Przechwytywanie komórek za pomocą urządzenia mikroprzepływowego

Urządzenia, tak jak je przygotowaliśmy, są pakowane w zestawy po 10 lub 20 sztuk, a po dotarciu są wysyłane schłodzone w pudełku, a zestaw zawiera wszystkie elementy potrzebne do uruchomienia. Eksperyment w zestawie to paczka ze wszystkimi strzykawkami i, które mogą pozostać w temperaturze pokojowej. Jest też kopia protokołu, którego będziemy przestrzegać w tym eksperymencie.

Dostępna jest również skrzynka chłodnicza, która zawiera rzeczywiste urządzenia i wszystkie uruchomione, które muszą być przechowywane w lodówce. Zazwyczaj zestawy są pakowane w grupy po 10 lub 20 sztuk. Gdy nie są używane, zestawy należy przechowywać w lodówce.

Każda strzykawka i każdy element zestawu jest starannie oznakowany, a etykiety odpowiadają tabeli w protokole, którego przestrzegamy. Nie ma więc wątpliwości co do tego, która strzykawka lub element zestawu należy użyć w poszczególnych krokach. Po rozpakowaniu urządzeń i umieszczeniu ich w komorze bezpieczeństwa biologicznego, przeprowadzimy procedurę izolowania neutrofili i lizy ich do dalszych zastosowań genomicznych, ponieważ zamierzamy to zrobić, ponieważ ratunek życia, który otrzymamy, zostanie wykorzystany do izolacji lub ekstrakcji RNA z lizatu komórkowego.

Z tego powodu chcemy mieć pewność, że nasz obszar jest czysty, nie tylko w sensie sterylnym, ale także czystym z wszelkich RNA, które są zwykle obecne w środowisku. Dlatego bardzo ważne jest, aby wytrzeć cały obszar i urządzenia roztworem, który niszczy RNA. Dlatego zazwyczaj wycieramy wszystkie nasze narzędzia i powierzchnie robocze za pomocą RNA SAP lub RNA, które można uzyskać od wielu producentów.

Urządzenie zostało zapakowane w etui termozgrzewalne. Każde urządzenie jest zaplombowane i oznaczone kodem kreskowym tym kodem kreskowym. Powinieneś, powinieneś zanotować ten kod kreskowy, jeśli pracujesz z jakimikolwiek próbkami klinicznymi.

Tak więc urządzenie jest rozszczelniane, pokrywa jest zdejmowana i umieszczana w kolektorze przytrzymującym pompę. Próbka krwi, której używamy, to próbka krwi pełnej. Przepuścimy go przez standardową strzykawkę BD o średnicy jednego mila, a ta jest oznaczona jako strzykawka pierwsza.

Zazwyczaj strzykawka jest wyjmowana z opakowania, a nasadka jest ostrożnie zdejmowana z probówki z krwią. A to, co robisz, to wrzucasz 700 mikrolitrów lub 0,7 mililitra krwi i wstrzykujesz połowę tego, czyli 350 mikrolitrów do probówki o średnicy 1,5 mililitra. Dzięki. W ten sposób Twoja krew może zostać przekazana do dalszego przetwarzania.

Twoja probówka z krwią może zostać przekazana dalej, a mimo to nadal masz więcej krwi w przypadku awarii urządzenia. Więc teraz zamierzamy załadować strzykawkę, do której jest krew, na tę igłę, która jest podłączona do kawałka rurki z tym urządzeniem. Chcemy być bardzo, z, z urządzeniem do izolacji mikroprzepływowej.

Chcemy być bardzo ostrożni, aby nie wprowadzić żadnych pęcherzyków powietrza do urządzenia, ani nie spowoduje to nieprawidłowego działania urządzenia. Zazwyczaj bierzemy strzykawkę, naciskamy tłok i dodajemy płyn do górnej powierzchni urządzenia, upewniając się, że jest w pełni złączony, zanim wyrzucimy cały płyn. Zatrzymujemy się i ostrożnie wyjmujemy korpus strzykawki z igły i zasadniczo napełniamy końcówkę igły lub, lub łącznik przynęty igły, pozostałym buforem, który jest w tej strzykawce.

