Platforma mikroprzepływowa z multipleksowaną detekcją elektroniczną do przestrzennego śledzenia cząstek

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zaprezentowanie platformy mikrofluidycznej, która łączy detekcję impulsową oporową z kodowym dostepem wielokanalowym (CDMA) w celu multipleksowania detekcji i pomiaru wielkości cząstek w wielu kanałach mikrofluidycznych. Technologia ta, nazwana mikrofluidycznym CODES, może pomóc w realizacji w pełni zintegrowanych i prawdziwie przenośnych urządzeń typu lab-on-a-chip, które są odpowiednie do testów w punkcie opieki (point-of-care) nad próbkami biologicznymi w warunkach ograniczonych zasobów. Główną zaletą tej techniki jest możliwość elektronicznego śledzenia przestrzennej i czasowej manipulacji cząstkami na chipie mikrofluidycznym, co eliminuje konieczność stosowania zewnętrznego instrumentu, takiego jak mikroskop.

Nasza technologia jest kompatybilna z miękką litografią i może zostać łatwo zintegrowana z urządzeniem mikrofotonicznym, w którym cząstki są frakcjonowane w celu zapewnienia bezpośredniego odczytu elektronicznego, podobnego do licznika Coultera. Aby rozpocząć konstrukcję urządzenia mikroprzepływowego, należy wygenerować zestaw czterech siedmiobitowych kodów Gold. Następnie, w oparciu o kody Gold, należy zaprojektować cztery unikalne układy elektrod, korzystając z oprogramowania do wspomaganego komputerowo projektowania (CAD), takiego jak AutoCAD.

Na koniec należy zamówić u dostawcy fotomasek produkcję fotomaski z zaprojektowanym układem elektrod. Następnie czterocalowy płytek borokrzemowego szkła należy zanurzyć w roztworze piranha w stosunku pięć do jednego w temperaturze 120 °C przez 20 minut. Po czyszczeniu płytkę należy podgrzać na płycie grzejnej w temperaturze 200 °C przez 20 minut, aby odparować resztki wody.

Umieść czysty i suchy wafer w powlekaczu wirówkowym. Nanieś 2 mililitrów roztworu negatywowego fotorezystu na wafer i wykonaj powlekanie wirówkowe przy 3000 obrotach na minutę przez 40 sekund. Osusz powleczony wafer na płycie grzejnej w temperaturze 150 stopni Celsjusza przez jedną minutę.

Przykryj wafelek maską chromową z pożądanym wzorem elektrod. Naświetl powierzchnię fotorezystu z maską światłem UV o długości fali 365 nanometrów, aby uzyskać dawkę 225 milidżuli na centymetr kwadratowy. Następnie wypiecz naświetlony fotorezyst na płycie grzewczej w temperaturze 100 stopni Celsjusza przez jedną minutę.

Zanurz wafelek w wywoływaczu fotorezystu na 15 sekund, następnie przemyj wafelek z wzorem w delikatnym strumieniu wody dejonizowanej i wysusz go strumieniem gazu azotowego. Następnie umieść wafelek z wzorem w metalizatorze z wiązką elektronów. Nanieś na wafelek warstwę chromu o grubości 20 nm oraz warstwę złota o grubości 80 nm z prędkością jednego Angstroma na sekundę.

Następnie wytraw podkład z fotorezystu, poddając wafel pokryty metalem obróbce ultradźwiękowej w acetonie przez 30 minut przy częstotliwości 40 kHz i amplitudzie 100%. Użyj piły do dicingu, aby pociąć wafel na mniejsze kawałki zgodnie z potrzebami. Aby rozpocząć wytwarzanie formy kanału mikrofluidycznego, oczyść i wysusz czterocalowy wafel krzemowy w ten sam sposób, co wafel borokrzemianowy opisany wcześniej.

Umieść podłoże krzemowe w powlekarce wirującej i nanieś cztery mililitry roztworu negatywowego fotorezystu. Poddaj podłoże wirowaniu przy 500 rpm przez 15 sekund, następnie przy 1 000 rpm przez 15 sekund i na koniec przy 3 000 rpm przez 60 sekund. Połóż podłoże stroną roboczą do góry na nasączonej acetonem chusteczce do czystych pomieszczeń, aby usunąć pozostałości fotorezystu z tyłu i z krawędzi podłoża.

