Name: Metoda ukierunkowanej ewolucji u Saccharomyces cerevisiae: tworzenie i badanie przesiewowe biblioteki mutantów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 50 s
Description: Poznaj metodę ukierunkowanej ewolucji w Saccharomyces cerevisiae z wykorzystaniem algorytmów obliczeniowych do selekcji regionów celowych. Protokół umożliwia szybkie tworzenie i przesiewanie bibliotek mutantów w jednym kroku transformacji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez projekt Komisji Europejskiej Indox-FP7-KBBE-2013-7-613549; a Cost-Action CM1303-Systems Biocatalysis; oraz Krajowe Projekty Dewry [BIO201343407-R] i Cambios [RTC-2014-1777-3].

1. Budowa biblioteki mutantów
<ol>
	<li>Wybierz regiony, które mają zostać poddane morfingowi, za pomocą algorytmów obliczeniowych opartych na dostępnych modelach struktury krystalicznej lub homologii18.
	<ol>
		<li>Tutaj celuj w dwa regiony AAO z Pleurotus eryngii w celu losowej mutagenezy i rekombinacji (Met[α1]-Val109, Phe392-Gln566), jednocześnie amplifikując pozostałą część genu (844 pz) za pomocą PCR o wysokiej wierności (Figura 1). 
		nuta: Kilka segmentów może być badanych za pomocą MORPHING w sposób niezależny lub łączony16.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wzmocnij docelowe obszary za pomocą mutagennego PCR. Twórz nakładające się obszary między segmentami (~50 pz każdy), nakładając na siebie reakcje PCR zdefiniowanych regionów.
	<ol>
		<li>Przygotować mutagenny PCR docelowych segmentów w końcowej objętości 50 μl zawierający matrycę DNA (0,92 ng/μl), 90 nM oligo sense (RMLN dla segmentu M-I i AAO-BP dla segmentu M-II), starter antysensowny 90 nM (AAO-92C dla segmentu M-I i RMLC dla segmentu M-II), 0,3 mM dNTP (0,075 mM każdy), 3% (v/v) dimetylosulfotlenek (DMSO), 1,5 mM MgCl2, 0,05 mM MnCl2 i 0,05 U/μl polimerazy DNA Taq. Sekwencje starterów są szczegółowo opisane na rysunku 1.</li>
		<li>Użyj następującego programu PCR: 95 °C przez 2 minuty (1 cykl); 95 °C przez 45 sekund, 50 °C przez 45 sekund, 74 °C przez 45 sekund (28 cykli) i 74 °C przez 10 minut (1 cykl).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Amplifikuj regiony niemutagenne za pomocą polimerazy o ultrawysokiej wierności i uwzględnij odpowiednie obszary nakładające się na segmenty mutagenne i/lub zlinearyzowane zwisy wektorowe.
	<ol>
		<li>Przygotować mieszaniny reakcyjne w końcowej objętości 50 μl zawierające: matrycę DNA (0,2 ng/μl), 250 nM oligo sense HFF, 250 nM oligo antisense HFR, 0,8 mM dNTP (po 0,2 mM), 3% (v/v) dimetylosulfotlenek (DMSO) i 0,02 U/μl iproof polimerazy DNA. Sekwencje starterów są szczegółowo opisane na rysunku 1.</li>
		<li>Użyj następującego programu PCR: 98 °C przez 30 sekund (1 cykl); 98 °C przez 10 sekund, 55 °C przez 25 sekund, 72 °C przez 45 sekund (28 cykli) i 72 °C przez 10 minut (1 cykl). 
		nuta: Z warunkami opisanymi w 1.2 i 1.3 nakładanie się 43 pz (region plazmidu-M1); 46 pz (region M1-HF); 47 pz (region HF-M2) i 61 pz (region M2-plazmid) są zaprojektowane (ryc. 1), aby sprzyjać splicingowi in vivo w drożdżach.</li>
		<li>Oczyść wszystkie fragmenty PCR (mutagenne i niemutagenne) za pomocą dostępnego w handlu zestawu do ekstrakcji żelu zgodnie z protokołem producenta.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Linearyzuj wektor w taki sposób, aby powstały regiony flankujące o długości około 50 pz, które są homologiczne do końców 5' i 3' genu docelowego.
	<ol>
		<li>Przygotować mieszaninę reakcyjną linearyzacji zawierającą 2 μg DNA, 7,5 U BamHI, 7,5 U XhoI, 20 μg BSA i 2 μl buforu BamHI 10x w końcowej objętości 20 μl.</li>