Pozbywamy się tego. Następnie weźmiemy naszą strzykawkę z krwią i włożymy ją do tego koncentratora przynęty. Uważaj, aby nie rozlać krwi i uważaj, aby nie wprowadzić żadnych pęcherzyków powietrza.

Najlepiej jest użyć kemo przytrzymującego korpus strzykawki i rurkę na wypadek rozlania krwi. Raz, po podłączeniu strzykawki do obudowy rurki lub igły, dajemy jej kilka ostrych stuknięć, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza, które mogą znajdować się na złączu. Ta strzykawka jest następnie ładowana do pompy strzykawkowej, a następnie do pompy strzykawkowej i jest zabezpieczona śrubą blokującą.

Pompa strzykawkowa jest włączona i jest już ustawiona na nasze warunki przepływu. Będziemy przepływać tę krew przez urządzenie z prędkością 30 mikrolitrów na minutę. Gdy korpus strzykawki zostanie załadowany do pompy strzykawkowej, naciśniemy przycisk na ruchomym ramieniu tłoka i zsuniemy go w dół, aż dotknie górnej części tłoka i zacznie wypychać płyn przez końcówkę.

Jest to końcówka igły ze stali nierdzewnej. Gdy upewnimy się, że system jest zalany, naciśniemy uruchom. Aby rozpocząć przepływ krwi, naciskasz stop, aby go zatrzymać, a następnie bierzesz czystą probówkę wirówkową o średnicy 1,5 mililitra lub probówkę do płukania i ostrożnie odłączamy światło.

Odłącz tylko jeden, odłącz rurkę od jednego portu urządzenia. Po odłączeniu tej rurki włożymy ją do rurki fendora o długości 1,5 mil. Naciśniemy run, aby ponownie rozpocząć przepływ krwi.

A kiedy widzimy, że tworzy się kropla krwi, zatrzymujemy pompę i wkładamy ją do wlotu, który właśnie otworzyliśmy w urządzeniu. Naciśniemy run, aby rozpocząć przepływ krwi i ustawimy minutnik na pięć minut. Chcemy mieć pewność, że krew równomiernie wypełnia wszystkie komory i że w urządzeniu nie ma widocznych pęcherzyków powietrza.

Jeśli znajdują się pęcherzyki powietrza, które blokują przepływ do którejkolwiek z komór, możesz wziąć pęsetę i przeciągnąć ją wzdłuż małych kanałów, które prowadzą do komór wychwytywania lub małych kanałów, które wychodzą z komór wychwytywania. To urządzenie ładnie się napełnia, więc po pięciu minutach naciskasz stop na pompie strzykawkowej, aby zatrzymać przepływ krwi, poluzowujesz zacisk strzykawki i wyjmujesz go z uchwytu pompy strzykawki. Następnie użyjemy strzykawki numer trzy, która jest załadowana PBS wolnym od nukleazy, którego zamierzamy użyć, w zasadzie zamierzamy ponownie, upewnić się, że powierzchnia urządzenia jest złączona, aby uniknąć pęcherzyków powietrza, stukniemy w strzykawkę, aby je wykonać, upewnij się, że wszelkie pęcherzyki powietrza znajdują się w górnej części korpusu strzykawki.

Poluzuj ramię pompy strzykawkowej i włóż strzykawkę z trzema młynkami do pompy. Dokręcić strzykawkę, a następnie wcisnąć tłok w dół, aż zetknie się z tłokiem strzykawki. Wciskamy run i czekamy, aż płyn zaleje urządzenie i czekamy, aż na końcu igły ze stali nierdzewnej pojawi się kropla.

Kiedy widzisz, że tworzy się kropla, zatrzymujesz pompę. Wyjmiemy krew, końcówkę ze stali nierdzewnej, na której jest krew. Włożymy bufor mycia i naciśniemy run.

