Name: Platforma mikroprzepływowa do precyzyjnego przetwarzania próbek o małej objętości i jej wykorzystanie do wymiarowania oddzielnych cząstek biologicznych za pomocą mikrourządzenia akustycznego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 32 s
Description: Poznaj metodę automatycznej separacji cząstek w mikroprzepływowym urządzeniu akustycznym. Technika zapewnia precyzję, modularność i minimalną utratę analitu w małych objętościach próbek biologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca została wykonana pod auspicjami Departamentu Energii Stanów Zjednoczonych przez Lawrence Livermore National Laboratory w ramach kontraktu DE-AC52-07NA27344 i częściowo wspierana przez program LLNL Laboratory Directed Research and Development (LDRD), 14-LW-077. Autorzy dziękują Michaelowi Wilsonowi, Markowi Stengleinowi i Joe DeRisi z Uniwersytetu Kalifornijskiego w San Francisco za hojne dostarczenie próbek komórek GGV i Boa. EJF dziękuje za wsparcie ze strony LLNL Lawrence Scholar Graduate Program. MS dziękuje za wsparcie ze strony Biura UC of the President Lab Fees Research Program. LLNL-JRNL-665235

<ol><li>Gossett, D. R., Weaver, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label+free+cell+separation+and+sorting+in+microfluidic+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Label free cell separation and sorting in microfluidic systems.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (8), 3249-3267 (2010).</li>
<li>Lenshof, A., Laurell, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+separation+of+cells+and+particles+in+microfluidic+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Society+Reviews%22%5BJournal%5D)">Continuous separation of cells and particles in microfluidic systems.</a> Chemical Society Reviews. 39 (3), 1203-1217 (2010).</li>
<li>Sajeesh, P., Sen, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle+separation+and+sorting+in+microfluidic+devices+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Microfluidics+and+Nanofluidics%22%5BJournal%5D)">Particle separation and sorting in microfluidic devices a review.</a> Microfluidics and Nanofluidics. 17 (1), 1-52 (2014).</li>
<li>Bhagat, A. A. S., Bow, H., Hou, H. W., Tan, S. J., Han, J., Lim, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+for+cell+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+%26+Biological+Engineering+%26+Computing%22%5BJournal%5D)">Microfluidics for cell separation.</a> Medical & Biological Engineering & Computing. 48 (10), 999-1014 (2010).</li>
<li>McGrath, J., Jimenez, M., Bridle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deterministic+lateral+displacement+for+particle+separation+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Deterministic lateral displacement for particle separation a review.</a> Lab Chip. 14 (21), 4139-4158 (2014).</li>
<li>Jubery, T. Z., Srivastava, S. K., Dutta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dielectrophoretic+separation+of+bioparticles+in+microdevices+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22ELECTROPHORESIS%22%5BJournal%5D)">Dielectrophoretic separation of bioparticles in microdevices A review.</a> ELECTROPHORESIS. 35 (5), 691-713 (2014).</li>
<li>Jin, C., McFaul, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technologies+for+label+free+separation+of+circulating+tumor+cells+from+historical+foundations+to+recent+developments%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Technologies for label free separation of circulating tumor cells from historical foundations to recent developments.</a> Lab on a Chip. 14 (1), 32(2014).</li>
<li>Trujillo, F. J., Juliano, P., Barbosa Cánovas, G., Knoerzer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+suspensions+and+emulsions+via+ultrasonic+standing+waves+%E2%80%93+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrasonics+Sonochemistry%22%5BJournal%5D)">Separation of suspensions and emulsions via ultrasonic standing waves – A review.</a> Ultrasonics Sonochemistry. 21 (6), 2151-2164 (2014).</li>
<li>Bridle, H., Miller, B., Desmulliez, M. P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+microfluidics+in+waterborne+pathogen+monitoring+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Research%22%5BJournal%5D)">Application of microfluidics in waterborne pathogen monitoring A review.</a> Water Research. 55, 256-271 (2014).</li>
<li>Mariella Jr, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+preparation+the+weak+link+in+microfluidics-based+biodetection%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+microdevices%22%5BJournal%5D)">Sample preparation the weak link in microfluidics-based biodetection.</a> Biomedical microdevices. 10 (6), 777-784 (2008).</li>
<li>Gor’kov, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+forces+acting+on+a+small+particle+in+an+acoustic+field+in+an+ideal+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Soviet+Physics+Doklady%22%5BJournal%5D)">On the forces acting on a small particle in an acoustic field in an ideal fluid.</a> Soviet Physics Doklady. 6, 773-775 (1962).</li>
<li>Settnes, M., Bruus, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forces+acting+on+a+small+particle+in+an+acoustical+field+in+a+viscous+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+E%22%5BJournal%5D)">Forces acting on a small particle in an acoustical field in a viscous fluid.</a> Physical Review E. 85 (1), 016327(2012).</li>
<li>Barnkob, R., Augustsson, P., Laurell, T., Bruus, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acoustic+radiation+and+streaming-induced+microparticle+velocities+determined+by+microparticle+image+velocimetry+in+an+ultrasound+symmetry+plane%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+E%22%5BJournal%5D)">Acoustic radiation and streaming-induced microparticle velocities determined by microparticle image velocimetry in an ultrasound symmetry plane.</a> Physical Review E. 86 (5), (2012).</li>
<li>Bruus, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acoustofluidics+7+The+acoustic+radiation+force+on+small+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Acoustofluidics 7 The acoustic radiation force on small particles.</a> Lab Chip. 12 (6), 1014-1021 (2012).</li>
<li>Fong, E. J., Johnston, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acoustic+focusing+with+engineered+node+locations+for+high+performance+microfluidic+particle+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Acoustic focusing with engineered node locations for high performance microfluidic particle separation.</a> Analyst. 139 (5), 1192-1200 (2014).</li>