		<li>Mieszaninę reakcyjną inkubować w temperaturze 37 °C przez 2 godziny i 40 minut, a następnie inaktywować w temperaturze 80 °C przez 20 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oczyść zlinearyzowany wektor przez ekstrakcję żelu agarozowego, aby uniknąć zanieczyszczenia resztkowym kolistym plazmidem (ryc. 2).
	<ol>
		<li>Załadować mieszaninę reakcyjną z mineralizacji do mega-studzienki półpreparatywnego żelu agarozowego o niskiej temperaturze topnienia (0,75%, w:v), a także podwielokrotność (5 μl) mieszaniny reakcyjnej w sąsiednim studzience jako reporter.</li>
		<li>Uruchomić elektroforezę DNA (5 V/cm między elektrodami, 4 oC) i oddzielić żel agarozowy odpowiadający mega-studzience i przechowywać go w temperaturze 4 oC w 1x TAE.</li>
		<li>Plamić pas za pomocą drabiny o masie cząsteczkowej i reportera. Wizualizuj opaski w świetle UV. Zaznacz pozycję, w której umieszcza wektor linearyzowany. 
		nuta: Ponieważ jakość oczyszczonego wektora linearyzowanego jest krytycznym czynnikiem dla udanej rekombinacji i składania w drożdżach, należy unikać barwienia żelem w przypadku półpreparatywnej elektroforezy DNA. Stosowanie barwników i ekspozycji na promieniowanie UV do ekstrakcji żelu może wpływać na stabilność wektora DNA, pogarszając skuteczność rekombinacji in vivo. Jako alternatywa dla toksycznych barwników EtBr, barwniki Gel Red i SYBR są powszechnie stosowane do barwienia żelu.</li>
		<li>W przypadku braku światła UV zidentyfikuj zlinearyzowany wektor we fragmencie mega-studzienki, korzystając ze wskazówek nacięć w zabarwionym pasie reporterowym, aby można go było wyizolować.</li>
		<li>Wyekstrahuj zlinearyzowany wektor z agarozy i oczyść go za pomocą dostępnego w handlu zestawu do ekstrakcji żelu zgodnie z protokołem producenta. 
		nuta: Użyj wektorów episomalnych o wysokiej kopii z markerami antybiotykowymi i auksotrofiami: W tym przykładzie zastosowaliśmy wektor pJRoC30 niezależny od uracylu i oporny na ampicylinę, pod kontrolą drożdżowego promotora GAL1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj równomolową mieszaninę fragmentów PCR i wymieszaj ją ze zlinearyzowanym wektorem w stosunku 2:1, z nie mniej niż 100 ng zlinearyzowanego plazmidu (przetestuj różne proporcje biblioteki równomolowej / wektora otwartego, aby uzyskać dobrą wydajność transformacji).
	<ol>
		<li>Zmierzyć absorbancję fragmentów PCR i wektora linearyzowanego przy 260 nm i 280 nm, aby określić ich stężenie i czystość.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przekształć kompetentne komórki drożdży za pomocą mieszaniny DNA za pomocą komercyjnego zestawu do transformacji drożdży (patrz tabela materiałów eksploatacyjnych) zgodnie z instrukcjami producenta.
	<ol>
		<li>W tym przypadku należy użyć szczepu S. cerevisiae z niedoborem proteazy i zależnego od URA3, BJ5465. Przekształć komórki z macierzystym wektorem kołowym jako wewnętrznym wzorcem podczas badań przesiewowych (patrz poniżej). Dodatkowo sprawdź tło, przekształcając zlinearyzowany wektor w przypadku braku fragmentów PCR. 
		nuta: W przypadku wykrycia początkowego niskiego poziomu wydzielania, należy użyć szczepów z niedoborem proteazy S. cerevisiae, takich jak BJ5465, aby sprzyjać akumulacji aktywnego białka w supernatantach hodowlanych. Jeśli docelowy enzym ulega hiperglikozylacji, odpowiednią opcją może być zastosowanie szczepów z niedoborem glikozylacji (np. Δkre2, który jest zdolny do przyłączania tylko mniejszych oligomerów mannozy).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieścić przekształcone komórki na płytkach SC i inkubować je w temperaturze 30 °C przez trzy dni. Płytki (na płytkach SC z dodatkiem uracylu) Komórki URA3-S. cerevisiae pozbawione plazmidu jako kontrola ujemna do badań przesiewowych (patrz poniżej).</li>
</ol>
