Platforma mikroprzepływowa z multipleksowaną detekcją elektroniczną do przestrzennego śledzenia cząstek

Ogólnym celem tej procedury jest zademonstrowanie platformy mikroprzepływowej, która łączy rezystancyjne wykrywanie impulsów z wielokrotnym dostępem do podziału kodu w celu multipleksowania wykrywania i wymiarowania cząstek w wielu kanałach mikroprzepływowych. Technologia ta, nazwana mikroprzepływowymi kodami, może pomóc w realizacji w pełni zintegrowanych i prawdziwie przenośnych urządzeń chipowych do laboratoriów, które dobrze nadają się do testowania próbek biologicznych w miejscu opieki nad pacjentem w warunkach ograniczonych zasobów. Główną zaletą tej techniki jest to, że może ona elektronicznie śledzić przestrzenną, czasową manipulację cząstkami na chipie mikroprzepływowym, eliminując potrzebę korzystania z zewnętrznego instrumentu, takiego jak mikroskop.

Nasza technologia jest kompatybilna z miękką litografią i może być łatwo zintegrowana z urządzeniem mikrofonicznym, w którym cząstki są frakcjonowane w celu zapewnienia bezpośredniego odczytu elektronicznego, podobnego do licznika Coredler. Aby rozpocząć budowę urządzenia mikroprzepływowego, należy wygenerować zestaw czterech, siedmiobitowych kodów w złocie. Następnie zaprojektuj cztery unikalne układy elektrod w oparciu o złote kody, korzystając z projektowania wspomaganego komputerowo lub oprogramowania CAD, takiego jak AutoCAD.

Na koniec zleć fotomaskę z zaprojektowanym układem elektrod wyprodukowaną przez dostawcę Photomask. Następnie namocz czterocalową płytkę ze szkła borokrzemianowego w roztworze piranii pięć do jednego w temperaturze 120 stopni Celsjusza przez 20 minut. Po oczyszczeniu podgrzej wafel na płycie grzejnej w temperaturze 200 stopni Celsjusza przez 20 minut, aby odparować resztki wody.

Umieść czystą, suchą wafel w powlekarce wirowej. Nałóż 2 mililitry ujemnego roztworu fotorezystu na płytkę i wiruj z prędkością 3000 obrotów na minutę przez 40 sekund. Suszyć wirową płytkę na gorącej płycie w temperaturze 150 stopni Celsjusza przez minutę.

Przykryj wafel chromowaną maską w żądanym wzorze elektrody. Wystaw zamaskowaną powierzchnię fotorezystu na działanie światła UV o długości 365 nanometrów, aby osiągnąć 225 milidżuli na centymetr kwadratowy. Piecz naświetlony fotorezystor na gorącej płycie w temperaturze 100 stopni Celsjusza przez minutę.

Zanurz wafel w wywoływaczu fotorezystu na 15 sekund, a następnie umyj wafel wzoru w delikatnym sprayu wody dejonizowanej i wysusz wafel pod strumieniem gazowego azotu. Następnie umieść wzorzystą płytkę w metalowym parowniku z wiązką elektronów. Umieść warstwę chromu o grubości 20 nanometrów i warstwę złota o grubości 80 nanometrów na płytce z szybkością jednego angstrema na sekundę.

Następnie wytrawić leżący pod spodem fotorezystor za pomocą ultradźwiękowego ogrzewania metalowej płytki w acetonie przez 30 minut przy 40 kilohercach i amplitudzie 100%. Użyj piły do krojenia w kostkę, aby w razie potrzeby pokroić wafel na mniejsze kawałki. Aby rozpocząć wytwarzanie formy kanału mikroprzepływowego, wyczyść i wysusz czterocalową płytkę krzemową w taki sam sposób, jak opisaną wcześniej płytkę borokrzemianową.

Umieść wafel krzemowy w powlekarce wirowej i nałóż cztery mililitry ujemnego roztworu fotorezystu. Wiruj wafel z prędkością 500 obr./min przez 15 sekund, następnie z prędkością 1 000 obr./min przez 15 sekund, a na koniec z prędkością 3 000 obr./min przez 60 sekund. Umieść wafel stroną zadrukowaną do góry na chusteczce do pomieszczeń czystych nasączonej acetonem, aby usunąć resztki fotorezystu z tyłu i krawędzi płytki.

