej przenieść 10 mikrolitrów z 96-dołkowych płytek zawierających uprzednio rozcieńczone startery mutagenezy sensacyjnej do pokrewnych dołków w płytkach PCR.

Za pomocą uszczelki płytkowej przykryć każdą płytkę PCR i odwirować w temperaturze 200 G przez dwie minuty. Następnie przenieś płytki PCR do termocyklera i uruchom następujący program. Po przeprowadzeniu dodatkowej reakcji PCR i rozcieńczeniu reakcji, od jednego do 100, przenieść jeden mikrolitr z wymieszanych i rozcieńczonych mutagennych produktów PCR pierwszej rundy do pokrewnych dołków nowych płytek PCR zawierających Master Mix.

Użyj uszczelki płytki, aby przykryć każdą płytkę PCR. Odwirować płytki w temperaturze około 200 g przez dwie minuty. Następnie przenieś płytki do termocyklera i uruchom ten sam program, który wymieniono wcześniej w filmie.

Po zweryfikowaniu rozmiarów produktu PCR i zmierzeniu stężeń zgodnie z protokołem tekstowym, wymieszaj 100 nanogramów każdego produktu PCR z podbiblioteki NNS w pięć podgrup NNS. Po przeprowadzeniu podbibliotecznych reakcji PCR i przetrawieniu wektorów klonowania w reakcjach PCR, zgodnie z protokołem tekstowym, należy skonfigurować reakcje ligacji zgodnie z tymi wskazówkami dla każdej strawionej grupy podbiblioteki NNS z pokrewnym wektorem klonowania strawionym restrykcyjnie. Następnie inkubuj w temperaturze pokojowej przez godzinę.

Po rozmrożeniu elektrokompetentnych komórek E. coli dodaj dziesięć mikrolitrów komórek do każdej oczyszczonej reakcji ligacji i przenieś do kuwety elektroprorocyjnej. Elektrolitycznie oceń ogniwa pod napięciem 1,8 kilowolta, a następnie dodaj jeden mililitr pożywki SOB i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę. Następnie ponownie zawiesić 10 mikrolitrów każdej kultury regeneracyjnej w 990 mikrolitrach LB. I rozprowadź 100 mikrolitrów na płytkach ślimakowych LB zawierających 12 mikrogramów na mililitr tetracykliny.

Dla każdej kultury regeneracyjnej przygotuj 250-mililitrową kolbę hodowlaną z 50 mililitrami LB i 50 mikrolitrami tet-stocku. Przenieść pozostałą część około jednego mililitra kultury odzysku do kolby. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 200 obr./min przez noc.

Po policzeniu liczby udanych transformantów na płytkach i wyizolowaniu DNA osocza z nocnych hodowli, wymieszaj ze sobą 100 nanogramów każdego plazmidu. Po przekształceniu biblioteki DNA zgodnie z protokołem tekstowym, rozcieńczyć kulturę biblioteki przez noc do OD-600 równego 0,1. I dodaj jeden mililitr do jednej kolby.

Inkubuj kulturę preselekcji w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 200 obr./min. Okresowo monitoruj wzrost, mierząc OD-600, aż osiągnie wartość 0,1. Przenieś 100 mililitrów kultury preselekcyjnej do dwóch 50-mililitrowych stożkowych probówek i odwiruj w temperaturze 4 000 G przez sześć minut, w czterech stopniach Celsjusza.

Usuń większość supernatantu i połącz granulki w jedną, 15-mililitrową stożkową probówkę. Następnie, po powtórzeniu wirowania, usunąć cały supernatant. Do pozostałych dwóch kolb dodać tetracyklinę do końcowego stężenia 12 mikrogramów na mililitr.

I objętość kultury preselekcji, tak aby końcowy OD-600 był równy 0,001. Do jednej kolby dodać jeden mililitr 50 miligramów na mililitr ampicyliny w końcowym stężeniu 50 mikrogramów na mililitr. To jest kultura selekcji.

Podczas inkubacji kultur w temperaturze 37 stopni Celsjusza przy 200 obr./min monitoruj wzrost kultury niezawierającej ampicyliny, aż osiągnie OD-600 równą 0,1. Zmierz również OD-600 kultury selekcyjnej. Po podzieleniu OD-600 kultury selekcyjnej na 0,1 i pomnożeniu przez 100, przenieś tę objętość do 50-mililitrowych stożkowych probówek i odwiruj w temperaturze 4 000 Gs i czterech stopni Celsjusza przez sześć minut.

Po usunięciu większości supernatantu, połącz granulki w jedną probówkę, a następnie ponownie odwiruj i usuń cały supernatant. Aby przeprowadzić sekwencjonowanie o wysokiej przepustowości, należy przygotować PCR Master Mix i przenieść 23 mikrolitry do 10 probówek PCR. Dodaj jeden mikrolitr 0,5 nanograma na mikrolitr oczyszczonego plazmidowego DNA z kultury preselekcyjnej do probówek od pierwszej do piątej.