2. Wysokoprzepustowy test przesiewowy (Rysunek 3)
<ol>
	<li>Napełnij odpowiednią liczbę sterylnych 96-dołkowych płytek (23 płytki do analizy biblioteki 2000 klonów) minimalną ilością 50 μl pożywki na dołek za pomocą robota pipetującego.</li>
	<li>Zbierz poszczególne kolonie z płytek SC-drop out i przenieś je do płytek 96-dołkowych.
	<ol>
		<li>Na każdej płytce zaszczepić kolumnę nr 6 typem rodzicielskim jako wzorcem wewnętrznym i dobrze H1 komórkami URA3-S. cerevisiae (w pożywce SC uzupełnionej uracylem) bez plazmidu jako kontroli ujemnej. 
		nuta: Studnia H1 jest wypełniona specjalnie pożywką drop-out uzupełnioną uracylem. Ślepa studzienka zawierająca pożywkę bez komórek może być również przygotowana jako dodatkowa kontrola sterylności.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przykryj talerze pokrywkami i zawiń je w Parafilm. Inkubować płytki przez 48 godzin w temperaturze 30 °C, 225 obr./min i wilgotności względnej 80% w wilgotnym wytrząsarce.</li>
	<li>Usuń Parafilm, dodaj 160 μl pożywki do każdego dołka za pomocą robota pipetującego, ponownie uszczelnij płytki i inkubuj je przez kolejne 24 godziny. 
	nuta: Pożywkę minimalną i pożywkę do wyrażania przygotowuje się zgodnie z opisem w innym miejscu19. Poziomy wydzielania mogą się różnić w zależności od badanego genu i w związku z tym czas inkubacji musi być zoptymalizowany w każdym przypadku, aby zsynchronizować wzrost komórek we wszystkich studzienkach.</li>
	<li>Odwirować płytki (płytki wzorcowe) przy 2 800 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przenieść 20 μl supernatantu z dołków w płytce głównej na płytkę repliki za pomocą wielofunkcyjnej stacji do obsługi cieczy. 
	nuta: Aby sprzyjać wydzielaniu enzymów, zaleca się zastąpienie natywnego peptydu sygnałowego białka docelowego peptydami sygnałowymi powszechnie stosowanymi do ekspresji heterologicznej w drożdżach (np. α czynnik prepro-lider, lider toksyny K1 Killer z S. cerevisiae, a nawet chimeryczne wersje obu peptydów13). Alternatywnie, natywny peptyd sygnałowy może być ewoluowany wyłącznie do wydzielania w drożdżach.</li>
	<li>Za pomocą robota pipetującego dodać 20 μl 2 mM alkoholu p-metoksybenzylowego do 100 mM buforu fosforanowego o pH 6,0. Krótko wymieszać płytki w 96-dołkowym mieszadle płytkowym i inkubować je przez 30 minut w temperaturze suchej masy.</li>
	<li>Za pomocą robota pipetującego dodać 160 μl odczynnika FOX do każdej płytki repliki i krótko wymieszać z mieszalnikiem (końcowe stężenie mieszaniny FOX w studzince: 100 μM oranżu ksylenolowego, 250 μM Fe(NH4)2(SO4)2 i 25 mM H2SO4).
	<ol>
		<li>Dodaj kilka dodatków do odczynnika, aby zwiększyć czułość, takich jak współrozpuszczalniki organiczne (DMSO, etanol, metanol) lub sorbitol17. W tym przypadku wzmocnij odpowiedź, dodając sorbitol do końcowego stężenia 100 mM (ryc. 4).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odczyt tabliczek (tryb punktu końcowego, t0) przy długości fali 560 nm na czytniku płytek.</li>
	<li>Inkubować płytki w temperaturze pokojowej, aż do uzyskania koloru i ponownie zmierzyć absorpcję (t1).
	<ol>
		<li>Obliczyć względną aktywność na podstawie różnicy między wartością Abs po inkubacji a wartością początkowego pomiaru znormalizowanego do typu rodzicielskiego dla każdej płytki (Δt1 - t0).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Poddaj najlepsze trafienia mutantów dwóm kolejnym ponownym badaniom przesiewowym, aby wykluczyć fałszywe alarmy. 
	nuta: Zazwyczaj ponowne badania przesiewowe obejmują izolację plazmidu od drożdży, amplifikację i oczyszczanie w Escherichia coli, a następnie transformację świeżych komórek drożdży z plazmidem19. Każdy wybrany klon jest ponownie przesiewany w pentaplikacie.</li>
</ol>

