Metoda ukierunkowanej ewolucji u Saccharomyces cerevisiae: tworzenie i badanie przesiewowe biblioteki mutantów

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest przedstawienie sposobu konstruowania i przesiewania bibliotek mutantów w Saccharomyces Cerevisiae na potrzeby eksperymentów z ewolucji sterowanej. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania podczas tworzenia materiałów laboratoryjnych do ukierunkowanych eksperymentów z ewolucją sterowaną, takich jak sposób wyznaczania obszarów nakładania się podczas składania i klonowania. Główną zaletą tej techniki jest jej prostota i niezawodność, ponieważ w zaledwie jednym kroku transformacji można uzyskać materiały o dobrej jakości.

Niniejszy protokół tworzenia i przesiewania bibliotek mutantów zostanie zademonstrowany na przykładzie grzybowej oksydazy alkoholi arylowych (AAO). Regiony do ukierunkowanej ewolucji są najpierw wybierane przy pomocy algorytmów obliczeniowych w oparciu o dostępną strukturę krystaliczną lub modele homologiczne enzymu. Celem randomowej mutogenezy i rekombinacji będą dwa regiony AAO: region M1 oraz region M2.

W celu amplifikacji docelowych obszarów przeprowadzona zostanie mutagenna reakcja PCR. Aby umożliwić splicing in vivo w drożdżach, poprzez nakładanie na siebie reakcji PCR zdefiniowanych regionów stworzone zostaną obszary nakładania się segmentów o długości około 50 par zasad każdy. Należy przygotować 50 µL objętościowo reakcje mutagennego PCR, z których każda będzie zawierać 46 ng matrycy DNA, 90 nM każdego z primerów sens i antisense, 0,3 mM dNTP, 3% DMSO, 1,5 mM chlorku magnezu, 0,5 mM chlorku manganu oraz 0,5 U/µL polimerazy Taq DNA.

Zastosuj następujący program PCR: 95°C przez dwie minuty, 95°C przez 45 sekund, 50°C przez 45 sekund oraz 74°C przez 45 sekund przez 28 cykli, a na koniec 74°C przez 10 minut. Pozostała część genu AAO, region HF, zostanie powielona za pomocą PCR o wysokiej wierności (high fidelity PCR) z uwzględnieniem obszarów nakładających się na segmenty mutagenne i/lub nawisów zlinearyzowanego wektora.

Przygotować reakcję PCR o wysokiej wierności w końcowej objętości 50 µL zawierającej 10 ng matrycy DNA, 250 nM każdego z primerów sensownego i antysensownego, 0,8 mM dNTP, 3% DMSO oraz 0,2 jednostki na µL polimerazy DNA iProof ultra high-fidelity. Zastosować następujący program PCR: 98 °C przez 30 sekund, 98 °C przez 10 sekund, 55 °C przez 25 sekund i 72 °C przez 45 sekund przez 28 cykli, a następnie 72 °C przez 10 minut.

Wszystkie fragmenty PCR są następnie oczyszczane za pomocą komercyjnego zestawu do ekstrakcji z żelu zgodnie z protokołem producenta. Kolejnym krokiem jest linearyzacja wektora w celu utworzenia flankujących regionów o długości około 50 par zasad, które są homologiczne do końców 5' i 3' genu docelowego. Przygotować 20 µL mieszaniny reakcyjnej do linearyzacji zawierającej 2 µg DNA, 7,5 j. BamH-one, 7,5 j. XHO-one, 20 µg BSA oraz 2 µL buforu 10x BamH-one.

Inkubować mieszaninę reakcyjną w temperaturze 37°C przez dwie godziny i 40 minut. Następnie przerwać reakcję, inkubując ją w temperaturze 80°C przez 20 minut. Aby oczyścić zlinearyzowany wektor i uniknąć zanieczyszczenia pozostałym plazmidem kolistym, nanieść mieszaninę z reakcji trawienia do szerokiego otworu (mega-well) półpreparatywnego żelu agarozowego o niskiej temperaturze topnienia.

Nanieś pięć µL mieszaniny reakcyjnej do sąsiedniego dołka jako wskaźnik. Przeprowadź elektroforezę DNA w temperaturze 4 °C i przy napięciu 5 V/cm między elektrodami. Następnie wytnij fragment żelu agarozowego odpowiadający mega-dołkowi i przechowuj go w temperaturze 4 °C w 1X TAE.

Przebarw ścieżkę z markerem masy cząsteczkowej oraz reporterem. Zwizualizuj prążki w świetle UV i zaznacz nacięciem pozycję, w której znajduje się zlinearyzowany wektor. Po wyłączeniu światła UV, kierując się nacięciami w przebarwionej ścieżce reportera, zidentyfikuj zlinearyzowany wektor w fragmencie mega-dołka i wytnij go.

