Mikroprzepływowa pułapka hydrodynamiczna dla pojedynczych cząstek
January 21st, 2011
W tym artykule prezentujemy opartą na mikroprzepływach metodę zatrzymywania cząstek w oparciu o przepływ hydrodynamiczny. Demonstrujemy stabilne wychwytywanie cząstek w punkcie stagnacji płynu za pomocą mechanizmu sterowania ze sprzężeniem zwrotnym, umożliwiając w ten sposób uwięzienie i mikromanipulację dowolnymi cząstkami w zintegrowanym mikrourządzeniu.
Ogólnym celem tej metody jest ograniczenie i manipulowanie pojedynczymi cząstkami w skali mikro i nano za pomocą przepływu laminarnego w urządzeniu mikroprzepływowym. Pułapka hydrodynamiczna składa się z urządzenia mikroprzepływowego z poprzeczną geometrią kanału szczelinowego, która powoduje przepływ punktu stagnacji na złączu mikrokanału. Wbudowany zawór umieszczony w jednym z kanałów wylotowych służy do aktywnego sterowania przepływem płynu i wychwytywania cząstek.
Cząstki są ograniczane do zdefiniowanej przez użytkownika wartości zadanej poprzez aktywne sterowanie położeniem punktu stagnacji. Kontroler sprzężenia zwrotnego służy do śledzenia pozycji cząstek i regulacji zaworu na chipie w celu utrzymania pozycji cząstek w zadanym punkcie. Za pomocą pułapki hydrodynamicznej pojedyncze cząstki są uwięzione w rozcieńczonych lub skoncentrowanych roztworach cząstek i mogą być obrazowane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej lub jasnego pola.
Pojedyncza cząstka może być ograniczona do jednego mikrona od środka pułapki, jak pokazano na trajektorii cząstki i histogramie przemieszczenia cząstki od środka pułapki. Cześć, nazywam się Eric Johnson Rio i pracuję w laboratorium profesora Charlesa Schroera na Wydziale Inżynierii Chemicznej i Biomolekularnej oraz w Centrum Biofizyki i Biologii Obliczeniowej na Uniwersytecie Illinois. Cześć, nazywam się Ari i jestem doktorem habilitowanym w Schroeder Lab.
Cześć, nazywam się Cheryl Schroeder i dzisiaj pokażemy Ci, jak wyprodukować i wdrożyć urządzenie mikroprzepływowe do hydrodynamicznego wychwytywania pojedynczych cząstek. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak pułapki optyczne lub elektrokinetyczne, jest to, że pułapki hydrodynamiczne uzyskuje się wyłącznie dzięki przepływowi płynu, eliminując w ten sposób potencjalnie proatywne cztery pola dla pułapki nanocząstek lub komórek. Technika ta ma potencjał, aby przekształcić nauki podstawowe i stosowane, umożliwiając swobodne wychwytywanie roztworów cząstek w mikro i nanoskali bez wymagań dotyczących właściwości chemicznych lub fizycznych uwięzionych cząstek.
Więc zacznijmy. Aby ułatwić odklejanie replik od ośmiu form SU, należy zmodyfikować powierzchnię ośmiu form SU, umieszczając płytki w osuszaczu pod próżnią na 10 minut za pomocą szklanego naczynia zawierającego kilka kropli tri chloroseliny przy użyciu mieszanych i DGAs PDMS dla warstw płynnych i kontrolnych. Wiruj mieszaninę 15 do jednego PDMS na formie warstwy fluidalnej przez 30 sekund przy 750 obr./min, a następnie umieść wafel na szalce Petriego.
Podobnie, umieść formę warstwy kontrolnej na szalce Petriego i wlej mieszaninę PDMS pięć do jednego na formę o grubości czterech milimetrów. Aby częściowo utwardzić warstwy PDMS, piecz wafle tnij PDM przez 30 minut w temperaturze 70 stopni Celsjusza i pozwól im ostygnąć do temperatury pokojowej. Przetnij replikę PDMS skalpelem i oderwij ją od formy SU eight.
Następnie za pomocą igły o rozmiarze 21 wybij otwór w PDMS jako port dostępowy do mikrokanału, który będzie działał jako zawór membranowy w układzie scalonym. Umieść replikę PDMS z warstwą kontrolną na płytce z warstwą fluidyczną PDMS pokrytą spinowo. Ostrożnie wyrównaj i uszczelnij warstwę kontrolną do warstwy płynowej za pomocą mikroskopu stereoskopowego.