<ol><li>Jäckel, C., Hilvert, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biocatalysts+by+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Biocatalysts by evolution.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 21 (6), 753-759 (2010).</li>
<li>Bornscheuer, U. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+the+third+wave+of+biocatalysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Engineering the third wave of biocatalysis.</a> Nature. 485 (7397), 185-194 (2012).</li>
<li>Renata, H., Wang, Z. W., Arnold, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+enzyme+universe%3A+accessing+non-natural+reactions+by+mechanism-guided+directed+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Expanding the enzyme universe: accessing non-natural reactions by mechanism-guided directed evolution.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 54 (11), 3351-3367 (2015).</li>
<li>Cobb, R. E., Chao, R., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution%3A+past%2C+present+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22AIChE+J%22%5BJournal%5D)">Directed evolution: past, present and future.</a> AIChE J. 59 (5), 1432-1440 (2013).</li>
<li>Abatemarco, J., Hill, A., Alper, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+metabolic+engineering+toolbox+with+directed+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+J%22%5BJournal%5D)">Expanding the metabolic engineering toolbox with directed evolution.</a> Biotechnol. J. 8 (12), 1397-1410 (2013).</li>
<li>Pourmir, A., Johannes, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution%3A+selection+of+the+host+organism%5BTitle%5D)+AND+%22Comput+Struct+Biotechnol+J%22%5BJournal%5D)">Directed evolution: selection of the host organism.</a> Comput Struct Biotechnol J. 2 (3), e201209012(2012).</li>
<li>Krivoruchko, A., Siewers, V., Nielsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opportunities+for+yeast+metabolic+engineering%3A+lessons+from+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+J%22%5BJournal%5D)">Opportunities for yeast metabolic engineering: lessons from synthetic biology.</a> Biotechnol J. 6 (3), 262-276 (2011).</li>
<li>Gonzalez-Perez, D., Garcia-Ruiz, E., Alcalde, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saccharomyces+cerevisiae+in+directed+evolution%3A+an+efficient+tool+to+improve+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Bioeng+Bugs%22%5BJournal%5D)">Saccharomyces cerevisiae in directed evolution: an efficient tool to improve enzymes.</a> Bioeng Bugs. 3, 172-177 (2012).</li>
<li>Alcalde, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutagenesis+protocols+in+Saccharomyces+cerevisiae+by+In+Vivo+Overlap+Extension%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Mutagenesis protocols in Saccharomyces cerevisiae by In Vivo Overlap Extension.</a> Methods Mol. Biol. 634, 3-14 (2010).</li>
<li>Bulter, T., Alcalde, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparing+libraries+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Preparing libraries in Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods. Mol. Biol. 231, 17-22 (2003).</li>
<li>Ostrov, N., Wingler, L. M., Cornish, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+assembly+and+combinatorial+libraries+in+S.+cerevisiae+via+reiterative+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Gene assembly and combinatorial libraries in S. cerevisiae via reiterative recombination.</a> Methods. Mol. Biol. 978, 187-203 (2013).</li>
<li>Shao, Z., Zhao, H., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+assembler%2C+an+in+vivo+genetic+method+for+rapid+construction+of+biochemical+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">DNA assembler, an in vivo genetic method for rapid construction of biochemical pathways.</a> Nucleic Acids Res. 37 (2), e16(2009).</li>
<li>Alcalde, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+the+ligninolytic+enzyme+consortium%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Engineering the ligninolytic enzyme consortium.</a> Trends Biotechnol. 33 (3), 155-162 (2015).</li>
<li>Garcia-Ruiz, E. Directed evolution of ligninolytic oxidoreductases: from functional expression to stabilization and beyond. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGarcia-Ruiz%2C+E+%22Cascade+Biocatalysis%3A+integrating+stereoselective+and+environmentally+friendly+reactions%22">Cascade Biocatalysis: integrating stereoselective and environmentally friendly reactions</a>. , Wiley-VCH. 1-22 (2014).</li>
<li>Hernandez-Ortega, A., Ferreira, P., Martinez, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fungal+aryl-alcohol+oxidase%3A+a+peroxide-producing+flavoenzyme+involved+in+lignin+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Microbiol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Fungal aryl-alcohol oxidase: a peroxide-producing flavoenzyme involved in lignin degradation.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 93 (4), 1395-1410 (2012).</li>
<li>Gonzalez-Perez, D., Molina-Espeja, P., Garcia-Ruiz, E., Alcalde, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutagenic+organized+recombination+process+by+homologous+in+vivo+grouping+%28MORPHING%29+for+directed+enzyme+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mutagenic organized recombination process by homologous in vivo grouping (MORPHING) for directed enzyme evolution.</a> PLoS One. 9, e90919(2014).</li>
<li>Rhee, S. G., Chang, T., Jeong, W., Kang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+Detection+and+Measurement+of+Hydrogen+Peroxide+Inside+and+Outside+of+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cells%22%5BJournal%5D)">Methods for Detection and Measurement of Hydrogen Peroxide Inside and Outside of Cells.</a> Mol. Cells. 29 (6), 539-549 (2010).</li>
<li>Sebestova, E., Bendl, J., Brezovsky, J., Damborsky, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+tools+for+designing+smart+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Computational tools for designing smart libraries.</a> Methods. Mol. Biol. 1179, 291-314 (2014).</li>
<li>Viña-Gonzalez, J., Gonzalez-Perez, D., Ferreira, P., Martinez, A. T., Alcalde, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focused+directed+evolution+of+aryl-alcohol+oxidase+in+yeast+using+chimeric+signal+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Focused directed evolution of aryl-alcohol oxidase in yeast using chimeric signal peptides.</a> Appl. Environ. Microbiol. , (2015).</li>
<li>Gay, C., Collins, J., Gebicki, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydroperoxide+Assay+with+the+Ferric-Xylenol+orange+Complex%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Hydroperoxide Assay with the Ferric-Xylenol orange Complex.</a> Anal. Biochem. 273 (2), 149-155 (1999).</li>
<li>Reetz, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biocatalysis+in+organic+chemistry+and+biotechnology%3A+Past%2C+present%2C+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Biocatalysis in organic chemistry and biotechnology: Past, present, and future.</a> J. Am. Chem. Soc. 135 (34), 12480-12496 (2013).</li>
<li>Mate, D. M., Gonzalez-Perez, D., Mateljak, I., Gomez de Santos, P., Vicente, A. I., Alcalde, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pocket+manual+of+directed+evolution%3A+Tips+and+tricks%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+of+Microbial+Enzymes%3A+Production%2C+Biocatalysis+and+Industrial+Applications%22%5BJournal%5D)">The pocket manual of directed evolution: Tips and tricks.</a> Biotechnology of Microbial Enzymes: Production, Biocatalysis and Industrial Applications. , Elsevier. Forthcoming Forthcoming.</li>
<li>Chao, R., Yuan, Y., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+DNA+assembly+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Yeast+Res%22%5BJournal%5D)">Recent advances in DNA assembly technologies.</a> FEMS Yeast Res. 15, 1-9 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym artykule podsumowaliśmy większość wskazówek i sztuczek stosowanych w naszym laboratorium w celu inżynierii enzymów poprzez ukierunkowaną ewolucję u S. cerevisiae (na przykładzie AAO), tak aby można je było dostosować do użytku z wieloma innymi systemami enzymów eukariotycznych, po prostu postępując zgodnie z powszechnym podejściem opisanym tutaj.
Jeśli chodzi o tworzenie bibliotek, MORPHING jest szybką, jednoetapową metodą wprowadzania i rekombinacji losowych mutacji w małych od...