Wafelek pieczemy w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez minutę, a następnie w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez dwie minuty. Umieść wzór chromowanej maski dla kanałów mikroprzepływowych na suchej płytce. Wystaw fotorezyst na działanie światła UV o długości 365 nanometrów o natężeniu 180 milidżuli na centymetr kwadratowy, a następnie ponownie upiecz wafel w temperaturze 65 i 95 stopni Celsjusza odpowiednio przez jedną i dwie minuty.

Umieść wzorzystą płytkę w pojemniku z wywoływaczem fotorezystu i delikatnie potrząsaj pojemnikiem przez trzy minuty. Opłucz wytworzony wafel w izopropanolu i wysusz go pod strumieniem gazowego azotu. Piecz wafel w temperaturze 200 stopni Celsjusza przez 30 minut, a następnie za pomocą profilometru sprawdź, czy wzór fotorezystu jest równomiernie gruby na całej płytce.

Umieść wafel w eksykatorze próżniowym wraz z 200 mikrolitrami trichlorosilanu na odkrytej szalce Petriego. Pozostawić wafel w eksykatorze z trichlorosilanem na osiem godzin w celu sylianizowania powierzchni płytki. Aby rozpocząć montaż urządzenia, użyj taśmy do pomieszczeń czystych ogólnego przeznaczenia, aby przymocować formę do wafli krzemowych na szalce Petriego o średnicy 150 milimetrów.

Dodać 50 gramów mieszaniny prepolimeru polidimetylosiloksanu w proporcji 10 do jednego na szalkę Petriego i odgazowywać mieszaninę w eksykatorze próżniowym przez jedną godzinę. Odgazowaną mieszaninę utwardzić w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez co najmniej cztery godziny. Za pomocą skalpela wytnij utwardzoną warstwę PDMS, a następnie oderwij utwardzoną warstwę od formy za pomocą pęsety.

Pokrój PDMS na małe kawałki. Przebić otwory kanałów mikroprzepływowych wlotowych i wylotowych za pomocą dziurkacza do biopsji. Umieść wzór warstwy PDMS stroną zadrukowaną do dołu na przezroczystej taśmie pokojowej, aby oczyścić mikroobrabianą powierzchnię.

Przygotowane wcześniej podłoże ze szkła nośnego elektrody przepłukać acetonem, izopropanolem i wodą dejonizowaną. Wysuszyć podłoże pod strumieniem gazowego azotu. Umieść warstwę PDMS i podłoże w generatorze plazmy RF ustawionym na 100 miliwatów bokami mikromaszyny skierowanymi do góry.

Aktywuj powierzchnie mikromaszyny w plazmie tlenowej na 30 sekund. Następnie użyj mikroskopu optycznego, aby wyrównać warstwę wzoru PDMS z elektrodami powierzchniowymi. Po wyrównaniu pozwól, aby powierzchnie zetknęły się fizycznie, aby uszczelnić warstwę PDMS na szklanym podłożu.

Bardzo ważne jest, aby wzór elektrody powlekającej na podłożu szklanym był odpowiednio wyrównany z kanałami mikroprzepływowymi PDMS. Po prawidłowym ustawieniu, oddziaływanie cząstek z elektrodą powierzchniową wygeneruje pożądany przebieg kodu do multipleksowania. Piecz zmontowane urządzenie w temperaturze 70 stopni Celsjusza przez pięć minut, szklaną stroną do dołu.

Na koniec przewody do pól stykowych elektrody, aby zakończyć montaż urządzenia. Aby rozpocząć eksperyment, umieść urządzenie mikroprzepływowe na stoliku mikroskopu optycznego. Podłącz elektrodę odniesienia urządzenia do portu wyjściowego sygnału wzmacniacza typu lock-in i zastosuj falę sinusoidalną o mocy 400 kiloherców.