<li>Fong, E. J., Bora, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuously+Variable+Node+Position+in+a+High+Throughput+Acoustofluidic+Device%5BTitle%5D)+AND+%22Micro+Total+Analysis+Systems%22%5BJournal%5D)">Continuously Variable Node Position in a High Throughput Acoustofluidic Device.</a> Micro Total Analysis Systems. , 1184-1186 (2014).</li>
<li>Jung, S. Y., Notton, T., Fong, E., Shusteff, M., Weinberger, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+tuning+of+acoustofluidic+pressure+nodes+by+altering+net+sonic+velocity+enables+high-throughput+efficient+cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Spatial tuning of acoustofluidic pressure nodes by altering net sonic velocity enables high-throughput efficient cell sorting.</a> Lab on a Chip. 15 (4), 1000-1003 (2015).</li>
<li>Franssila, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+Reactive+Ion+Etching%5BTitle%5D)+AND+%22Introduction+to+Microfabrication%22%5BJournal%5D)">Deep Reactive Ion Etching.</a> Introduction to Microfabrication. , 255-270 (2010).</li>
<li>Sharma Rao, B., Hashim, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+Photomask+Design+Using+CAD+Software+for+Application+in+Lab+On+Chip+Biomedical+Nanodiagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials+Research%22%5BJournal%5D)">Microfluidic Photomask Design Using CAD Software for Application in Lab On Chip Biomedical Nanodiagnostics.</a> Advanced Materials Research. 795, 388-392 (2013).</li>
<li>Melin, J., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+Large+Scale+Integration+The+Evolution+of+Design+Rules+for+Biological+Automation%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics+and+Biomolecular+Structure%22%5BJournal%5D)">Microfluidic Large Scale Integration The Evolution of Design Rules for Biological Automation.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 36 (1), 213-231 (2007).</li>
<li>Madou, M. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMadou%2C+MJ+%22Fundamentals+of+microfabrication%3A+the+science+of+miniaturization%22">Fundamentals of microfabrication: the science of miniaturization</a>. , CRC Press. Boca Raton. (2002).</li>
<li>Krulevitch, P., Benett, W., Hamilton, J., Maghribi, M., Rose, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymer+based+packaging+platform+for+hybrid+microfluidic+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Polymer based packaging platform for hybrid microfluidic systems.</a> Biomedical Microdevices. 4 (4), 301-308 (2002).</li>
<li>Leslie, D. C., Easley, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequency+specific+flow+control+in+microfluidic+circuits+with+passive+elastomeric+features%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Physics%22%5BJournal%5D)">Frequency specific flow control in microfluidic circuits with passive elastomeric features.</a> Nature Physics. 5 (3), 231-235 (2009).</li>
<li>Oh, K. W., Lee, K., Ahn, B., Furlani, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+pressure+driven+microfluidic+networks+using+electric+circuit+analogy%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Design of pressure driven microfluidic networks using electric circuit analogy.</a> Lab on a Chip. 12 (3), 515-545 (2012).</li>
<li>Mittelbrunn, M., Gutiérrez Vázquez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unidirectional+transfer+of+microRNA+loaded+exosomes+from+T+cells+to+antigen+presenting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Unidirectional transfer of microRNA loaded exosomes from T cells to antigen presenting cells.</a> Nature Communications. 2, 282(2011).</li>
<li>Acosta, E. G., Castilla, V., Damonte, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+entry+of+dengue+virus+into+Aedes+albopictus+mosquito+cells+is+dependent+on+clathrin+mediated+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">Functional entry of dengue virus into Aedes albopictus mosquito cells is dependent on clathrin mediated endocytosis.</a> Journal of General Virology. 89 (2), 474-484 (2008).</li>
<li>Stenglein, M. D., Sanders, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+Characterization+and+In+Vitro+Culture+of+Highly+Divergent+Arenaviruses+from+Boa+Constrictors+and+Annulated+Tree+Boas+Candidate+Etiological+Agents+for+Snake+Inclusion+Body+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Identification Characterization and In Vitro Culture of Highly Divergent Arenaviruses from Boa Constrictors and Annulated Tree Boas Candidate Etiological Agents for Snake Inclusion Body Disease.</a> 3 (4), e00180 12(2012).</li>
<li>Arenaviridae Viral Hemorrhagic Fevers (VHFs). , CDC. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.cdc.gov/vhf/virus-families/arenaviridae.html">http://www.cdc.gov/vhf/virus-families/arenaviridae.html</a> (2013).</li>
<li>Packard, M., Wheeler, E., Alocilja, E., Shusteff, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+Evaluation+of+Fast+Microfluidic+Thermal+Lysis+of+Bacteria+for+Diagnostic+Sample+Preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Diagnostics%22%5BJournal%5D)">Performance Evaluation of Fast Microfluidic Thermal Lysis of Bacteria for Diagnostic Sample Preparation.</a> Diagnostics. 3 (1), 105-116 (2013).</li>
<li>Lion, N., Reymond, F., Girault, H. H., Rossier, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+the+move+to+microfluidics+for+protein+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Why the move to microfluidics for protein analysis.</a> Current Opinion in Biotechnology. 15 (1), 31-37 (2004).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół ten przedstawia integrację na poziomie systemu urządzeń mikroprzepływowych ze sprzętem w makroskali w celu zautomatyzowanego przetwarzania próbek biologicznych. Modułowość tej platformy pozwala na dostosowanie jej do dowolnego urządzenia o ciągłym przepływie, a na przykład prezentowany protokół koncentruje się na charakterystyce i optymalizacji wydajności akustycznie przepływowego urządzenia do separacji cząstek. Podkreślono trzy główne zalety tego protokołu: (i) modułowość i interfejs chip-to-world, (ii) solidną charakterystykę wydajności urządzenia oraz (iii) zautomatyzowane przetwarzanie precyzyjnie odmierzonych objętości próbek w celu separacji cząstek.