Ukierunkowana ewolucja molekularna to solidna, szybka i niezawodna metoda projektowania enzymów1, 2. Poprzez iteracyjne rundy losowych mutacji, rekombinacji i badań przesiewowych można wygenerować ulepszone wersje enzymów, które działają na nowe substraty, w nowych reakcjach, w środowisku nienaturalnym, a nawet pomagają komórce osiągnąć nowe cele metaboliczne3-5. Wśród gospodarzy wykorzystywanych w ewolucji ukierunkowanej, drożdże piwne Saccharomyces cerevisiae oferują repertuar roztworów do funkcjonalnej ekspresji złożonych białek eukariotycznych, które nie są inaczej dostępne w prokariotycznych odpowiednikach6,7.
Używany wyczerpująco w badaniach nad biologią komórki, ten mały model eukariotyczny ma wiele zalet pod względem modyfikacji potranslacyjnych, łatwości manipulacji i efektywności transformacji, z których wszystkie są ważnymi cechami dla inżynierii enzymów przez ukierunkowaną ewolucję8. Co więcej, wysoka częstotliwość rekombinacji homologicznego DNA u S. cerevisiae w połączeniu z wydajnym aparatem do korekty otwiera szeroki wachlarz możliwości tworzenia bibliotek i składania genów in vivo, sprzyjając ewolucji różnych systemów, od pojedynczych enzymów do złożonych sztucznych szlaków9-12. Nasze laboratorium poświęciło ostatnią dekadę na projektowanie narzędzi i strategii ewolucji molekularnej różnych ligninaz w drożdżach (oksydoreduktazy biorących udział w degradacji ligniny podczas naturalnego rozkładu drewna)13-14. W niniejszym komunikacie przedstawiamy szczegółowy protokół przygotowania i badań przesiewowych zmutowanych bibliotek u S. cerevisiae pod kątem modelowej flawooksydazy, oksydazy -aryloalkoholowej (AAO15)-, którą można łatwo przetłumaczyć na wiele innych enzymów. Protokół obejmuje metodę ukierunkowanej ewolucji (MORPHING: Mutagenic Organized Recombination Process by Homologous in vivo Grouping) wspomaganą przez aparat komórkowy drożdży16 oraz bardzo czuły test przesiewowy oparty na reakcji Fentona w celu wykrycia aktywności AAO wydzielanej do bulionu hodowlanego17.

