Metoda ukierunkowanej ewolucji u Saccharomyces cerevisiae: tworzenie i badanie przesiewowe biblioteki mutantów

Ogólnym celem tego protokołu jest pokazanie, jak konstruować i badać biblioteki mutantów w Saccharomyces Cerevisiae do eksperymentów z ewolucją ukierunkowaną. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące tworzenia laboratoriów, wykorzystania w eksperymentach ukierunkowanej ewolucji, takich jak przypisywanie nakładających się obszarów podczas składania i klonowania. Główną zaletą tej techniki jest jej prostota i solidność, ponieważ w zaledwie jednym kroku transformacji można przypisać poziomy o dobrej jakości.

Ten protokół tworzenia i badania przesiewowego zmutowanych bibliotek zostanie zademonstrowany dla oksydazy arylo-alkoholowej lub AAO grzyba. Regiony dla ukierunkowanej ewolucji są najpierw wybierane za pomocą algorytmów obliczeniowych opartych na dostępnych modelach struktury krystalicznej lub homologii enzymu. Dwa regiony AAO będą celem losowej mutagenezy i rekombinacji: region M1 i region M2.