I od kultury selekcyjnej do probówek od szóstej do dziesiątej. Wymieszaj ze sobą 50 mikrolitrów 50 mikromolowych starterów ortogonalnych do przodu, OP1F do OP5F, z odpowiednimi starterami odwrotnie ortogonalnymi, OP1R do OP5R. W tej samej kolejności przenieś jeden mikrolitr do probówek PCR od pierwszego do piątego i od sześciu do dziesięciu.

Przenieś probówki PCR do termocyklera i uruchom następujący program. Następnie rozcieńczyć reakcje PCR 100-krotnie, przenosząc jeden mikrolitr z każdej probówki do 99 mikrolitrów wody. Dobrze wymieszaj, a następnie odpipetuj 99 mikrolitrów z probówek i wyrzuć.

Wymieszaj ze sobą 50 mikrolitrów starterów do przodu i do tyłu. Następnie przenieś jeden mikrolitr do probówek PCR od jednego do pięciu i od sześciu do 10. Następnie, po przygotowaniu PCR Master Mix, dodaj 23 mikrolitry do każdej probówki PCR i uruchom następujący program.

Aby przeprowadzić końcowe PCR w celu dodania sekwencji indeksujących, po 100-krotnym rozcieńczeniu reakcji PCR, jak poprzednio, i zachowaniu jednego mikrolitra, dodaj 23 mikrolitry PCR Master Mix. W przypadku probówek z matrycą pochodzącą z podgrup NNS od pierwszej do piątej, dodaj odpowiednio 0,5 mikrolitra starterów do przodu od 501F do 505F. W przypadku probówek z matrycą powstałą w wyniku hodowli wstępnej selekcji i selekcji należy dodać 0,5 mikrolitra starterów odwrotnych 701R i 702R.

Uruchom ten sam program PCR, jak właśnie wskazano. Następnie, po zmierzeniu stężeń każdej reakcji zgodnie z protokołem tekstowym, wymieszaj 100 nanogramów każdego produktu PCR w jednej probówce mikrowirówkowej. Po dodaniu 6-krotnego barwnika ładującego żel, załaduj całą, połączoną próbkę PCR na dwuprocentowy żel agarozowy.

I uruchom żel pod napięciem 100 woltów przez 50 minut. Używając oświetlacza UV o dużej długości fali, zwizualizuj, a następnie wytnij plasterek zawierający produkt PCR składający się z około 360 par zasad. Oczyść, uporządkuj i przeanalizuj próbkę zgodnie z protokołem tekstowym.

Mapa plazmidów dla pięciu zmodyfikowanych plazmidów pBR322 zawierających ortogonalne miejsca primingu jest pokazana tutaj. Testy specyficzności starterów ortogonalnych za pomocą PCR wykazały, że prawidłowy produkt PCR został uzyskany tylko wtedy, gdy pasujący plazmid został włączony do reakcji. I bez niego nie uzyskano żadnego produktu o jakiejkolwiek wielkości.

Po przetworzeniu eksperymentu uzyskano 6,2 razy 10 do szóstych odczytów z warunku wstępnej selekcji i 6,3 razy 10 do szóstego odczytu z warunku ampicyliny. Liczby dla każdej mutacji aminokwasu z warunku wstępnej selekcji pokazują rozkład logarytmiczno-normalny. Rysunek ten przedstawia względny efekt dopasowania, FIA, dla każdej mutacji w każdej pozycji TEM-one.

A jego dystrybucja jest pokazana tutaj. Pod selekcją w dawce 50 mikrogramów na mililitr ampicyliny, większość mutacji ma neutralny lub prawie neutralny efekt dopasowania. Odpowiada to białym pikselom tutaj i dużemu szczytowi tutaj.

Niewielka część mutacji przy tym stężeniu antybiotyku ma znaczący wpływ na kondycję. Zgodnie z oczekiwaniami obejmują one mutacje w obrębie wysoce konserwatywnych reszt miejsca aktywnego. W przeciwieństwie do tego, kilka pikseli wydaje się znacznie czerwonych.

Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu około tygodnia. Jeśli zostanie wykonany prawidłowo i wszystkie odczynniki są dostępne. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o zachowaniu porządku podczas klonowania, aby połączyć mutagenne produkty PCR w odpowiednie grupy i sklonować do właściwych wektorów.

A podczas przygotowania sekwencjonowania, aby użyć odpowiednich starterów. Wychodząc od tej procedury, główne etapy protokołu mogą zostać zmodyfikowane w celu zbadania kombinacji mutacji, różnych środowisk selekcyjnych i innych systemów białkowych, w celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania dotyczące genetycznej i środowiskowej zależności mutacji od kontekstu. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć pracę wymaganą do skonstruowania biblioteki mutagenezy nasycenia całych białek oraz do oceny funkcjonalnych skutków każdej mutacji jednocześnie, przy użyciu sekwencjonowania o wysokiej przepustowości.

Nie zapominaj, że praca z bromkiem etydyny i światłem ultrafioletowym może być niebezpieczna, a środki ostrożności, takie jak rękawice, fartuch laboratoryjny i osłona UV, powinny być zawsze podejmowane podczas wykonywania części tego protokołu.