I pozwolimy, żeby to trwało przez pięć minut. I powinieneś wziąć czyste wycieranie i po prostu wytrzeć niewielką ilość krwi, która może znajdować się na wlocie lub wylocie Po pięciu minutach działania bufora myjącego przez urządzenie, urządzenie powinno być całkowicie oczyszczone z krwi i widać, że w zasadzie w urządzeniu nie pozostanie żadna czerwona krew, Urządzenie będzie wyglądało na czyste. Więc to, co zamierzamy zrobić, to po pięciu minutach zatrzymamy działanie bufora myjącego.

I znowu, zdejmiemy strzykawkę z pompy strzykawkowej. Zamierzamy zakryć rurkę mikrowirówki o grubości 1,5 mililitra bezpośrednio na elastycznej rurce wylotowej. Ostrożnie podniesiemy rurkę, rurkę do mikrowirówki, wyciągając rurkę odpływową z urządzenia.

Wyrzucimy to do pojemnika na zagrożenie biologiczne. W zestawie znajduje się nowa rurka wylotowa, która w rzeczywistości jest wykonana z teflonu. Ma ponownie końcówkę ze stali nierdzewnej.

Zamierzamy wymienić starą rurkę wylotową na nową rurkę wylotową. Weźmiemy tę rurkę wylotową i spróbujemy ją zgiąć w kształcie litery U lub V. A także z zestawem jest kolumna rozdrabniacza kaya, która ścina DNA i zasadniczo homogenizuje życie komórki.

Więc zamierzamy otworzyć fioletową nasadkę kolumny niszczarki i umieścić rurkę wylotową w kolumnie niszczarki Kay. Wyjmujemy z zestawu strzykawkę numer dwa, która mówi, że do RLT zamierzamy jej użyć. Jest to standardowa strzykawka BD o grubości jednego mili z końcówką o rozmiarze 22, ze stali nierdzewnej.

Użyjemy tego do wstrzyknięcia 350 mikrolitrów standardowego RLT firmy kyogen do urządzenia. Ponieważ urządzenie ma martwą objętość około 50 mikrolitrów, to, co chcemy zrobić, to wstrzyknąć RLT, ale za RLT chcemy wstrzyknąć korek powietrza, aby uwolnić tę martwą objętość urządzenia do kolumny niszczarki chi. Sposób, w jaki to robimy, polega na tym, że bierzemy naszą strzykawkę, ciągniemy, pobieramy 350 mikrolitrów powietrza, a następnie 350 mikrolitrów lub 0,35 mililitra RLT i RLT znajduje się teraz na dnie strzykawki.

Oprzyj się pokusie odwrócenia strzykawki i wstrzyknięcia powietrza. Powietrze jest po to, aby upewnić się, że dostarczymy cały RLT do naszej kolumny niszczarki Kay. Wyciągniemy rurkę z bufora do mycia.

Zamierzamy włożyć naszą strzykawkę z RLT i powoli wstrzyknąć RLT do urządzenia przez około 30 sekund, upewniając się, że rurka wylotowa wyrzuca odpady do kolumny niszczarki chi. Gdy powietrze zacznie być wstrzykiwane do urządzenia, naciskasz na piórosłupiec i czekasz, aż cały płyn zostanie uwolniony do kolumny Kay Shredder. Włączamy kolumnę rozdrabniacza kay i kręcimy ją na mikrośrodkowej fudze z wagą na 15 000 obr./min lub maksymalnych obrotach na stołowym bezpieczniku mikrocentralnym przez dwie minuty.

Więc po obracaniu kolumny przez dwie minuty, zamierzamy pobrać z niej próbkę, która teraz znajduje się w RLT i zamierzamy umieścić ją w jednej z dostarczonych fiolek kriogenicznych z fioletową nasadką. Jeśli pracujesz z próbką kliniczną, pobierz próbki tych fiolek kriogenicznych, oznaczysz je na początku eksperymentu. Oto lizat w fiolce kriogenicznej.

Ta kriofiolka jest natychmiast umieszczana w zamrażarce o temperaturze minus 80 stopni AC C i przechowywana do wysyłki lub późniejszej ekstrakcji RNA. Jest to więc alternatywny protokół izolacji neutrofili. Zamiast lizować komórki buforem RLT, zamierzamy wybarwić je standardowym barwnikiem histologicznym.

