Test immunologiczny oparty na nanocząstkach magnetycznych przy użyciu urządzenia mikroprzepływowego

Weźmy urządzenie mikroprzepływowe przymocowane do stolika mikroskopowego, składające się z wlotu do dozowania odczynników, połączonych ze sobą kanałów do przepływu płynów i wylotów do przedmuchiwania płynów.

Główny kanał zawiera centralne, naprzemienne ograniczenie z uwięzionymi zagregowanymi mikrocząstkami żelaza.

Kanały są inkubowane z roztworem blokującym, aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu przeciwciał.

Przelej bufor do mycia, usuwając nadmiar roztworu blokującego.

Wprowadzić zawiesinę immunokompleksu o określonej szybkości przepływu. Immunokompleks składa się z nanocząstek magnetycznych, pokrytych antygenami związanymi z przeciwciałami pierwotnymi, które są dalej wiązane z przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z peroksydazą.

Zastosuj zewnętrzne pole magnetyczne, namagnesowując zagregowane mikrocząstki i przekształcając je w pułapkę magnetyczną do wychwytywania immunokompleksów.

Wprowadzić substrat fluorogenny, który jest przekształcany przez peroksydazę w produkt fluorescencyjny i przepływa przez pułapkę.

Za pomocą mikroskopu porównaj fluorescencję przed i po pułapce, potwierdzając wychwytywanie immunokompleksów.

Napełnij kanały wodą destylowaną za pomocą strzykawki. Zanurz urządzenie w kąpieli ultradźwiękowej na 10 minut. Następnie opróżnij wodę z kanałów urządzenia i za pomocą strzykawki wprowadź 5% roztwór BSA.

Przygotować zawiesinę mikrocząstek żelaza o średnicy 7,5 mikrometra w 5% BSA. Inkubować chip i zawiesinę mikrocząstek z roztworem blokującym przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie wprowadź mikrocząsteczki do chipa za pomocą igły strzykawkowej przez wąż wylotowy kanału bocznego.

Umieść chip pionowo, a następnie obróć go w dwóch krokach po 90 stopni, tak aby mikrocząstki były skierowane i zwarte przy ograniczeniu 5 mikrometrów. Uszczelnij wszystkie węże urządzenia akrylowego ciepłem. Przetnij wąż dopływowy, aż pozostanie tylko kilka milimetrów.

Napełnij igłę dozującą buforem do płukania i włóż ją do odciętego węża. Poczekaj, aż roztwór ocieknie, a następnie podłącz igłę do urządzenia. Odciąć wąż odpływowy od kanału bocznego, a następnie podłączyć do pompy strzykawkowej. Następnie powtórz tę samą procedurę dla węża wylotowego kanału głównego, a następnie przymocuj chip do magnesu.

W celu immunodetekcji utrzymuj przepływ buforu płuczącego przez 10 minut z prędkością 50 mikrolitrów na godzinę. Usunąć pozostały bufor do przemywania z igły dozującej za pomocą mikropipety i dodać 50 mikrolitrów zawiesiny nanocząstek. Płyn zawiesinę nanocząstek przez 7 minut z natężeniem przepływu 100 mikrolitrów na godzinę. Następnie zmień natężenie przepływu na 50 mikrolitrów na godzinę i kontynuuj przepływ przez kolejne 15 minut.

Wymień igłę dozującą i przepływaj bufor do płukania przez 10 minut z tą samą szybkością. Usunąć pozostały bufor do płukania z igły dozującej za pomocą mikropipety i dodać 100 mikrolitrów substratu fluorogenicznego. Dostosuj parametry natężenia przepływu i czasu wprowadzania substratu, pomiaru fluorescencji i etapu mycia.

Aktywuj przepływ wejściowy substratu fluorogenicznego na 6 minut przy 50 mikrolitrach na godzinę. 15 sekund przed zatrzymaniem przepływu substratu włącz fluorescencję mikroskopu. Rozpocznij rejestrowanie obrazu za pomocą oprogramowania kamery mikroskopu na 10 sekund przed zatrzymaniem podłoża przy czasie naświetlania wynoszącym 1,000 milisekund.

Kliknij przycisk start żądanego parametru natężenia przepływu natychmiast po zatrzymaniu zmywania podłoża. Wykonuj obrazowanie przez 6 minut z prędkością jednej klatki na sekundę. Kliknij przycisk start przepływu mycia natychmiast po zatrzymaniu wybranego przepływu pomiarowego.