<table><tbody><tr><td><silny>1. Pożywki hodowlane</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin sól sodowa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0166</td><td>CAS N&ordm; 69-52-3 M.W. 371.39</td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>Difco</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Cloramphenicol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0378</td><td>CAS N&ordm; 56-75-7 M.W. 323.13</td></tr><tr><td>D-(+)-Galactose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G0750</td><td>CAS N&ordm; 59-23-4 M.W. 180.16</td></tr><tr><td>D-(+)-Glukoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767</td><td>CAS N&ordm; 50-99-7 M.W. 180.16</td></tr><tr><td>D-(+)-rafinoza pentahydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83400</td><td>CAS N&ordm; 17629-30-0 M.W. 594.51</td></tr><tr><td>Pepton</td><td>Difco</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan potasu jednozasadowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662</td><td>CAS N&ordm; 7778-77-0 M.W. 136.09</td></tr><tr><td>Uracyl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>U1128</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy</td><td>Difco</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>Drożdżowa baza azotowa bez aminokwasów</td><td>Difco</td><td>291940</td><td></td></tr><tr><td>Syntetyczne suplementy drożdżowe bez uracylu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y1501</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>2. Reakcje PCR</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>dNTP Mix</td><td>Agilent genomics</td><td>200415-51</td><td>25 mM każdy</td></tr><tr><td>iProof Polimeraza DNA o wysokiej wierności</td><td>Bio-rad</td><td>172-5301</td><td></td></tr><tr><td>Tetrahydrat chlorku manganu(II)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8054</td><td>CAS N&ordm; 13446-34-9 MWW 197.91</td></tr><tr><td>Taq DNA Polimeraza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4545</td><td>Dla błędu podatny PCR</td></tr><tr><td><silny>Nazwa</silny><</td><td>silny>Firma</silny></td><td><silny>Numer katalogowy</silny></td><td><silny>Komentarze</silny></td></tr><tr><td><silny>3. Linearyzacja plazmidu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Enzym restrykcyjny BamHI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0136S</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>New England Biolabs</td><td>B9001S</td><td></td></tr><tr><td>Enzym restrykcyjny XhoI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0146S</td><td></td></tr><tr><td>Enzym restrykcyjny Not I</td> New <td>England Biolabs</td><td>R0189S</td><td></td></tr><tr><td>Gel Red</td><td>Biotium</td><td>41003</td><td>Do barwienia DNA</td></tr><<tr><td>strong>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</strong</td></tr><tr><td>>4. Testy FOX</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ammonium siarczan żelaza(II)</td><td>sześciowodny Sigma-Aldrich</td><td>F3754</td><td>CAS N&ordm; 7783-85-9 M.W. 392.14</td></tr><tr><td>Anysil Alcohol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W209902</td><td>CAS N&ordm; 105-13-5 M.W. 138.16</td></tr><tr><td>D-Sorbitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1876</td><td>CAS N&ordm; 50-70-4 M.W. 182.17</td></tr><tr><td>Nadtlenek wodoru 30%</td><td>Merck Millipore</td><td>1072090250</td><td>FOX krzywa standardowa</td></tr><tr><td>Ksylenol Pomarańczowa sól disodowa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>52097</td><td>CAS N&ordm; 1611-35-4 M.W. 716.62</td></tr><tr><td><silny>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>5. Żel agarozowy stuff</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Norgen</td><td>28035</td><td>CAS N&ordm; 9012-36-6</td></tr><tr><td>Gel Red</td><td>Biotium</td><td>41003</td><td>Barwnik do analizy DNA</td></tr><tr><td>GeneRuler 1kb Ladder</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM0311</td><td>DNA M.W. standard</td></tr><tr><td>Barwnik ładujący 6x</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0611</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza o niskiej temperaturze topnienia</td><td>Bio-rad</td><td>161-3112</td><td>CAS N&ordm; 39346-81-1</td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Company</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>6. Zestawy i komórki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>S. cerevisiae szczep BJ5465</td><td>LGC Promochem</td><td>ATTC 208289</td><td>Szczep z niedoborem proteazy o genotypie: MAT&alpha; ura3-52 trp1 leu2-delta1 his3-delta200 pep4::HIS3 prb1-delta1.6R can1 GAL</td></tr><tr><td>E. coli XL2-Blue kompetentne komórki</td><td>Agilent genomics</td><td>200150</td><td>Do oczyszczania i amplifikacji plazmidu</td></tr><tr><td>NucleoSpin Gel i zestaw</td> <td>do czyszczenia PCRMacherey-Nagel</td><td>740,609,250</td><td>Ekstrakcja żelu DNA</td></tr><tr><td>Zestaw plazmidów NucleoSpin</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740,588,250</td><td>Zestaw miniprep kolumny</td></tr><tr><td>Zestaw do transformacji drożdży</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>YEAST1-1KT</td><td>W zestawie nośnik DNA (jądra łososia)</td></tr><tr><td>Zymoprep miniprep plazmidu drożdżowego I</td><td>Badania Zymo</td><td>D2001</td><td>Ekstrakcja plazmidu z drożdży</td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Company<</td><td>strong>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>7. Płytki</mocne></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowe</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655101</td><td>Przezroczyste, niesterylne, polistyrenowe (do pomiarów aktywności)</td></tr><tr><td>Płytki 96-dołkowe</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655161</td><td>Przezroczyste, sterylne, polistyrenowe (do mikrofermentacji)</td></tr><tr><td>Pokrywka płytki 96-dołkowej</td><td>Greiner Bio-One</td><td>656171</td><td>Clear, sterylna, polistyren (do mikrofermentacji)</td></tr></tbody></table>