Wypiecz wafelek w temperaturze 65 °C przez jedną minutę, a następnie w 95 °C przez dwie minuty. Umieść chromową maskę z wzorem kanałów mikroprzepływowych na suchym wafelku. Naświetl fotorezyst światłem UV o długości fali 365 nm z dawką 180 mJ/cm², a następnie ponownie wypiecz wafelek w temperaturach 65 i 95 °C odpowiednio przez jedną i dwie minuty.

Umieść wzorowany wafelek w naczyniu z wywoływaczem fotorezystu i delikatnie wstrząsaj naczyniem przez trzy minuty. Przepłucz wywołany wafelek w izopropanolu, a następnie wysusz go strumieniem gazu azotowego. Wypal wafelek w temperaturze 200 °C przez 30 minut, a następnie użyj profilometru, aby sprawdzić, czy warstwa fotorezystu tworząca wzór ma jednorodną grubość na całym wafelku.

Umieść wafer w deskryptorze próżniowym wraz z 200 µL trichlorosilanu w odkrytej płytce Petriego. Pozostaw wafer w deskryptorze z trichlorosilanem przez osiem godzin w celu sylanizacji powierzchni wafera. Aby rozpocząć montaż urządzenia, użyj ogólnej taśmy do czystych pomieszczeń, aby przymocować formę z wafera krzemowego w płytce Petriego o średnicy 150 mm.

Do szalki Petriego należy dodać 50 g prepolimeru polidimetylosiloksanu w proporcji 10:1, a następnie odgazować mieszaninę w deskrykatorze próżniowym przez jedną godzinę. Odgazowaną mieszaninę utwardzamy w temperaturze 65 °C przez co najmniej cztery godziny. Za pomocą skalpela należy wyciąć utwardzoną warstwę PDMS, a następnie oddzielić ją od formy pęsetą.

Potnij PDMS na małe kawałki. Wykonaj otwory wlotowe i wylotowe kanałów mikrofluidycznych za pomocą punchera do biopsji. Aby oczyścić mikroobrobioną powierzchnię, przyłóż warstwę PDMS wzorem do dołu do taśmy do pomieszczeń czystych.

Wypłucz wcześniej przygotowaną szklaną podkładkę elektrody acetonem, izopropanolem i wodą zdejonizowaną. Wysusz podkładkę strumieniem gazu azotowego. Umieść warstwę PDMS oraz podkładkę w generatorze plazmy RF ustawionym na 100 milliwatts, stroną z mikromaszynami skierowaną do góry.

Aktywuj powierzchnie mikromaszyn w plazmie tlenowej przez 30 sekund. Następnie użyj mikroskopu optycznego, aby wyrównać warstwę PDMS z wzorem względem elektrod powierzchniowych. Po wyrównaniu doprowadź do fizycznego kontaktu powierzchni, aby przytwierdzić warstwę PDMS do podłoża szklanego.

Kluczowe jest, aby wzór elektrod powlekających na szklanym podłożu był odpowiednio wyrównany z kanałami mikrofluidycznymi z PDMS. Po prawidłowym wyrównaniu oddziaływanie cząsteczek z elektrodą powierzchniową wygeneruje pożądany przebieg kodu dla multipleksowania. Wypiecz zmontowane urządzenie w temperaturze 70 °C przez pięć minut, stroną szklaną do dołu.

Na koniec przylutuj przewody do pól kontaktowych elektrod, aby zakończyć montaż urządzenia. Aby rozpocząć eksperyment, umieść urządzenie mikroprzepływowe na stoliku mikroskopu optycznego. Podłącz elektrodę odniesienia urządzenia do portu wyjściowego sygnału wzmacniacza lock-in i przyłóż falę sinusoidalną o częstotliwości 400 kHz.