Wyodrębnić zlinearyzowany wektor z agarozy i oczyścić go za pomocą komercyjnego zestawu do ekstrakcji z żelu zgodnie z protokołem producenta. Następnie oczyszczony zlinearyzowany wektor miesza się z fragmentami PCR, a tę mieszaninę DNA wykorzystuje się do transformacji kompetentnych komórek drożdży przy użyciu komercyjnego zestawu zgodnie z instrukcjami producenta. Przenieść transformowane komórki na płytki SC dropout i inkubować je w temperaturze 30 °C przez trzy dni.

Aby przygotować się do tego testu, należy pobrać pojedyncze kolonie z płytek SC dropout i przenieść je na płytki 96-dołkowe zawierające 50 µL minimalnego medium na dołek. W każdej płytce w kolumnie numer sześć należy zaszczepić szczep rodzicielski jako standard wewnętrzny. Jako kontrolę negatywną w dołku H-1 wypełnionym medium SC uzupełnionym o uracyl należy zaszczepić komórki trzewne ESI URA3-ujemne, pozbawione plazmidu.

Przykryć płytki pokrywkami, owinąć je folią parafilmową i inkubować w temperaturze 30 °C w wilgotnej wytrząsalce przez 48 godzin. Po 48 godzinach dodać 160 µL pożywki ekspresyjnej do każdej studni i ponownie zamknąć płytki. Inkubować przez kolejne 24 godziny.

Po odwirowaniu płytek należy użyć wielostanowiskowego robota do pipetowania, aby przenieść 20 µL supernatantu z dołków każdej płytki na płytkę replikacyjną. Do każdego dołka należy dodać 20 µL 2 mM alkoholu p-metoksybenzylowego oraz 100 mM buforu fosforanowego sodu o pH 6.0. Płytki należy krótko wymieszać za pomocą mieszalnika do płytek 96-dołkowych i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.

Następnie dodaj 160 µL odczynnika FOX do każdej płyty powtórzeniowej i krótko wymieszaj za pomocą mieszalnika. Odczytaj wartości z płyt przy 560 nm za pomocą czytnika płytek. Inkubuj płyty w temperaturze pokojowej do czasu wykształcenia się barwy.

Ponownie zmierz absorbancję. Względną aktywność oblicza się z różnicy między wartością absorbancji po inkubacji a wartością pomiaru początkowego, z normalizacją względem typu rodzicielskiego dla każdej płytki. Ten reprezentatywny obraz żelu przedstawia zlinearyzowany wektor w ścieżce drugiej, segment PCR M1 w ścieżce trzeciej, segment PCR M2 w ścieżce czwartej, segment PCR HF w ścieżce piątej oraz zlinearyzowany za pomocą NHE one wektor zrekonstruowany in vivo w ścieżce szóstej.

Koleżny żel przedstawia mini-prep plazmidu z ponownie złożonym wektorem w ścieżce drugiej, plazmid linearyzowany za pomocą NHE I w ścieżce trzeciej, plazmid linearyzowany za pomocą BamH I oraz Xho I w ścieżce czwartej oraz plazmid linearyzowany uzyskany poprzez ekstrakcję z żelu i oczyszczanie w ścieżce piątej. Obciążenia mutacyjne dostosowano poprzez próbkowanie bibliotek mutantów o różnych krajobrazach, obliczając liczbę klonów o aktywności enzymatycznej mniejszej niż 10% aktywności enzymu rodzicielskiego, a następnie zweryfikowano poprzez sekwencjonowanie losowej próby wariantów aktywnych i nieaktywnych. Ocena granicy wykrywalności tego testu wykazała, że test był liniowy w obecności sorbitolu, co przedstawiono za pomocą czarnych kółek.

W przypadku braku sorbitolu, reprezentowanego przez białe kwadraty, liniowość była bardziej trwałą, ale odpowiedź była słabsza. Zaobserwowano liniową korelację między stężeniem AAO a absorbancją. Skonstruowano bibliotekę mutantów składającą się z 2 000 klonów, którą następnie przeselekcjonowano za pomocą tego testu.

Zacieniowany kwadrat oznacza mutanty AAO o wyraźnie poprawionej sekrecji i aktywności wobec alkoholu P-metoksybenzylowego. Po opanowaniu techniki, biblioteki mutantów można przygotować w około cztery godziny, jeśli procedura jest przeprowadzana prawidłowo. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby przypisać odpowiednie obszary nakładania się dla każdej rodziny PCR oraz zlinearyzowanego wektora w celu splicingu in vivo i klonowania w jednym kroku transformacji.

Stosując podobne podejście, można przeprowadzić inne metody, takie jak pobieranie próbek DNA in vivo, tworzenie bibliotek nasyconej mutagenezy lub montaż DNA, w celu skonstruowania bibliotek mutantów oraz szlaków metabolicznych. Po opracowaniu ta technika utorowała drogę badaczom w dziedzinie bioinżynierii do badania aktywności, stabilności, a nawet wynajdywania nieskończonej liczby rodzajów oddziaływań. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak wykorzystać to narzędzie oparte na Saccharomyces Cerevisiae do konstruowania i przesiewania bibliotek