Mikrofluidyczna pułapka hydrodynamiczna dla pojedynczych cząstek

Ogólnym celem tej metody jest ograniczanie i manipulowanie pojedynczymi cząstkami w skali mikro i nano z wykorzystaniem przepływu laminarnego w urządzeniu mikrofluidycznym. Pułapka hydrodynamiczna składa się z urządzenia mikrofluidycznego o geometrii kanału w kształcie krzyżowej szczeliny, co prowadzi do powstania przepływu z punktem stagnacji na złączu mikrokanałów. Zawór zintegrowany z układem, umieszczony w jednym z kanałów wylotowych, służy do aktywnego sterowania przepływem cieczy i chwytania cząstek.

Cząstki są ograniczane w zdefiniowanym przez użytkownika punkcie nastawy poprzez aktywną kontrolę położenia punktu stagnacji. Sterownik sprzężenia zwrotnego jest wykorzystywany do śledzenia pozycji cząstek i regulacji zaworu na chipie w celu utrzymania pozycji cząstki w punkcie nastawy. Dzięki zastosowaniu pułapki hydrodynamicznej pojedyncze cząstki są uwięzione w rozcieńczonych lub skoncentrowanych roztworach cząstek i mogą być obrazowane przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej lub jasnopolowej.

Pojedynczą cząsteczkę można ograniczyć do obszaru jednego mikrona od centrum pułapki, co pokazano na trajektorii cząsteczki oraz na histogramie przesunięcia cząsteczki względem centrum pułapki. Cześć, jestem Eric Johnson Rio z laboratorium profesora Charlesa Schroera w Departamencie Inżynierii Chemicznej i Biomolekularnej oraz w Centrum Biofizyki i Biologii Obliczeniowej na University of Illinois. Cześć, nazywam się Ari, jestem badaczem postdoktorskim w laboratorium Schroera.

Witajcie, nazywam się Cheryl Schroeder i dzisiaj pokażemy Państwu, jak wykonać i wdrożyć urządzenie mikroprzepływowe do hydrodynamicznego wychwytywania pojedynczych cząstek. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak pułapki optyczne czy elektrokinetyczne, jest to, że wychwyt hydrodynamiczny jest osiągany wyłącznie za pomocą przepływu cieczy, co eliminuje potencjalnie zakłócające pola przy wychwytywaniu nanocząstek lub komórek. Technika ta ma potencjał, aby przekształcić naukę podstawową i stosowaną, umożliwiając wychwytywanie cząstek w skali mikro i nano w wolnym roztworze, bez żadnych wymagań dotyczących właściwości chemicznych lub fizycznych wychwytywanej cząstki.

Zacznijmy zatem. Aby ułatwić oddzielanie replik od form z SU-8, należy zneutralizować powierzchnię form z SU-8, umieszczając wafle w eksykatorku pod próżnią przez 10 minut wraz ze szalką szklaną zawierającą kilka kropli trichlorosilanu, używając zmieszanego PDMS od Dow Corning dla warstw fluidycznych i sterujących. Nałóż metodą spin-coatingu mieszaninę PDMS w stosunku 15:1 na formę warstwy fluidycznej przez 30 sekund przy 750 RPM, a następnie umieść wafel w szalce Petriego.

Podobnie, umieść formę warstwy kontrolnej w szalce Petriego i wlej na nią mieszaninę PDMS w proporcji pięć do jeden, tak aby uzyskać grubość 4 mm. Aby częściowo utwardzić warstwy PDMS, wypalaj wafle/PDMS przez 30 min w temperaturze 70 °C, a następnie pozostaw do ostygnięcia do temperatury pokojowej. Wytnij replikę PDMS skalpelem i odklej ją od formy z SU 8.

Następnie za pomocą igły 21G wykonaj w PDMS otwór, który będzie służyć jako port dostępu do mikrokanału pełniącego funkcję zaworu membranowego na płytce. Umieść replikę PDMS z warstwą sterującą na płytce z naniesioną metodą spin-coatingu fluidyczną warstwą PDMS. Używając stereomikroskopu, precyzyjnie wyrównaj i uszczelnij warstwę sterującą z warstwą fluidyczną.