Upewnij się, że usunąłeś wszystkie kieszenie powietrzne między warstwami i piecz w temperaturze 70 stopni Celsjusza przez noc, aby w pełni utwardzić obie warstwy w monolityczną płytę PDMS z dwiema warstwami po schłodzeniu do temperatury pokojowej, użyj skalpela, aby wyciąć i oderwać replikę PDMS od formy SU osiem i użyj żyletki, aby usunąć nadmiar PDMS i oddzielić każdą jednostkę urządzenia. Teraz cały stempel uzyskuje dostęp do portów do mikrokanałów w warstwie płynowej za pomocą igły o rozmiarze 21. Wyczyść szkiełko nakrywkowe acetonem IPA i osusz azotem.
Zarówno szkiełko nakrywkowe, jak i powierzchnie repliki PDMS należy traktować plazmą tlenową poniżej 500 militorów przez 30 sekund. A następnie natychmiast zetknij się z dwiema powierzchniami, aby utworzyć nieodwracalne uszczelnienie. Na koniec wypal urządzenia przez noc, aby zwiększyć wiązanie między warstwami PDMS a szkiełkiem nakrywkowym.
Najpierw umieść urządzenie mikroprzepływowe na stoliku odwróconego mikroskopu i zabezpiecz je klipsami stolika. Następnie, aby dostarczyć roztwory do urządzenia mikroprzepływowego, napełnij strzykawkę o pojemności jednego mililitra i 250 mikrolitrów odpowiednio roztworami buforowymi i roztworami próbek. Użyj zaworu T między strzykawką z próbką a portem próbki w urządzeniu mikroprzepływowym, aby kontrolować dostarczanie próbki.
Teraz ustal połączenia płynowe między strzykawkami a urządzeniem mikroprzepływowym, używając rurki fluorotlenowej na fluoro, adapterów blokujących przynętę i metalowej rurki o średnicy 24. Następnie ustanów połączenia płynów dla kanałów wylotowych w urządzeniu mikroprzepływowym za pomocą rurki PFA i metalowej rurki o średnicy 24. Aby utrzymać stały spadek ciśnienia między strzykawkami a kanałami wylotowymi, rurki PFA do wylotów powinny być równej długości i oba powinny być zanurzone w 1,5-mililitrowej probówce wirówkowej wypełnionej roztworem buforowym.
Napełnij zawór na chipie fluorowanym olejem nośnikowym za pomocą trzymililitrowej plastikowej strzykawki z blokadą przynęty, aby zapobiec przedostawaniu się powietrza do warstwy płynnej podczas pracy. Przepchnąć powietrze z komory zaworu przez membranę PDMS do mikrokanału. W warstwie płynowej.
Do obsługi zaworu na chipie. Podłączyć dopływ gazu obojętnego pod ciśnieniem do portu w warstwie kontrolnej. Przepłukać połączenia hydrauliczne i urządzenie mikroprzepływowe 0,5 mililitra roztworu buforowego, aby upewnić się, że wszystkie pęcherzyki powietrza zostały usunięte z systemu, w tym z kanałów wylotowych.
Typowe natężenia przepływu stosowane do usuwania pęcherzyków wahają się od 2000 do 5 000 mikrolitrów na godzinę po wypłukaniu pęcherzyków powietrza z kanałów mikroprzepływowych, zmniejszenie natężenia przepływu do 50 do 100 mikrolitrów na godzinę, co jest typowym objętościowym natężeniem przepływu dla wychwytywania cząstek. Teraz przełącz zawór T, aby umożliwić przepływ próbki do urządzenia mikroprzepływowego. Wykonaj niestandardowy kod widoku laboratorium, który automatyzuje wychwytywanie cząstek, implementując algorytm sterowania liniowym sprzężeniem zwrotnym.
Kod przechwytuje obrazy z kamery CCD i przesyła potencjał elektryczny do regulatora ciśnienia, który aktywnie moduluje położenie wbudowanego zaworu pneumatycznego. Korzystając ze stolika translacji XY mikroskopu, umieść obszar zalewkowania na środku widoku kamery. Umieść obszar pułapkowania w ostrości obiektywu obiektywu i dostosuj ustawienia aparatu, aby zoptymalizować warunki obrazowania.
