Metoda ukierunkowanej ewolucji u Saccharomyces cerevisiae: tworzenie i badanie przesiewowe biblioteki mutantów

Ogólnym celem tego protokołu jest pokazanie, jak konstruować i badać biblioteki mutantów w Saccharomyces Cerevisiae do eksperymentów z ewolucją ukierunkowaną. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące tworzenia laboratoriów, wykorzystania w eksperymentach ukierunkowanej ewolucji, takich jak przypisywanie nakładających się obszarów podczas składania i klonowania. Główną zaletą tej techniki jest jej prostota i solidność, ponieważ w zaledwie jednym kroku transformacji można przypisać poziomy o dobrej jakości.

Ten protokół tworzenia i badania przesiewowego zmutowanych bibliotek zostanie zademonstrowany dla oksydazy arylo-alkoholowej lub AAO grzyba. Regiony dla ukierunkowanej ewolucji są najpierw wybierane za pomocą algorytmów obliczeniowych opartych na dostępnych modelach struktury krystalicznej lub homologii enzymu. Dwa regiony AAO będą celem losowej mutagenezy i rekombinacji: region M1 i region M2.

Zostanie przeprowadzony mutagenny PCR w celu amplifikacji docelowych obszarów. Aby promować splicing in vivo w drożdżach, nakładające się obszary między segmentami po około 50 par zasad każdy zostaną utworzone przez nałożenie reakcji PCR zdefiniowanych regionów. Przygotuj mutagenne PCR o objętości 50 mikrolitrów, z których każdy zawiera 46 nanogramów matrycy DNA, po 90 nanomolowych starterów sensownych i antysensownych, 0,3 milimola DNTP, 3% DMSO, 1,5 milimola chlorku magnezu, 05 milimola chlorku manganu i 05 jednostek na mikrolitr polimerazy DNA tack

Użyj następującego programu PCR. 95 stopni Celsjusza przez dwie minuty, 95 stopni Celsjusza przez 45 sekund, 50 stopni Celsjusza przez 45 sekund i 74 stopnie Celsjusza przez 45 sekund przez 28 cykli i 74 stopnie Celsjusza przez 10 minut. Pozostała część genu AAO, region HF, zostanie amplifikowany przez PCR o wysokiej wierności z odpowiednimi obszarami nakładającymi się na segmenty mutagenne i/lub linearyzowanymi zwisami wektorów.

Przygotuj PCR o wysokiej wierności w końcowej objętości 50 mikrolitrów zawierającej 10 nanogramów matrycy DNA, po 250 nanomolowych starterów sensownych i antysensownych, 0,8 milimola DNTP, 3% DMSO i 02 jednostki na mikrolitr polimerazy DNA iProof o ultra wysokiej wierności. Użyj następującego programu PCR. 98 stopni Celsjusza przez 30 sekund, 98 stopni Celsjusza przez 10 sekund, 55 stopni Celsjusza przez 25 sekund i 72 stopnie Celsjusza przez 45 sekund przez 28 cykli i 72 stopnie Celsjusza przez 10 minut.

Wszystkie fragmenty PCR są następnie oczyszczane za pomocą dostępnego w handlu zestawu do ekstrakcji żelu zgodnie z protokołem producenta. Następnym krokiem jest linearyzacja wektora w celu utworzenia regionów flankujących około 50 par zasad, które są homologiczne do pięciu pierwszych i trzech pierwszych końców docelowego genu. Przygotować 20-mililitrową mieszaninę reakcyjną linearyzacji zawierającą 2 mikrogramy DNA, 7,5 jednostki BamH-onu, 7,5 jednostki XHO-onu, 20 mikrogramów BSA i dwa mikrolitry 10x buforu BamH-one.

Mieszaninę reakcyjną inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie godziny i 40 minut. Następnie dezaktywuj reakcję w temperaturze 80 stopni Celsjusza na 20 minut. Aby oczyścić zlinearyzowany wektor, aby uniknąć zanieczyszczenia resztkowym kolistym plazmidem, należy załadować mieszaninę reakcji trawienia do mega-studzienki półpreparatywnego żelu agarozowego o niskiej temperaturze topnienia.

Załaduj pięć mikrolitrów mieszaniny reakcyjnej do sąsiedniej studzienki jako reportera. Uruchom elektroforezę DNA w temperaturze czterech stopni Celsjusza i pięciu woltów na centymetr między elektrodami. Następnie oddziel żel agarozowy odpowiadający mega-studzience i przechowuj go w temperaturze czterech stopni Celsjusza w jednym XTAE.

Plamić pas za pomocą drabiny o masie cząsteczkowej i reportera. Wizualizuj pasma w świetle UV i nacinaj pozycję, w której znajduje się zlinearyzowany wektor. W przypadku braku światła UV i korzystając ze wskazówek nacięć w zabarwionym pasie reporterowym, zidentyfikuj zlinearyzowany wektor we fragmencie mega-studzienki i wytnij go.