Plama. Wyjmujemy więc zapieczętowane urządzenie z torby i ponownie je rozpakowujemy, notujemy numer partii na urządzeniu i umieszczamy szalkę Petriego. W uchwycie na szalkę Petriego.

Weźmiemy strzykawkę o średnicy jednego miliona z strzykawki w torebce numer jeden, załadujemy do niej 700 mikrolitrów krwi i wstrzykniemy połowę z niej 350 mikrolitrów do probówki DPH. Odłożymy to na bok. Weź strzykawkę czwartą, która ma rurkę, której użyjemy do wyboru, wstrzyknij krew do urządzenia.

Będzie trzymać podstawę igły od końcówki rurki w sposób chemiczny. Zdejmij korpus strzykawki i napełnij przynętę. Adapter zbuforuje i zutylizuje tę strzykawkę.

Włożymy strzykawkę zawierającą krew do igły za pomocą chusteczki chemicznej, aby zebrać wszelkie wycieki. Stukniemy w strzykawkę, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza na połączeniu między igłą a korpusem strzykawki. Załadujemy strzykawkę do pompy strzykawkowej, zalejemy rurkę, naciskając ruchome ramię pompy strzykawkowej.

Odłączymy rurkę od jednego z gniazd urządzenia, urządzenia przechwytującego, i umieścimy ją w rurze o średnicy 1,5 milimetra. A potem zaczniemy płynąć krwią, naciskając przycisk na pompę strzykawkową. Poczekamy, aż na końcówce ze stali nierdzewnej utworzy się kropla krwi.

Gdy kropla się uformuje, naciśnij stop, zetrzyj tę krew, włóż ją do urządzenia i naciśnij uruchom. Teraz ustawiamy minutnik na pięć minut. W porządku, po przepłynięciu przez urządzenie przez pięć minut, naciśnij stop na pompie strzykawkowej i zwolnij strzykawkę.

I zamierzamy zastąpić tę strzykawkę strzykawką o grubości trzech mililitrów zawierającą nasz bufor do mycia, który jest tylko jednym XPBS. Ponownie chcemy się upewnić, że górna część urządzenia jest złączona, a następnie usuniemy końcówkę igły zawierającą krew lub plus run. Rozpocznij gruntowanie urządzenia.

Będziemy kropelkować formy, wkładamy je do urządzenia i naciskamy, aby usunąć krew z rurki wlotowej lub wyjściowej, a następnie pozwolimy jej płynąć przez pięć minut po etapie mycia. Ponownie zatrzymamy pompę strzykawkową i wyjmujemy strzykawkę z uchwytu pompy. Aby wykonać standardowe podtrzymywanie GIM, najpierw naprawimy komórki i odwodnimy je za pomocą 100% metanolu.

Więc my, mamy strzykawkę, strzykawkę o grubości trzech mil z fabrycznie załadowanym metanolem. Ponownie zalejemy strzykawkę, upewnimy się, że metanol płynie, zatrzymamy pompę strzykawkową, włożymy ją do urządzenia i naciśniemy przycisk uruchom. Zamierzamy je naprawić w tym roztworze metanolu przez dwie do czterech minut.

Więc po dwóch do czterech minutach utrwalania i metanolu, zatrzymujemy pompę, wypuszczamy strzykawkę z metanolem, a tutaj załadujemy strzykawkę, strzykawkę o średnicy trzech mil zawierającą eem sustain standard eem sustain firmy Sigma rozcieńczoną od jednego do pięciu w wodzie dejonizowanej. Po rozcieńczeniu, załadowaliśmy do strzykawki, a na końcu strzykawki dołączamy filtr 0,8 mikrona, aby odfiltrować wszelkie cząsteczki, które dostaną się do środka, co skończyłoby się zatkaniem urządzenia. Plama przez pięć do 10 minut.