i. Modułowość i interfejs chip-to-world
Jak pokazano na rysunku 2, chip mikroprzepływowy jest zamontowany na niestandardowej płytce stykowej, aby łatwo dopasować się do stolika mikroskopowego w celu bezpośredniej obserwacji. Płytka stykowa zawiera gwintowane otwory #6-40 UNF na siatce o rastrze 5 mm, umożliwiające zabezpieczenie chipa i wykonanie płynnych połączeń. Połączenia płynów to rurki PEEK z obrobionymi maszynowo końcami, które uszczelniają się przed wiórem płynnym za pomocą gumowej uszczelki uszczelniającej powierzchnię czołową i kołnierza ze stali nierdzewnej. Ten schemat interfejsu umożliwia łatwą wymianę chipów i szybkie przeprojektowanie urządzeń, wymagając niewielu lub żadnych zmian w innych komponentach systemu, pod warunkiem, że ślady chipa są zgodne z formatem siatki. Na przykład użyliśmy tej platformy z chipami mikroprzepływowymi do elektroforezy o ciągłym przepływie, termicznej lizy komórek29 , szybkiego mieszania odczynników do syntezy chemicznej oraz wychwytywania i badania pojedynczych komórek.
ii. Solidna charakterystyka działania urządzenia
Aby zoptymalizować wydajność każdego urządzenia do separacji mikroprzepływowej, należy najpierw dokładnie scharakteryzować jego działanie. Opisany tutaj system wspiera rozwój szybkich i zautomatyzowanych protokołów w tym celu. W przypadku konkretnego przykładu akustycznych urządzeń do ustawiania ostrości, jakość ogniskowania, częstotliwość robocza i położenie skupionych cząstek w kanale mikroprzepływowym muszą być mierzone dla każdego urządzenia z osobna. Pomiary te wymagają przeszukania szeregu częstotliwości napędów piezoceramicznych, napięć i natężeń przepływu, aby zidentyfikować optymalne kombinacje parametrów dla wysokiej jakości separacji. Prezentowany protokół automatycznie zmienia te regulowane parametry i rejestruje odpowiednie dane, tj. fluorescencyjne obrazy cząstek przepływających w kanale, które są przetwarzane w celu wygenerowania wymaganych pomiarów jakości, częstotliwości i położenia ogniskowania cząstek (rysunek 3).
Pełna charakterystyka działania urządzenia akustycznego wymaga powtórzenia kroków 4.4 i 4.5 w zależności od potrzeb w różnych warunkach eksperymentalnych. Na przykład bezwzględna pozycja ostrości chipa jest ustalana poprzez uruchomienie skanowania częstotliwości przy stosunkowo niskich natężeniach przepływu i wysokich napięciach, aby zapewnić pełną migrację do lokalizacji węzła. Dodatkowo, takie skany częstotliwości mogą ocenić jakość montażu urządzenia (gdy są uruchamiane z kulkami polistyrenowymi o znanej wielkości) lub określić, jak nieznany wcześniej typ cząstek będzie zachowywał się w systemie (po scharakteryzowaniu chipa za pomocą kulek). Chip o dobrym transferze energii z kanału piezoceramicznego do mikroprzepływowego spowoduje ścisłe ogniskowanie przy wysokich natężeniach przepływu (>1 ml/min) i niskich napięciach (12–15 Vpp), podczas gdy te o słabym transferze energii nie będą skupiać się nawet przy niskich natężeniach przepływu (<100 μl/min) i wysokich napięciach (>20 Vpp). Odkryliśmy, że bliski kontakt między chipem mikroprzepływowym a piezoceramiką ma kluczowe znaczenie dla efektywnego transferu energii do płynu. Dalsze badania nad optymalną metodą łączenia chipa mikroprzepływowego i piezoceramiki umożliwią niezawodną produkcję urządzeń o wysokiej wydajności.