Należy upewnić się, że wszystkie pęcherzyki powietrza między warstwami zostały usunięte, a następnie wypiekać w temperaturze 70 °C przez noc, aby w pełni utwardzić obie warstwy w monolityczną płytkę PDMS. Po ochłodzeniu do temperatury pokojowej użyć skalpela, aby wyciąć i odkleić replikę PDMS od formy SU-8, a następnie za pomocą żyletki usunąć nadmiar PDMS i oddzielić poszczególne jednostki urządzenia. Następnie należy wykonać otwory dostępu do mikrokanałów w warstwie płynowej za pomocą igły 21G. Oczyścić szkiełko nakrywkę acetonem i IPA, a następnie osuszyć azotem.

Potraktuj powierzchnie szkiełka nakrywki oraz repliki PDMS plazmą tlenową pod ciśnieniem 500 millitorr przez 30 sekund. Następnie niezwłocznie doprowadź obie powierzchnie do kontaktu, aby utworzyć nieodwracalne uszczelnienie. Na koniec wypal urządzenia przez noc, aby zwiększyć wiązanie między warstwami PDMS a szkiełkiem nakrywką.

W pierwszej kolejności umieść urządzenie mikroprzepływowe na stoliku mikroskopu odwróconego i zabezpiecz je za pomocą uchwytów stolika. Następnie, aby dostarczyć roztwory do urządzenia mikroprzepływowego, napełnij strzykawkę szczelną o pojemności 1 mL buforem, a strzykawkę szczelną o pojemności 250 µL roztworem próbki. Użyj zaworu T pomiędzy strzykawką z próbką a portem wlotowym próbki w urządzeniu mikroprzepływowym, aby kontrolować dozowanie próbki.

Następnie należy ustanowić połączenia płynowe między strzykawkami a urządzeniem mikroprzepływowym, używając rurek z perfluorooksydanu, adapterów typu lure lock oraz metalowych rurek o rozmiarze 24 gauge. Następnie należy ustanowić połączenia płynowe dla kanałów wylotowych w urządzeniu mikroprzepływowym za pomocą rurek PFA i metalowych rurek o rozmiarze 24 gauge. Aby utrzymać stały spadek ciśnienia między strzykawkami a kanałami wylotowymi, rurki PFA dla wylotów powinny mieć taką samą długość i obie powinny być zanurzone w probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml wypełnionej roztworem buforowym.

Wypełnij zawór na chipie fluorowanym olejem nośnym, używając plastikowej strzykawki 3 ml z końcówką Luer Lock, aby zapobiec przedostawaniu się powietrza do warstwy fluidycznej podczas pracy. Wypchnij powietrze z komory zaworu przez membranę PDMS do mikrokanału w warstwie fluidycznej.

Do obsługi zaworów na płytce. Podłącz zasilanie sprężonego gazu obojętnego do portu w warstwie sterującej. Przepłucz połączeniay płynowe oraz urządzenie mikrofluidyczne 0,5 milliliters roztworu buforowego, aby upewnić się, że wszystkie pęcherzyki powietrza zostały usunięte z układu, w tym z kanałów wylotowych.

Typowe szybkości przepływu stosowane do usuwania pęcherzyków powietrza mieszczą się w zakresie od 2000 do 5 000 µL/h; po wypłukaniu pęcherzyków powietrza z kanałów mikrofluidycznych należy zmniejszyć szybkość przepływu do 50–100 µL/h, co stanowi typową objętościową szybkość przepływu dla wychwytywania cząstek. Następnie należy przełączyć zawór T, aby umożliwić przepływ próbki do urządzenia mikrofluidycznego. Następnie uruchamia się dedykowany kod LabVIEW, który automatyzuje proces wychwytywania cząstek poprzez implementację liniowego algorytmu sterowania z sprzężeniem zwrotnym.