metoda ukierunkowanej ewolucji u saccharomyces cerevisiae: tworzenie i badanie przesiewowe biblioteki mutantów

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

Ukierunkowana ewolucja u Saccharomyces cerevisiae oferuje wiele atrakcyjnych korzyści podczas projektowania enzymów do zastosowań biotechnologicznych, procesu, który obejmuje budowę, klonowanie i ekspresję zmutowanych bibliotek, w połączeniu z homologiczną rekombinacją DNA o wysokiej częstotliwości in vivo. W tym miejscu przedstawiamy protokół tworzenia i badania przesiewowego zmutowanych bibliotek drożdży na przykładzie grzybowej oksydazy aryloalkoholowej (AAO) w celu zwiększenia jej całkowitej aktywności. Dwa segmenty białka poddano ukierunkowanej ewolucji poprzez mutagenezę losową i rekombinację DNA in vivo. Zwisy ~50 pz po bokach każdego segmentu pozwoliły na prawidłowe ponowne złożenie genu fuzji AAO w zlinearyzowany wektor, dając początek pełnemu autonomicznie replikującemu się plazmidowi. Biblioteki mutantów wzbogacone o funkcjonalne warianty AAO poddano badaniom przesiewowym w supernatantach S. cerevisiae za pomocą czułego wysokoprzepustowego testu opartego na reakcji Fentona. Opisany tutaj ogólny proces budowy biblioteki u S. cerevisiae może być łatwo zastosowany do ewolucji wielu innych genów eukariotycznych, unikając dodatkowych reakcji PCR, rekombinacji DNA in vitro i etapów ligacji.

AAO z P. eryngii to zewnątrzkomórkowa flawooksydaza, która dostarcza grzybowym peroksydazom H2O2 w celu zainicjowania degradacji ligniny. Dwa segmenty AAO poddano ukierunkowanej ewolucji metodą MORPHING w celu zwiększenia jej aktywności oraz ekspresji w S. cerevisiae 19. Niezależnie od obcych enzymów występujących w S. cerevisiae, najbardziej krytyczną kwestią przy tworzeniu bibliotek mutantów w drożdżach jest zaprojektowanie spe...

Przedstawiamy szczegółowy protokół do konstruowania i sprawdzania bibliotek mutantów dla kampanii ukierunkowanej ewolucji u Saccharomyces cerevisiae.

Metoda ukierunkowanej ewolucji u Saccharomyces cerevisiae: tworzenie i badanie przesiewowe biblioteki mutantów

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest przedstawienie sposobu konstruowania i przesiewania bibliotek mutantów w Saccharomyces Cerevisiae na potrzeby eksperymentów z ewolucji sterowanej. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania podczas tworzenia materiałów laboratoryjnych do ukierunkowanych eksperymentów z ewolucją sterowaną, takich jak sposób wyznaczania obszarów nakładania się podczas składania i klonowania. Główną zaletą tej techniki jest jej prostota i niezawodność, ponieważ w zaledwie jednym kroku transformacji można uzyskać materiały o dobrej jakości.Niniejszy protokół tworzenia i przesiewania bibliotek mutantów zostanie zademonstrowany na przykładzie grzybowej oksydazy alkoholi arylowych (AAO). Regiony do ukierunkowanej ewolucji są najpierw wybierane przy pomocy algorytmów obliczeniowych w oparciu o dostępną strukturę krystaliczną lub modele homologiczne enzymu. Celem randomowej mutogenezy i rekombinacji będą dwa regiony AAO: region M1 oraz region M2.W celu amplifikacji docelowych obszarów przeprowadzona zostanie mutagenna reakcja PCR. Aby umożliwić splicing in vivo w drożdżach, poprzez nakładanie na siebie reakcji PCR zdefiniowanych regionów stworzone zostaną

directed-evolution-method-saccharomyces-cerevisiae-mutant-library

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W niniejszym materiale przedstawiamy prosty protokół tworzenia losowej biblioteki mutantów dla określonej sekwencji docelowej. Pokazujemy, w jaki sposób metoda ta, realizowana in vivo w Escherichia coli, może być łączona z selekcją funkcjonalną w celu wyewoluowania nowych aktywności enzymatycznych.