Wybierz prostokątny obszar zainteresowania w polu widzenia kamery, tak aby środek obszaru zainteresowania był położeniem środka pułapki. Teraz zainicjuj ciśnienie przesunięcia przyłożone do zaworu na chipie. Zwężenie o szerokości od 100 do 200 mikronów zlokalizowane w przeciwległym kanale wylotowym.
Zapewnia ciśnienie przesunięcia dla działania zaworu na chipie. Zainicjuj kontroler sprzężenia zwrotnego i dostosuj proporcjonalne wzmocnienie, aby zoptymalizować reakcję pułapki. W zależności od natężenia przepływu i położenia zaworu na chipie, istnieje optymalna proporcjonalna wartość wzmocnienia, która zwiększa stabilność pułapki i eliminuje niepożądane oscylacje cząstek.
Kod widoku laboratorium automatycznie wychwyci jedną z cząstek wchodzących do obszaru pułapki. Na tym filmie ruch cząstek w kierunku dopływu powstaje, ponieważ strumień wlotowy próbki pozostaje otwarty, aby zmaksymalizować szczelność pułapki zamknięcia w kierunku dopływu. Użytkownik może zamknąć strumień próbki podczas pułapkowania, co równoważy równomierny przepływ do skrzyżowania międzykanałowego, monitorować uwięzioną cząstkę i utrzymywać ostrość cząstek w płaszczyźnie obrazu za pomocą ręcznego ustawiania ostrości lub automatycznej konfiguracji mikroskopu ostrości.
Zintegrowane urządzenie mikroprzepływowe składa się z ogniska próbki, skrzyżowania szczelinowego i pneumatycznego uwięzienia zaworu następuje na skrzyżowaniu ze szczeliną krzyżową, a położenie cząstek jest kontrolowane przez aktywną regulację pola przepływu na złączu mikrokanałowym przez zawór pneumatyczny. W tym przypadku obraz pojedynczej kulki jest zamknięty w pułapce hydrodynamicznej. Oprócz w środku pułapki, w obszarze zalewkowania na skrzyżowaniu partii krzyżowej pokazanych jest kilka nieuwięzionych koralików.
Odwzorowywana jest trajektoria uwięzionego fluorescencyjnego koralika polistyrenowego o grubości 2,2 mikrona. Cząstka jest początkowo uwięziona przez trzy minuty. Następnie jest uwalniany z pułapki i ucieka wzdłuż jednego z kanałów wylotowych.
Histogram przemieszczenia uwięzionego koralika od środka pułapki wzdłuż kierunku kanałów wylotowych wskazuje, że cząstka jest ograniczona w promieniu jednego mikrona od środka pułapki. W dniu dzisiejszym zaprezentowaliśmy pułapkę EM jako metodę swobodnego wychwytywania roztworów cząstek w skali mikro i nano za pomocą przepływu punktowego generowanego w urządzeniu mikroprzepływowym. Pułapkowanie hydrodynamiczne umożliwia uwięzienie pojedynczej cząstki docelowej w skoncentrowanych zawiesinach cząstek, co jest trudne do zastosowania alternatywnych metod wychwytywania opartych na polu siłowym.
Po dalszym rozwoju, ta nowa technika pozwoli na eksplorację naukową w dziedzinie biofizyki, mechaniki komórki, dynamiki płynów, enzymologii i biologii systemów. Dziękujemy za oglądanie i mamy nadzieję, że ta technika będzie przydatna w Waszych eksperymentach.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł przedstawia metodę opartą na mikrofluidyce do ograniczania i manipulacji cząstkami na skalę mikro i nano za pomocą przepływu hydrodynamicznego. Zastosowano mechanizm sterowania zwrotnego w celu osiągnięcia stabilnego uwięzienia cząstek w punkcie stagnacji płynu wewnątrz mikrourządzenia.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Mikrofluidyka
- Manipulacja cząstkami
- Uwięzienie hydrodynamiczne
Tło
- Urządzenia mikrofluidyczne umożliwiają precyzyjną kontrolę przepływu płynu.
- Pułapki hydrodynamiczne mogą ograniczać cząstki w określonych miejscach.
- Aktywne mechanizmy sterowania poprawiają zdolności manipulacji cząstkami.
- Mikroskopia fluorescencyjna i jasnopolowa może być wykorzystana do obrazowania cząstek.
Cel badania
- Opracowanie metody do uwięzienia pojedynczych cząstek w urządzeniach mikrofluidycznych.
- Wykorzystanie przepływu warstwy granicznej do efektywnego ograniczania cząstek.