Wreszcie, pełny obraz działania urządzenia akustycznoforetycznego można uzyskać, łącząc pomiary częstotliwości oparte na obrazie z kroku 4 (i rysunku 3) ze zliczeniami cząstek zebranymi z SPO i LPO w funkcjach odpowiednich parametrów roboczych, z eksperymentów separacji przeprowadzonych na mikrosferach, jak opisano w kroku 5. Jak pokazano na rysunku 6, taka seria zautomatyzowanych eksperymentów może szybko scharakteryzować wydajność i możliwość dostrajania pojedynczego urządzenia, informując użytkownika o optymalnej przestrzeni parametrów do obsługi urządzenia do separacji cząstek.
iii. Zautomatyzowane przetwarzanie małych próbek w celu separacji cząstek
Aby zapewnić udane i dokładne przetwarzanie próbek opartych na chipach mikroprzepływowych, kluczowe znaczenie ma niezawodne i precyzyjne odmierzanie, ładowanie, dostarczanie i zbieranie objętości płynu podczas ich przepływu. Ta precyzja jest szczególnie ważna, gdy objętość próbki jest mała (~0,1–1 ml), co jest powszechne w warunkach klinicznych lub laboratoryjnych. 30 Precyzyjna obsługa próbki jest wyzwaniem w tradycyjnych eksperymentach mikroprzepływowych, które polegają na ręcznym pobieraniu próbki do strzykawki i infuzji do urządzenia bez informacji zwrotnej o tym, kiedy próbka została oddzielona i kiedy należy ją pobrać. Prezentowany protokół wykorzystuje zautomatyzowane ładowanie i dozowanie cewek próbek w połączeniu z informacją zwrotną w czasie rzeczywistym z czujników przepływu, aby umożliwić powtarzalne oddzielanie małych objętości próbek.
Rysunek 5 przedstawia profile przepływu zmierzone w SPO i LPO z typowego eksperymentu separacji. Po pierwsze, ładowany jest bufor wiodący o pojemności co najmniej 35 μl, aby zapewnić stabilny przepływ, zanim próbka dotrze do chipa akustycznego. Objętości próbek mniejsze niż 100 μl nie są zalecane dla tej konfiguracji systemu, ponieważ rozcieńczenie próbki spowodowane buforem prowadzącym staje się nadmierne. Korek z powietrzem jest używany na początku wtrysku przed buforem prowadzącym w celu oddzielenia korka próbki od płynu, który następuje po nim, zapobiegając mieszaniu i rozcieńczaniu próbki i służąc jako wskaźnik dla czujników przepływu. Po początkowym stanie przejściowym, gdy płyn zaczyna przepływać przez układ, ostre sygnały skokowe w obu wylotach wskazują na przejście pierwszego pęcherzyka powietrza. Po tych stanach nieustalonych następuje długi okres stabilnego przepływu, gdy próbka przepływa przez system, następnie kolejny skok, gdy przechodzi drugi pęcherzyk powietrza, a na końcu ostateczny spadek natężenia przepływu do zera po zatrzymaniu pompy strzykawkowej.
Przejście korków powietrznych przez czujniki przepływu jest wykorzystywane jako punkty wyzwalania do przełączania zaworów w celu rozpoczęcia i zatrzymania pobierania próbki, minimalizując w ten sposób utratę próbki i rozcieńczenie przez objętości płynu niebędące próbką. Dozowanie objętości przetwarzanej próbki w pętli zamkniętej eliminuje konieczność ponownego programowania tych wartości przed rozpoczęciem eksperymentu za każdym razem, gdy próbka wejściowa jest zmieniana. Cecha ta jest szczególnie istotna, gdy objętość próbki jest ograniczona, na przykład w przypadku wielu próbek klinicznych. Monitorowanie przepływu w czasie rzeczywistym pomaga również w rozwiązywaniu problemów; słaby przebieg (np. zatkanie tworzące się w jednym z wylotów) jest natychmiast widoczne na podstawie wynikowych profili przepływu, jak na rysunku 5b.
Aby zademonstrować elastyczność i skuteczność separacji akustofluidycznej przy użyciu zaprezentowanej architektury systemu, oczyszczone zapasy wirusów DENV i GGV zostały wzbogacone do zapasów komórkowych i oddzielone przez przetwarzanie przez chip mikroprzepływowy. Rycina 7a pokazuje, że komórki Raji były dobrze oddzielone od wirusów, ponieważ okazało się, że 97% komórek Raji opuszczających chip znajduje się w LPO, pozostawiając w ten sposób wysoce wzbogaconą próbkę DENV w SPO. Dla porównania, wydajność separacji DENV była niższa, przy czym 70% DENV wychodziło z chipa znajdującego się w SPO. Można to przypisać lekkiemu mieszaniu konwekcyjnemu indukowanemu przez zwoje kanału separacji, ale bardziej prawdopodobne jest, że niektóre cząstki DENV migrują wraz z komórkami Raji do LPO. Komórki migrujące poprzecznie przez strumienie ciągną ze sobą trochę płynu, nawet przy niskiej liczbie Reynoldsa. Dzięki temu mechanizmowi, a także niespecyficznej adsorpcji powierzchniowej, cząsteczki wirusa przenoszą się do LPO. Niemniej jednak wysoce wzbogacona próbka DENV w SPO jest znaczącą korzyścią, na przykład gdy sekwencjonowanie de novo jest stosowane do wykrywania i identyfikacji wirusów.
Rysunek 7b pokazuje, że w jednym z eksperymentów tylko około 70% komórek Boa opuszczających chip zostało znalezionych w LPO, w porównaniu z prawie 100% skutecznością separacji w przypadku komórek Raji. Różnica w wydajności separacji między tymi dwoma typami komórek może wynikać z mniejszego średniego rozmiaru lub mniejszej gęstości komórek Boa w porównaniu z komórkami Raji, co skutkuje mniejszymi siłami akustycznymi. Aby potwierdzić lub obalić te przypuszczenia, należy dokładnie zmierzyć wielkość, gęstość i morfologię komórek Boa w zawiesinie (które normalnie rosną przylegają) komórek Boa, co stanowi próbę dalszych badań. W tych samych eksperymentach, podobnie jak w eksperymentach z DENV, większość odzyskanego GGV opuściła SPO, co wskazuje na wzbogacenie frakcji wirusowej.