Wyekstrahuj zlinearyzowany wektor z agarozy i oczyść go za pomocą dostępnego w handlu zestawu do ekstrakcji żelu zgodnie z protokołem producenta. Następnie oczyszczony wektor linearyzowany miesza się z fragmentami PCR, a ta mieszanina DNA jest używana do transformacji kompetentnych komórek drożdży za pomocą komercyjnego zestawu zgodnie z instrukcjami producenta. Umieść przekształcone komórki na płytkach SC i inkubuj je w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez trzy dni.

Aby przygotować się do tego testu, należy wybrać poszczególne kolonie z płytek opadających SC i przenieść je do 96 płytek dołkowych zawierających 50 mikrolitrów minimalnej pożywki na studzienkę. Na każdej płytce zaszczepić kolumnę numer sześć z typem rodzicielskim jako wzorcem wewnętrznym. Jako kontrolę ujemną dobrze zaszczepić H-one wypełniony pożywkami SC uzupełnionymi uracylem z URA3 ujemnymi komórkami trzewnymi ESI bez plazmidu.

Przykryj płytki pokrywkami, zawiń je w folię i inkubuj w temperaturze 30 stopni Celsjusza w wilgotnym wytrząsarce przez 48 godzin. Po 48 godzinach dodać 160 mikrolitrów pożywki do każdego dołka i ponownie zamknąć płytki. Inkubować przez kolejne 24 godziny.

Po odwirowaniu płytek należy użyć zrobotyzowanej wielostacji do obsługi cieczy, aby przenieść 20 mikrolitrów supernatantu z dołków w każdej płytce na płytkę repliki. Dodać 20 mikrolitrów dwóch milimolowych alkoholi P-metoksybenzylowych i 100 milimolowych fosforanu sodu o pH 6,0 do każdego dołka. Krótko wymieszaj płytki w 96-dołkowym mikserze płytkowym i inkubuj je przez 30 minut w temperaturze pokojowej.

Następnie dodaj 160 mikrolitrów reagantu FOX do każdej płytki repliki i krótko wymieszaj mikserem. Odczytaj płytki w 560 nanometrach na czytniku płytek. Inkubuj płytki w temperaturze pokojowej, aż rozwinie się kolor.

Ponownie zmierz absorpcję. Aktywność względną oblicza się na podstawie różnicy między wartością absorpcji po inkubacji a wartością początkowego pomiaru znormalizowanego do typu rodzicielskiego dla każdej płytki. Ten reprezentatywny obraz żelu pokazuje zlinearyzowany wektor na drugim torze, segment M1 PCR na trzecim torze, segment M2 PCR na czwartym torze, segment HF PCR na piątym pasie i ponownie złożony wektor in vivo zlinearyzowany z NHE jeden na szóstym torze.

Ten następny żel pokazuje mini-przygotowanie plazmidu ponownie złożonego wektora na torze drugim, plazmid zlinearyzowany za pomocą NHE jeden na torze trzecim, plazmid zlinearyzowany za pomocą BamH jeden i XHO jeden na torze czwartym oraz zlinearyzowany plazmid uzyskany przez ekstrakcję żelu i czyszczenie na torze piątym. Obciążenia mutacyjne dostosowano poprzez pobieranie próbek bibliotek mutantów o różnych krajobrazach, obliczanie liczby klonów o mniej niż 10% aktywności enzymu rodzicielskiego i dalszą weryfikację poprzez sekwencjonowanie losowej próbki aktywnych i nieaktywnych wariantów. Ocena granicy wykrywalności tego testu wykazała, że test był liniowy w obecności sorbitolu reprezentowanego przez czarne okręgi.

W przypadku braku sorbitolu reprezentowanego przez białe kwadraty, liniowość była bardziej trwała, ale odpowiedź była słabsza. Zaobserwowano liniową korelację między stężeniem AAO a absorbancją. Biblioteka mutantów składająca się z 2 000 klonów została skonstruowana i przebadana za pomocą tego testu.

Zacieniony kwadrat wskazuje mutanty AAO o znacznie lepszym wydzielaniu i aktywności przeciwko alkoholowi P-metoksybenzylowemu. Po opanowaniu, zmutowane biblioteki mogą zostać stworzone w ciągu około czterech godzin, jeśli zostaną wykonane poprawnie. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o przypisaniu odpowiednich nakładających się obszarów dla każdej rodziny PCR i zlinearyzowanego wektora do splicingu in vivo i klonowania w jednym kroku transformacji.

Stosując podobne podejście, można zastosować inne metody, takie jak pobieranie próbek DNA in vivo, biblioteka mutagenezy saturacji lub składanie DNA, w celu skonstruowania zmutowanych bibliotek i/lub szlaków metabolicznych. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom w dziedzinie bioinżynierii do badania aktywności, stabilności, a nawet do wynalezienia nieskończonych rodzajów interakcji. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykorzystać to urządzenie Saccharomyces Cerevisiae do budowy biblioteki i badań przesiewowych