A potem spłuczemy wodą Deion i. Więc po pięciu do 10 minutach barwienia zatrzymamy pompę strzykawkową i zamienimy strzykawkę z buforem barwiącym na strzykawkę zawierającą wodę dejonizowaną, w zasadzie będziemy zmywać, aż zobaczymy, że niebieski kolor SAI został wypłukany z urządzenia. Po wypłukaniu nadmiaru gim sustain z urządzenia, zatrzymujemy roztwór myjący.

A potem zamierzamy usunąć strzykawkę z wodą z wlotu. Następnie weźmiemy rurkę wylotową urządzenia. Zamierzamy chwycić tę rurkę na końcu naszą pęsetą.

Jest to elastyczna rurka tigon i zamierzamy włożyć ją z powrotem do wlotu urządzenia. To uszczelnia urządzenie i utrzymuje nawodnienie komórek oraz ich morfologię w stanie nienaruszonym. Teraz mój współpracownik, dr John Hong Chang, pokaże alternatywny protokół izolacji limfocytów CD z czterema dodatnimi limfocytami, a następnie barwienia immunofluorescencyjnego bezpośrednio w urządzeniu mikroprzepływowym.

Więc nazywam się Shong Hong i dzisiaj zamierzam zademonstrować wam, barwienie komórek w urządzeniu mikroprzepływowym na tym etapie może już pokazać, jak używać urządzenia do izolacji mikro flic immunopowinowactwa do specyficznego izolowania komórek krwi od bezprecedensowej krwi pełnej. W tym celu chce wprowadzić w komórkach i uzyskać z nich białko i zawartość DNA. Cóż, na potrzeby moich badań jestem zainteresowany pobraniem komórek, a następnie uzyskaniem liczby komórek, na przykład, aby uzyskać liczbę czterech komórek CD z krwi pełnej i użyć tego jako wskaźnika do celów diagnostycznych.

Tak więc używane urządzenie jest bardzo podobne do urządzenia Kena. Wykonany jest z komory prostej P-D-M-S-A. Geometria jest nieco inna, więc parametry pracy są nieco inne, podczas gdy ogólnie ogólna procedura obsługi jest bardzo podobna.

Pominę więc wszystkie etapy wychwytywania i płukania komórek i przejdę bezpośrednio do etapu barwienia komórek w procedurach liczenia komórek. Więc tutaj mam urządzenie, które składa się już z połówek komórek pobranych z pełnej krwi, a urządzenie jest już przepłukane PBS. Tak więc wychodzące komórki zostały już wypłukane z urządzenia, a ja przygotowałem z wyprzedzeniem mieszaninę przeciwciał, która jest używana specjalnie do oznaczania komórek, które zostały wyizolowane w urządzeniu.

Tak więc stężenie przeciwciał, którego tutaj użyliśmy, zostało zoptymalizowane pod kątem barwienia komórek o bardzo wysokiej intensywności fluorescencji pod mikroskopem fluorescencyjnym. Procedura jest więc dość prosta. Ładujemy strzykawkę wypełnioną roztworem przeciwciał na pompę strzykawkową, a następnie upewniamy się, że natężenie przepływu jest ustawione na odpowiednie parametry, których potrzebujemy.

A potem uruchomimy pompę strzykawkową, obserwujemy koniec rurki, upewniamy się, że roztwór już wypływa, aby nie było już pęcherzyków w rurce. A potem możemy podłączyć rurkę do urządzenia mikroprzepływowego, do którego mamy przechwycone komórki. Więc teraz przeciwciało przepływa do urządzenia, aby zabarwić komórki, które wyizolowaliśmy, do natężenia przepływu tutaj, używam pięciu mikrolitrów na minutę, ale w zależności od geometrii urządzenia, mogą istnieć różne parametry przepływu, które chcesz użyć do swojego celu.

Przez pięć minut wlekaszemy przepływ roztworu przeciwciała, co wystarcza do zastąpienia całego roztworu w kanale mikrowirusowym. Więc po wstrzyknięciu przeciwciał zatrzymamy przepływ. Więc my, unosimy się w przeciwciałie w ilości pięciu mikrolitrów na minutę przez pięć minut, aby zastąpić cały roztwór w mikrokanale.