Podłącz dodatnią i ujemną elektrodę czujnika do dwóch niezależnych wzmacniaczy transimpedancyjnych. Podłącz oba wzmacniacze transimpedancyjne do różnicowych wejść napięciowych wzmacniacza lock-in w taki sposób, aby dodatni sygnał z czujnika był odejmowany od ujemnego sygnału z czujnika. Podłącz wyjście demodulatora wzmacniacza lock-in do jednostki akwizycji danych.

W oprogramowaniu do akwizycji danych ustaw częstotliwość próbkowania dla wyjścia wzmacniacza synchronicznego na 1 Megahertz. Przygotuj szybką kamerę do optycznego zapisu pracy urządzenia widzianego pod mikroskopem. Pobierz przygotowaną zawiesinę komórkową do strzykawki.

Zabeziecz strzykawkę z próbką w pompie strzykawkowej i podłącz strzykawkę do kanału wlotowego. Skieruj kanał wylotowy do pojemnika na odpady. Użyj pompy strzykawkowej, aby przepchnąć zawiesinę komórkową przez urządzenie ze stałą prędkością przepływu, rejestrując sygnał modulacji impedancji.

Po zakończeniu eksperymentu przetworzyć dane elektryczne za pomocą oprogramowania analitycznego. Porównać przetworzony sygnał elektryczny z obrazami z kamery wysokich prędkości w celu stworzenia krzywej kalibracyjnej dla wielkości komórek. Zawiesina komórkowa została przepłycona przez mikrofluidyczny czujnik z czterema unikalnymi wzorami elektrod pochodzącymi z ortogonalnych kodów czujników.

Wszystkie cztery sygnały z czujników zostały zarejestrowane z jednego wyjścia elektrycznego. Poszczególny czujnik przypisany do każdego zarejestrowanego sygnału zidentyfikowano poprzez korelację zarejestrowanych sygnałów z wszystkimi możliwymi kodami, co pozwoliło uzyskać wyraźnie rozróżnialne piki autokorelacji. Kształty fal generowane przez sygnały zakłócające, powstałe w wyniku jednoczesnej detekcji komórek we wszystkich czterech kanałach, zostały rozdzielone za pomocą algorytmu iteracyjnego.

Zarejestrowany przebieg fali skorelowano ze wszystkimi możliwymi kodami i zidentyfikowano najwyższy szczyt autokorelacji. Odpowiedni sygnał z pojedynczego czujnika został zrekonstruowany i odjęty od wejściowego przebiegu fali. Sygnał rezydualny przekazano do następnej iteracji jako sygnał wejściowy i proces kontynuowano do momentu, aż sygnał rezydualny nie generował już szczytów autokorelacji.

Szacowane sygnały zostały doprecyzowane z wykorzystaniem algorytmu optymalizacyjnego dążącego do uzyskania najlepszego dopasowania między zrekonstruowanymi a oryginalnymi zarejestrowanymi przebiegami fal przy użyciu metody najmniejszych kwadratów. Położenie komórki, jej rozmiar oraz czas przejścia przez czujnik określono następnie na podstawie numeru kanału, amplitudy, czasu trwania oraz względnego czasu wystąpienia szacowanych sygnałów z czujników. Procedurę zwalidowano poprzez porównanie sygnałów elektrycznych z pomiarami optycznymi z kamery wysokiej rozdzielczości.

Po opanowaniu technika ta jest bardzo łatwa w implementacji, ponieważ jest bardzo prosta pod względem sprzętowym. Nie posiada ona aktywnych komponentów na chipie. Jest bezpośrednio kompatybilna z miękką litografią, a przetwarzanie sygnału opiera się na prostym algorytmie obliczeniowym.

Postępując zgodnie z niniejszym protokołem, można wykonać układy mikroprzepływowe z kodowanymi multipleksowymi czujnikami elektrycznymi oraz dekodować sygnały elektryczne do pomiarów bioanalitycznych. Ta wszechstronna i skalowalna technologia detekcji elektronicznej może być łatwo zintegrowana z różnymi urządzeniami mikroprzepływowymi w celu realizacji analiz ilościowych poprzez czasowo-przestrzenne śledzenie cząstek podczas ich przetwarzania na chipie. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak projektować, wytwarzać i wdrażać technologię mikroprzepływową CODES.