Przedstawione dane podkreślają nieodłączne wyzwania związane z inżynierią platform o szerokim zastosowaniu do przetwarzania różnorodnych próbek biologicznych. Co ważne, interakcje biologiczne mogą zacząć odgrywać równie dużą rolę, jak efekty fizyczne i mechaniczne. Jednak te wstępne eksperymenty pokazują również moc i obietnicę wykorzystania tej architektury systemu do przetwarzania próbek w zastosowaniach klinicznych i badawczych. Jako solidny, dobrze scharakteryzowany system inżynieryjny, platforma ta zapewnia możliwość poszukiwania odpowiedzi na nowe pytania naukowe.

Separacja i frakcjonowanie próbek to jeden z najbardziej obiecujących obszarów zastosowań technologii mikroprzepływowych. Takie etapy postępowania z próbkami są integralną częścią skutecznej diagnostyki klinicznej, opracowywania środków terapeutycznych, wysiłków w zakresie nadzoru biologicznego oraz postępu w badaniach i technologii w dziedzinie nauk przyrodniczych. Zademonstrowano niezliczone strategie separacji mikroprzepływowej dla cząstek zawieszonych w płynach i koloidów, a także dla związków chemicznych i biologicznych; Kilka przeglądów zawiera przegląd ostatnich postępów i osiągnięć w tych dziedzinach1–9. Chociaż wiele z tych technologii separacji mikroprzepływowej (zwanych dalej "urządzeniami podstawowymi") zostało szczegółowo scharakteryzowanych, niewiele raportów uwzględniało problem separacji próbek na poziomie systemu. Podstawowe urządzenia to zazwyczaj pojedyncze chipy w skali centymetrowej, połączone z rurkami fluoropolimerowymi, z płynem dostarczanym przez pompę wyporową lub ciśnieniową. Jeśli jednak obietnica mikrofluidyki – w tym zwiększona automatyzacja, niezawodność i zmniejszenie objętości próbek – ma stać się rzeczywistością, należy włożyć co najmniej równy wysiłek w zaprojektowanie kompletnego systemu separacji, z którym zintegrowane jest urządzenie podstawowe.
Ponadto, głównym wyzwaniem dla mikroprzepływowych podejść do biodetekcji jest interfejs makro do mikro. Odnosi się to nie tylko do fizycznych połączeń "świat do chipa" urządzenia mikroprzepływowego z komponentami w makroskali oraz do niedopasowania między typowymi objętościami próbek klinicznych lub analitycznych (~0,1–10 ml) a wewnętrzną objętością chipów mikroprzepływowych (~0,01–10 μl), ale także do ograniczeń statystycznych wynikających z mostkowania tych skal wielkości. Kwestie te przyczyniają się do postrzegania, że wstępne przetwarzanie i przygotowanie próbek jest "słabym ogniwem" biodetekcji. 10 Platforma opisana w niniejszej pracy stanowi ważny krok w kierunku sprostania tym wyzwaniom.
Biorąc pod uwagę widok na poziomie systemu, ten protokół szczegółowo opisuje niezawodne przetwarzanie precyzyjnie mierzonych objętości w skali analitycznej (od 0,15 do 1,5 ml) w ~10-minutowych skalach czasowych. Jest to operacja "jednym przyciskiem": po umieszczeniu w systemie fiolki źródłowej zawierającej fiolkę z próbką i fiolki docelowe do pobierania frakcji, polecenie "uruchom" inicjuje procedurę, a wszystkie kroki są kontrolowane przez komputer. Pod koniec serii fiolki do pobierania mogą zostać wyjęte z systemu w celu dalszej analizy oddzielonych frakcji.
Podstawowym urządzeniem w tym systemie jest chip do akustoforezy, który ekstrahuje z próbki cząstki wielkości komórki ssaków (5-20 μm). Separacja akustoforetyczna jest tutaj wybierana przede wszystkim ze względu na wysoką przepustowość (do 100 μl/min), bezznacznikową i bezkontaktową, co daje korzyści w oddzielaniu żywych wirusów od komórek, z którymi może się równać niewiele innych technik mikroprzepływowych. Fizyka akustycznego ogniskowania cząstek została obszernie opisana11-13 i nie jest przedmiotem niniejszego protokołu, ale poniżej znajduje się krótkie podsumowanie podstawowych koncepcji, które pomogą w zrozumieniu zastosowania separacji mikroprzepływowej.