Protokoły mutagenezy i selekcji funkcjonalnej dla ewolucji sterowanej białek w E. coli

Opracowaliśmy kompleksowe, nieobciążone systematycznie badania przesiewowe całego genomu, aby zrozumieć interakcje gen-lek oraz gen-środowisko. Przedstawiono metody przesiewania tych kolekcji mutantów.

Konkurencyjne przesiewy genomiczne z zastosowaniem bibliotek drożdży z kodami kreskowymi

Opracowano nową metodę ewolucji kierowanej, specyficzną dla dziedziny inżynierii termostabilności, a następnie zwalidowano ją dla enzymów bakteriolitycznych. Po zaledwie jednej rundzie mutagenezy losowej ewoluowany enzym bakteriolityczny, PlyC 29C3, wykazał ponad dwukrotnie wyższą aktywność resztkową w porównaniu z białkiem typu dzikiego po inkubacji w podwyższonej temperaturze.

Nowa metoda przesiewowa dla ewolucji sterowanej termostabilnych enzymów bakterio();tycznych

Ten artykuł opisuje szczegółową metodologię losowej mutagenezy docelowego genu u drożdży rozszczepieniowych. Jako przykład celujemy w rpt4 +, który koduje podjednostkę proteasomu 19S i badamy pod kątem mutacji, które destabilizują heterochromatynę.

Mutageneza losowa ukierunkowana na geny w celu wyselekcjonowania mutantów proteasomów destabilizujących heterochromatynę w drożdżach rozszczepieniowych

Ten artykuł przedstawia metodę opartą na kojarzeniu, która ułatwia badanie przesiewowe nadekspresji u pączkujących drożdży przy użyciu biblioteki plazmidów z tablicą.

Badania przesiewowe biblioteki nadekspresji opartej na kryciach u drożdży

Prezentujemy prosty protokół ekranu tłumiącego w drożdżach rozszczepienia. Metoda ta jest skuteczna, wolna od mutagenów i selektywna w przypadku mutacji, które często występują w pojedynczym locus genomu. Protokół jest odpowiedni do izolowania supresorów, które łagodzą defekty wzrostu w płynnej kulturze, które są spowodowane mutacją lub lekiem.

Wspomagane głębokim sekwencjonowaniem, spontaniczne badanie supresorowe w drożdżach rozszczepienia Schizosaccharomyces pombe

Endonukleazy restrykcyjne o nowej specyficzności sekwencji mogą być rozwijane z enzymów rozpoznających częściowo zdegenerowaną sekwencję. Tutaj przedstawiamy szczegółowy protokół, który z powodzeniem wykorzystaliśmy do zmiany specyficzności sekwencji enzymu NlaIV. Kluczowymi składnikami protokołu są podział in vitro na przedziały reakcji transkrypcji/translacji oraz wybór wariantów o nowej specyficzności sekwencji.

Ukierunkowana ewolucja endonukleazy restrykcyjnej in vitro o bardziej rygorystycznej swoistości

Ta praca opisuje protokół dla wielokopijnego badania genetycznego supresorowego u Schizosaccharomyces pombe. To badanie przesiewowe wykorzystuje bibliotekę plazmidów obejmującą cały genom do identyfikacji klonów supresorowych fenotypu utraty funkcji związanego ze zmutowanym szczepem zapytania. Za pomocą tego badania przesiewowego zidentyfikowano nowe supresory genetyczne mutanta zerowego ell1.

Genetyczne badanie przesiewowe do identyfikacji wielokopijnych supresorów u Schizosaccharomyces pombe

Interakcje biomolekuł, takie jak interakcje białko-białko, są molekularną podstawą funkcji biologicznych. Jeśli uda się wyizolować mutanty bez interakcji/upośledzone, które specyficznie nie mają odpowiedniej interakcji, znacznie pomogą one w zrozumieniu funkcji tej interakcji. W tym artykule przedstawiono skuteczny sposób izolowania mutantów bez interakcji/z upośledzeniem.

Izolowanie mutantów o zerowej interakcji/upośledzonych przy użyciu testu dwuhybrydowego drożdży

Ten protokół opisuje podstawowe kroki do przeprowadzenia kampanii selekcji powierzchni drożdży w celu wzbogacenia wariantów białek wiążących się z interesującym nas antygenem.

Inżynieria białkowa za pomocą wyświetlacza powierzchni drożdży

Poznaj metodę ukierunkowanej ewolucji w Saccharomyces cerevisiae z wykorzystaniem algorytmów obliczeniowych do selekcji regionów celowych. Protokół umożliwia szybkie tworzenie i przesiewanie bibliotek mutantów w jednym kroku transformacji.

Metoda ukierunkowanej ewolucji u Saccharomyces cerevisiae: tworzenie i badanie przesiewowe biblioteki mutantów

Przeglądaj więcej filmów