Następnie zatrzymujemy przepływ i pozwalamy urządzeniu inkubować i utrzymywać temperaturę pokojową przez 30 minut. Więc należy to zrobić w ciemności, aby przeciwciało nie zostało wygaszone, podczas gdy komórki, przeciwciała fluorescencyjne mogą zostać wygaszone, podczas gdy komórki są inkubowane z przeciwciałem barwiącym. Tak więc po barwieniu przez zwykle od 15 minut do 30 minut, po prostu odłączymy rurkę od urządzenia i zastąpimy strzykawkę z przeciwciałami strzykawką buforową, aby zmyć niezwiązane przeciwciało z urządzenia.

Tak więc roztwór myjący zawiera 1% BSA w roztworze PBS. BSA służy do blokowania braku wiązania przeciwciał na powierzchni i zrobimy to samo. Więc najpierw dostosowujemy natężenie przepływu w pompie strzykawkowej, aby upewnić się, że jest to właściwe natężenie przepływu, którego chcieliśmy, a następnie uruchamiamy pompę strzykawkową i upewniamy się, że płyn faktycznie wypływa z rurki, zanim podłączymy ją do urządzenia.

Celem tego jest to, aby w rurki nie pozostały bąbelki, takie jak resztki. Więc kiedy wstrzykujemy, żaden pęcherzyk nie dostaje się do naszego urządzenia. Więc po prostu podłączamy rurkę do urządzenia i pozwalamy jej płynąć przez kolejne pięć minut, aby zastąpić całe wypłukanie, całe niezwiązane przeciwciało z urządzenia.

Po etapie mycia naprawimy komórki za pomocą 1% PFA. Ma to na celu to, aby urządzenie mogło być przechowywane przez kilka tygodni do kilku tygodni, jeśli obrazowanie można wykonać od razu. Procedura jest więc dość prosta.

Jest to podobne do tego, co robiliśmy wcześniej. Ładujemy strzykawkę do pompy, dostosowujemy natężenie przepływu do tego, które chcieliśmy, a następnie uruchamiamy pompę strzykawkową i podłączamy rurkę do naszego urządzenia, aby wstrzyknąć roztwór paraform IDE, który jest utrwalaczem do naszego urządzenia w celu utrwalenia komórek. Ponownie pozwalamy mu płynąć przez około pięć minut.

Tak więc PFA zastępuje cały bufor w urządzeniu, aby naprawić wszystkie komórki w urządzeniu. Tak więc po etapie naprawy PFA po prostu zdejmujemy strzykawkę PFA i teraz urządzenie jest gotowe do obrazowania. W niektórych przypadkach ludzie chcą mieć barwienie jądra, które można pokazać do nałożenia na barwienie markerem powierzchni komórki.

W tym celu wykonamy barwienie jądra za pomocą DPI na końcu. Więc po prostu ładujemy strzykawkę DPI po włączeniu pompy strzykawkowej i przepływie DPI do naszego urządzenia. Więc teraz jądro zostanie zabarwione w tych komórkach, aby pokazać lokalizację komórek.

A ten, obraz barwienia DPI można później nałożyć na barwienie markerem powierzchniowym, aby pokazać, gdzie znajdują się komórki. Tak więc pod koniec barwienia DPI musimy ponownie zmyć pasmo L DPI P roztworem buforowym. Tak więc ponownie używamy PBS zawierającego 1% BSA do zmywania wychodzących dpi.

A operacja jest podobna do tego, co robiliśmy wcześniej. Po prostu podłączamy strzykawkę z buforem do naszego urządzenia i pozwalamy, aby bufor przepływał do urządzenia, aby zmyć niezwiązany dap. To jest cała procedura barwienia komórek w urządzeniu z mikropłynem.

A po wszystkich procedurach barwienia urządzenia są gotowe do obrazowania. A ponieważ przeprowadziliśmy naprawę PFA, urządzenia mogą być również przechowywane przez kilka tygodni. Jeśli obrazowanie nie może być wykonane od razu.