Ultradźwiękowe fale stojące rezonujące w wypełnionych płynem mikrokanałach wytwarzają pola ciśnienia, które powodują powstawanie sił kierujących cząstki w kierunku węzłów niskiego ciśnienia. Wielkość siły zależy od objętości cząstki oraz od współczynnika kontrastu akustycznego wyprowadzonego ze względnych gęstości i ściśliwości cząstki i zawieszonego płynu. 14 W związku z tym ogniskowanie akustyczne idealnie nadaje się do oddzielania cząsteczek wielkości komórki (~7–15 μm) od cząstek o rozmiarach wirusa (~50–200 nm). Większe cząstki migrują w kierunku węzła ciśnienia; Ponieważ jednak wielkość siły jest bardzo mała dla cząstek mniejszych niż 2–3 μm, te małe cząstki lub rozpuszczone cząstki prawie w ogóle się nie poruszają. Nasza specyficzna implementacja separacji akustycznej, jak opisano wcześniej,15 zawiera cienką ściankę do podziału kanału płynu i umożliwia dostrojenie, asymetryczne rozmieszczenie pozycji ostrości. Zwiększa to elastyczność w projektowaniu urządzeń, a korzyści w zakresie wydajności — w tym zwiększona jakość i szybkość separacji — są w pełni opisane w innym miejscu. Pytania z dnia 16,17 na dzień
Jednak główną zaletą opisanego w tej pracy podejścia do projektowania na poziomie systemu jest to, że można je dostosować do wielu różnych mikroprzepływowych urządzeń rdzeniowych. Na przykład większość innych trybów separacji o ciągłym przepływie, w tym inercyjny, frakcjonowanie w polu przepływu, deterministyczne przemieszczenie boczne (DLD) i różne typy urządzeń elektrokinetycznych, można łatwo włączyć, dokonując odpowiednich korekt w celu uwzględnienia zmian w konfiguracji wlotu/wylotu, natężeniu przepływu i objętości próbki. Urządzenia z różnymi rodzajami pól na chipie (elektryczne, magnetyczne) lub gradientami (termiczne, chemiczne) mogą wymagać dodatkowych połączeń z chipem lub integracji dodatkowego sprzętu, który ta platforma obsługuje.
Ten protokół zapewnia kroki wymagane do zaprojektowania urządzenia do separacji mikroprzepływowej oraz do wytwarzania chipów krzemowo-szklanych metodą głębokiego reaktywnego trawienia jonowego (DRIE, proces plazmowo-trawiony dostępny w wielu zakładach mikrofabrykacji, który wykorzystuje naprzemienne cykle trawienia i pasywacji w celu uzyskania głębokich cech z pionowymi ścianami bocznymi18). Następnie opisujemy charakterystykę urządzenia akustofluidycznego w celu określenia optymalnych parametrów pracy separacji, a na koniec szczegółowo opisujemy w pełni zintegrowany system separacji i procedurę przetwarzania próbek biologicznych. Następnie prezentowane i omawiane są typowe wyniki charakterystyki urządzeń i dane przetwarzania próbek, a także podkreślane są kluczowe zalety tego podejścia, w tym modułowość, solidność, precyzja i automatyzacja.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Materiały wymagane do Kroków 1-3: Projektowanie, Produkcja i Montaż</td></tr><tr><td>Urządzenia Dwustronnie polerowany wafel krzemowy</td><td>Silicon Quest International, Inc. San Jose, CA, USA</td><td>100 mm < 100>&nbsp; Płytka podstawowa</td><td>1-20 Ohm-cm, 495 &#177; 25&#160; &mikro; m Dwustronnie polerowany</td></tr><tr><td>szklany wafel</td><td>Bullen Ultrasonics, Eaton, OH, USA</td><td>100 mmx0,5 mm Boro</td><td></td></tr><tr><td>Photoresist, AZ 1518</td><td>MicroChemicals GmbH, Ulm, Niemcy</td><td>AZ 1518</td><td>Photoresist służy do przyklejania wafla do pustej płytki do wytrawiania DRIE</td></tr><tr><td>Photoresist, AZ 4620</td><td>MicroChemicals GmbH, Ulm, Niemcy</td><td>AZ 4620</td><td>Photoresist do definiowania wzorów płynnych i za pomocą masek</td></tr><tr><td>Wytrawiacz plazmowy DRIE</td><td>STPS, Newport, NP, Wielka Brytania</td><td>Multiplex Advance Oxide Etch (AOE) System</td><td></td>ICP</tr><tr><td>Wafer Bonder</td><td>Electronic Visions Group,&nbsp; St.Florian am Inn, Austria</td><td>EVG 501</td><td></td></tr><tr><td>Piła do krojenia w kostkę</td><td>Kulicke & Soffa Industries, Singapur</td><td>K& S 982</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw epoksydowy</td><td>Technologia epoksydowa, Billerica, MA, USA</td><td>EPO-TEK 301</td><td>Żywica epoksydowa służąca do łączenia chipów piezoelektrycznych i mikroprzepływowych</td></tr><tr><td>PZT piezoceramicznych&nbsp;</td><td>Piezo Systems, Woburn, MA, USA</td><td>PSI-5A4E</td><td>37,5 &razy; 10 &razy; 0,5 mm</td></tr><tr><td>28 AWG Drut lity w izolacji Kynar</td><td>Squires Electronics, Cornelius, OR, USA</td><td>UL1422</td><td></td></tr><tr><td>2-częściowa srebrna żywica epoksydowa&nbsp;</td><td>MG Chemicals, Surrey, BC, Kanada</td><td>8331</td><td>Klej przewodzący do mocowania przewodów drucianych