- Zastosowanie sterowania zwrotnego do utrzymania pozycji cząstek.
Stosowane metody
- Urządzenie mikrofluidyczne z geometrią kanału krzyżowego.
- Zawór na chipie do aktywnej kontroli przepływu płynu.
- Regulator zwrotny do śledzenia i regulacji pozycji cząstek.
- Techniki obrazowania, takie jak mikroskopia fluorescencyjna i jasnopolowa.
Główne wyniki
- Skuteczne uwięzienie pojedynczych cząstek zarówno w roztworach rozcieńczonych, jak i stężonych.
- Wykazana stabilność ograniczania cząstek w zadanym punkcie ustawionym przez użytkownika.
- Skuteczna regulacja pozycji punktu stagnacji przy użyciu sterowania zwrotnego.
- Możliwość obrazowania uwięzionych cząstek za pomocą technik mikroskopicznych.
Wnioski
- Metoda zapewnia solidne podejście do manipulacji cząstkami w systemach mikrofluidycznych.
- Aktywne mechanizmy sterowania poprawiają precyzję uwięzienia cząstek.
- Ta technika może być zastosowana w różnych dziedzinach wymagających ograniczania cząstek.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This microfluidic hydrodynamic trap enables label-free, field-free confinement of single micro- and nanoscale particles in complex biological suspensions, supporting early-stage target validation by allowing direct observation of particle behavior without surface immobilization or perturbative fields. The method provides quantitative spatial control and long-term stability for mechanistic de-risking of nanoparticle-biomolecule interactions in discovery workflows. Its compatibility with concentrated samples and arbitrary particle types enhances translational relevance for preclinical screening of drug delivery vehicles and extracellular vesicles.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by trapping single particles in free solution to observe native-state interactions without optical, magnetic, or electric field artifacts.
- Operational Value: Supports functional target validation in crowded environments such as serum or cell lysates where conventional trapping fails due to background interference.
- Predictive Value: Facilitates lead identification by allowing prolonged observation of particle dynamics to assess binding kinetics and stability under near-physiological conditions.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated particle systems for downstream workflows by enabling isolation and manipulation of single entities from heterogeneous populations.
- Quantitative Output: Generates displacement histograms and trajectory data that serve as reproducible metrics for comparing particle behavior across conditions.
- Platform Scalability: Integrates with existing microfluidic devices via on-chip pneumatic valves, allowing reuse across multiple targets and increasing throughput in screening cascades.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Maintains continuity from discovery to preclinical validation by trapping particles in biologically relevant matrices without altering surface chemistry.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables mechanistic de-risking of nanoparticle formulations by quantifying confinement stability as a proxy for colloidal integrity in complex fluids.
- Biomarker Alignment: Supports translational biomarker studies by permitting long-term observation of single extracellular vesicles or lipid nanoparticles in undiluted biofluids.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical assessment, particularly for studies requiring unperturbed particle analysis in native environments.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling direct visualization of single-particle interactions in solution without labels or surface tethering.
- Screening: Enhances assay reproducibility through active flow control that maintains consistent trapping conditions across runs, reducing variability in particle-based assays.
- Analytics: Provides centroid tracking and displacement measurements as quantitative readouts to compare particle responses under different buffer or ligand conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical work by allowing assessment of particle behavior in concentrated biological fluids that mimic in vivo conditions.
- Enterprise Reuse: Functions as a modular trapping module that can be integrated into various microfluidic platforms, reducing redevelopment costs across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by eliminating field-induced artifacts and enabling observation of native particle states in suspension.
- Operational Value: Delivers standardization and reproducibility via feedback-controlled stagnation point positioning, ensuring consistent trap performance across users and sessions.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early, quantitative data on particle stability and interaction propensity in realistic matrices.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of nanoparticle or vesicle candidates based on single-particle trapping stability in complex fluids.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic fabrication, fluorescence microscopy, and feedback control systems such as LabVIEW-based image processing and pressure regulation.
- Depends on pneumatic pressure regulators, on-chip valves, and high-speed imaging infrastructure for real-time particle tracking and flow adjustment.
- Necessitates cross-team standardization of valve calibration protocols and particle tracking parameters to ensure reproducibility between laboratories.
- Involves adaptation considerations when applying to non-spherical or deformable particles, as trapping efficiency may vary with shape and size under extensional flow.
- Includes practical limitations such as the need for particle fluorescence or contrast for reliable tracking, and potential drift during extended runs requiring periodic recalibration.