Podłącz dodatnie i ujemne elektrody czujnika do dwóch niezależnych wzmacniaczy transimpedancji. Podłącz oba wzmacniacze transimpedancji do wejść napięcia różnicowego wzmacniacza typu lock-in z dodatnim sygnałem czujnika, który ma zostać odjęty od ujemnego sygnału czujnika. Podłącz wyjście demodulatora wzmacniacza lock-in do jednostki akwizycji danych.

W oprogramowaniu do akwizycji danych ustaw częstotliwość próbkowania dla wyjścia wzmacniacza lock-in na 1 megaherc. Ustaw szybką kamerę, aby optycznie rejestrować działanie urządzenia widziane pod mikroskopem. Pobrać przygotowaną zawiesinę komórek do strzykawki.

Zabezpiecz strzykawkę z próbką w pompie strzykawkowej i podłącz strzykawkę do kanału wlotowego. Skierować kanał wylotowy do pojemnika na odpady. Użyj pompy strzykawkowej, aby przepchnąć zawiesinę ogniwa przez urządzenie ze stałym natężeniem przepływu, jednocześnie rejestrując sygnał modulacji impedancji.

Po zakończeniu eksperymentu przetwórz dane elektryczne za pomocą oprogramowania analitycznego. Porównaj przetworzony sygnał elektryczny z obrazami z szybkiej kamery, aby utworzyć krzywą kalibracyjną dla rozmiaru komórki. Zawiesina ogniwa została przepuszczona przez czujnik mikroprzepływowy z czterema unikalnymi wzorami elektrod wywodzącymi się z ortogonalnych kodów czujników.

Wszystkie cztery sygnały z czujników były rejestrowane z jednego wyjścia elektrycznego. Indywidualny czujnik powiązany z każdym zarejestrowanym sygnałem został zidentyfikowany poprzez korelację zarejestrowanych sygnałów czujnika ze wszystkimi możliwymi kodami, co dało wyraźnie rozróżnialne piki autokorelacji. Przebiegi wytwarzane przez sygnały zakłócające z jednoczesnej detekcji komórek we wszystkich czterech kanałach zostały rozwiązane za pomocą algorytmu iteracyjnego.

Zarejestrowany przebieg został skorelowany ze wszystkimi możliwymi kodami i zidentyfikowano największy pik autokorelacji. Odpowiedni pojedynczy sygnał czujnika został zrekonstruowany i odjęty od przebiegu wejściowego. Sygnał resztkowy był przekazywany do następnej iteracji jako dane wejściowe, a proces był kontynuowany, aż sygnał szczątkowy nie wytworzył żadnych pików autokorelacji.

Oszacowane sygnały zostały doprecyzowane w oparciu o algorytm optymalizacyjny poszukujący najlepszego dopasowania między zrekonstruowanymi a oryginalnie zarejestrowanymi przebiegami przy użyciu przybliżenia metodą najmniejszych kwadratów. Lokalizacja, rozmiar i czas przejścia przez czujnik zostały następnie określone na podstawie numeru kanału, amplitudy, czasu trwania i względnego czasu szacowanych sygnałów czujnika. Procedura została zwalidowana poprzez porównanie sygnałów elektrycznych z pomiarami optycznymi z kamery o dużej prędkości.

Po opanowaniu tej techniki jest ona bardzo łatwa do wdrożenia, ponieważ jest bardzo prosta z punktu widzenia sprzętu. Nie ma aktywnego komponentu na chipie. Jest bezpośrednio kompatybilny z miękką litografią, a przetwarzanie sygnału opiera się na prostym algorytmie obliczeniowym.

Postępując zgodnie z tym protokołem, można wytwarzać chipy mikroprzepływowe z multipleksowymi czujnikami elektrycznymi opartymi na kodzie i dekodować sygnały elektryczne do pomiarów bioanalitycznych. Ta wszechstronna, skalowalna, elektroniczna technologia wykrywania może być łatwo zintegrowana z różnymi urządzeniami mikroprzepływowymi w celu realizacji testów ilościowych poprzez przestrzenne czasowe śledzenie cząstek podczas ich przetwarzania na chipie. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zaprojektować, wyprodukować i wdrożyć technologię kodów mikroprzepływowych.