do PZT</td></tr><tr><td>L-edit</td><td>Tanner EDA, Monrovia, CA, USA</td><td>Ledit v15.1 64-bitowe</td><td>oprogramowanie CAD do układu</td></tr><tr> maski<td colspan="4">Materiały wymagane do kroku 4: Charakterystyka ostrości akustycznej</td></tr><tr><td>Dual Pump</td><td>Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA</td><td>Phd Ultra Series, 703007</td><td></td></tr><tr><td>5&#160; ml strzykawki</td><td>Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>Adapter z gwintowanym portem Luer</td><td>IDEX, Oak Harbor, WA, USA</td><td>P-659</td><td>Łączy strzykawkę z rurką</td></tr><tr><td>Union</td><td>IDEX, Oak Harbor, WA, USA</td><td>P-623</td><td>Łączy świat z połączeniami chipowymi z rurkami fluoropolimerowymi.&nbsp; Może również korzystać z taśmy&nbsp;</td></tr><tr><td>Tuleja 1/4-28 z płaskim dnem</td><td>IDEX, Oak Harbor, WA, USA</td><td>P-200</td><td>Używana z nakrętką do wykonywania połączeń między rurką a strzykawką, czujnikami przepływu i światem do osprzętu chipowego</td></tr><tr><td>Nakrętka&nbsp; 1/4-28 płaskie dno</td><td>IDEX, Oak Harbor, WA, USA</td><td>P-202</td><td>Używany z tulejką do wykonywania połączeń między rurką a strzykawką, sessorami przepływu i światem do sprzętu do chipowania</td></tr><tr><td>1/16" OD Rurki fluoropolimerowe</td><td>IDEX, Oak Harbor, WA, USA</td><td>1912L</td><td>Rurka do łączenia pomp strzykawkowych ze światem do połączeń chipowych.&nbsp; Rozmiar rurki nie ma znaczenia podczas etapów klamracji (zwykle używane ID .01-.03", inne odpowiednie numery części: 1907L, 1902L).</td></tr><tr><td>Rurka fluoropolimerowa o małej średnicy wewnętrznej</td><td>IDEX, Oak Harbor, WA, USA</td><td>1476-20</td><td>Używana do ograniczników przepływu: 0,006" ID, 1/16" OD FEP&nbsp;</td></tr><tr><td>Rurka</td><td></td><td></td> PEEK <td>Łączy rurkę z chipa z rurką fluoropolimerową.</td></tr><tr><td>Wentylator chłodzący</td><td>Multicomp, Leeds, Anglia</td><td>MC19663</td><td></td></tr><tr><td>Generator funkcyjny</td><td>Agilent, Santa Clara, CA, USA</td><td>33220A</td><td></td></tr><tr><td>Wzmacniacz RF</td><td>ENI, Rochester, NY</td><td>325 LA</td><td>Musi być w stanie wzmocnić sygnały z < 1&#160; V w zakresie 1-2&#160; MHz do 25&#160; Vpp do piezo.</td></tr><tr><td>Kamera CCD</td><td>Fotometria, Tucscon, AZ, USA</td><td>CoolSnap HQ</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony</td><td>Zeiss, Oberkochen, Niemcy</td> Zestaw filtrów <td>Axiovert S100</td><td></td></tr><tr><td>FITC</td><td>Chroma Tech, VT, USA</td><td>Obiektyw SP101</td><td></td></tr><tr><td>, 10X</td><td>Zeiss, Oberkochen, Niemcy</td><td>Oscyloskop ACHROPLAN</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Tektronix, Beaverton, OR, Stany Zjednoczone</td><td>TDS3014B</td><td>Do monitorowania napięcia wyjściowego przez wzmacniacz RF</td></tr><tr><td>MatLab</td><td>Mathworks, Natick, MA, USA</td><td>R2014a Oprogramowanie interfejsu sterownika</td><td></td></tr><tr><td>do integracji kamery fotometrycznej z oprogramowaniem LabVIEW</td><td>R Cubed Software, Lawrenceville, NJ, USA</td><td>SITK</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich, St. Lousi, MO, USA</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>Dragon Green Fluorescent 5.76 lub 7.32&#160; &mikro; m Beads</td><td>Bangs Laboratory, IN, USA</td><td>FS06F</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Dodatkowe materiały wymagane do kroku 5: Automatyczne</td></tr><tr><td>rozdzielanie zaworów wieloportowych</td><td>VICI, Houston, TX, USA</td><td>C25Z-3180EUHA</td><td>W obecnej konfiguracji potrzebne są 4 zawory</td></tr><tr><td>Czujniki przepływu</td><td>Sensirion, Westlake Village, CA, USA</td><td>SLI-1000</td><td></td></tr><tr><td>Rurki fluoropolimerowe, .01 i .03" ID</td><td>IDEX, Dąb Harbor, WA, USA</td><td>1902L i 1912L</td><td>Preferowana nakrętka PFA o wysokiej czystości</td></tr><tr><td></td><td>VICI, Houston, TX, USA</td><td>ZN1PK-10</td><td>Używana z tulejką do wykonywania połączeń między rurkami a zaworami. Alternatywne numery części: MZN1PK-10, LZN1PK-10</td></tr><tr><td>Tuleja</td><td>VICI, Houston, TX, USA</td><td>ZGF1PK-10</td><td>Używana z nakrętką do wykonywania połączeń między rurkami a zaworami. &nbsp;</td></tr><tr><td>LabVIEW</td><td>National Instruments, Austin, Teksas, Stany Zjednoczone</td><td>System rozwoju zawodowego LabVIEW</td><td>Oprogramowanie do automatyzacji laboratoriów</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Teknova, Hollister, CA, USA</td><td>P0200</td><td></td></tr><tr><td>Raji Cells</td><td>ATTC, Manassas, VA, USA</td> Komórki <td></td> Boa CCL86 <td></td></tr><tr><td></td><td>Uprzejmie dostarczone przez Laboratorium DeRisi w UCSF</td>GGV <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Uprzejmie dostarczone przez Laboratorium DeRisi na UCSF</td></tr><tr><td>DENV</td><td></td><td></td><td>Uprzejmie dostarczone przez Jose Pena w LLNL</td></tr><tr><td>Coulter Counter Z2</td><td>Beckman Coulter, Brea, CA, USA</td><td>Hemacytometr Z2</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific, Waltman, MA, USA</td><td>0267151B</td><td></td></tr></tbody></table>