Kod przechwytuje obrazy z kamery CCD i przesyła potencjał elektryczny do regulatora ciśnienia, który aktywnie moduluje pozycję zintegrowanego z układem zaworu pneumatycznego. Używając stolika translacyjnego XY mikroskopu, ustaw obszar pułapkowania w centrum pola widzenia kamery. Ustaw obszar pułapkowania w ognisku obiektywu i dostosuj ustawienia kamery, aby zoptymalizować warunki obrazowania.

Wybierz prostokątny obszar zainteresowania (ROI) w polu widzenia kamery w taki sposób, aby środek ROI znajdował się w pozycji środka pułapki. Następnie zainicjuj ciśnienie offsetowe przyłożone do zaworu na chipie. Zwężenie o szerokości od 100 do 200 mikronów znajduje się w przeciwległym kanale wylotowym.

Zapewnia ciśnienie offsetowe dla pracy zaworu zintegrowanego z układem. Uruchom kontroler sprzężenia zwrotnego i dostrój wzmocnienie proporcjonalne w celu optymalizacji odpowiedzi pułapki. W zależności od natężenia przepływu i pozycji zaworu zintegrowanego z układem istnieje optymalna wartość wzmocnienia proporcjonalnego, która zwiększa stabilność pułapki i eliminuje niepożądane oscylacje cząstek.

Kod LabVIEW automatycznie przechwyci jedną z cząsteczek wnikających do obszaru pułapki. W tym filmie ruch cząsteczek w kierunku dopływu wynika z faktu, że wlot próbki pozostaje otwarty, aby zmaksymalizować szczelność uwięzienia w kierunku dopływu. Użytkownik może zamknąć strumień próbki podczas przechwytywania, co zrównoważy przepływ do połączenia kanału poprzecznego, umożliwi monitorowanie uwięzionej cząsteczki oraz utrzymanie ostrości cząsteczki w płaszczyźnie obrazu za pomocą ręcznego ustawiania ostrości lub automatycznego systemu mikroskopowego.

Zintegrowane urządzenie mikroprzepływowe składa się z układu ogniskowania próbki, połączenia w kształcie krzyża oraz zaworu pneumatycznego; wychwytywanie następuje w miejscu połączenia w kształcie krzyża, a pozycja cząstki jest kontrolowana poprzez aktywną regulację pola przepływu w połączeniu mikrokanałów za pomocą zaworu pneumatycznego. Tutaj przedstawiono obraz pojedynczej kuleczki uwięzionej w pułapce hydrodynamicznej. Oprócz kuleczki znajdującej się w centrum pułapki, w obszarze wychwytywania przy połączeniu w kształcie krzyża widocznych jest kilka nieuwięzionych kuleczek.

Mapowana jest trajektoria uwięzionej fluorescencyjnej kuleczki polistyrenowej o średnicy 2,2 mikrona. Cząsteczka jest początkowo uwięziona przez trzy minuty. Następnie zostaje uwolniona z pułapki i ucieka jednym z kanałów wylotowych.

Histogram przemieszczenia uwięzionej kuleczki względem centrum pułapki wzdłuż kierunku kanałów wylotowych wskazuje, że cząstka jest ograniczona do obszaru jednego mikrona od centrum pułapki. Przedstawiliśmy pułapkę EM jako metodę uwięzienia cząstek w skali mikro i nano w wolnym roztworie przy użyciu przepływu w punkcie stagnacji generowanego w urządzeniu mikrofluidycznym. Pułapkowanie hydrodynamiczne umożliwia unieruchomienie pojedynczej cząstki docelowej w skoncentrowanych zawiesinach cząstek, co jest trudne do osiągnięcia przy użyciu alternatywnych metod pułapkowania opartych na polach sił.

Po dalszym rozwoju nowa technika ta umożliwi eksplorację naukową w dziedzinach biofizyki, mechaniki komórkowej, dynamiki płynów, enzymologii oraz biologii systemów. Dziękujemy za obejrzenie materiału i mamy nadzieję, że technika ta okaże się przydatna w Państwa eksperymentach.