platforma mikroprzepływowa do precyzyjnego przetwarzania próbek o małej objętości i jej wykorzystanie do wymiarowania oddzielnych cząstek biologicznych za pomocą mikrourządzenia akustycznego

A Microfluidic Platform for Precision Small-volume Sample Processing and Its Use to Size Separate Biological Particles with an Acoustic Microdevice

Główną zaletą urządzeń mikroprzepływowych jest możliwość manipulowania małymi objętościami próbek, co zmniejsza ilość odpadów odczynników i pozwala zachować cenną próbkę. Jednak, aby uzyskać solidną manipulację próbką, konieczne jest zajęcie się integracją urządzenia ze środowiskiem makroskalowym. Aby zapewnić powtarzalną, czułą separację cząstek za pomocą urządzeń mikroprzepływowych, protokół ten przedstawia kompletną, zautomatyzowaną i zintegrowaną platformę mikroprzepływową, która umożliwia precyzyjne przetwarzanie próbek o wielkości 0,15–1,5 ml za pomocą urządzeń mikroprzepływowych. Ważnymi aspektami tego systemu są modułowy układ urządzeń i solidny osprzęt, co skutkuje niezawodnymi i elastycznymi połączeniami między światem a chipami, a także w pełni zautomatyzowana obsługa płynów, która umożliwia pobieranie próbek w pętli zamkniętej, czyszczenie systemu i etapy zalewania w celu zapewnienia powtarzalnej pracy. Różne urządzenia mikroprzepływowe mogą być używane zamiennie z tą architekturą. W tym miejscu włączamy urządzenie akustofluidyczne, szczegółowo opisujemy jego charakterystykę, optymalizację wydajności i demonstrujemy jego zastosowanie do separacji wielkości próbek biologicznych. Dzięki wykorzystaniu informacji zwrotnych w czasie rzeczywistym podczas eksperymentów separacji, pobieranie próbek jest zoptymalizowane w celu zachowania i zagęszczenia próbki. Chociaż wymaga to integracji wielu urządzeń, zalety tej architektury obejmują możliwość przetwarzania nieznanych próbek bez dodatkowej optymalizacji systemu, łatwość wymiany urządzeń oraz precyzyjne, niezawodne przetwarzanie próbek.

Kluczowe cechy konstrukcji urządzenia akustyczno-mikroprzepływowego zostały przedstawione na Rysunku 1 i w pełni opisane w innym opracowaniu.15 W skrócie, dwa strumienie cieczy płyną obok siebie w kanale separacyjnym, będąc oddzielonymi od równoległego kanału obejściowego cienką ścianką krzemową. Ponieważ wartość siły promieniowania pierwotnego jest proporcjonalna do objętości cząstek, duże cząstki migrują ze strumienia wejściowego zmieszanej próbki w stronę węzła ciśnienia akustycznego znajdującego się w sąsiednim strumieniu cieczy odzyskowej, podczas gdy małe cząstki pozostają w pierwotnym strumieniu (Rysunek 1B, C). Podzielona architektura dwukanałowa poprawia separację cząstek17 i pozwala na regulację pozycji węzła poprzez zastosowanie różnych cieczy w kanale obejściowym.16 Płytka prototypowa układu płynowego oraz uchwyty stanowią stabilną platformę dla połączeń zewnętrznych z układem, a modułowa konstrukcja umożliwia szybką wymianę chipów mikroprzepływowych (Rysunek 2). Taka konfiguracja pozwala również na szybkie i niezawodne tworzenie odwracalnych połączeń płynowych, wytrzymujących ciśnienie do 1 000 psi (Rysunek 2B, E).
Częstotliwość rezonansową fres chipa można oszacować za pomocą prostych analitycznych obliczeń 1D (patrz Krok 1.1.1). Z pełniejszego modelu 2D metodą elementów skończonych przekroju naszego urządzenia,16 wynika, że oczekiwana pozycja ogniskowania dla rezonansu 2-węzłowego znajduje się w odległości 225 µm od ścianki, a oczekiwana częstotliwość wynosi 1,68 MHz. Jednakże fres w rzeczywistych urządzeniach może różnić się o ±100 kHz, w zależności od temperatury pracy oraz sprzężenia rezonansów podłużnych i poprzecznych. Dlatego po montażu urządzenia fres musi zostać zweryfikowana empirycznie przy odpowiednich natężeniach przepływu i napięciach sterujących piezoelektryka, zgodnie z opisem w Kroku 4 protokołu. Rysunek 3 przedstawia reprezentatywne skany częstotliwości wykonane przy 200 µl/min, z wodą w kanałach głównym i boczniczym oraz przy napięciu 20 Vpp podanym na piezoelektryk. Gdy sprzężenie między piezoelektrykiem a urządzeniem mikrofluidycznym jest dobre, cząstki będą silnie ogniskować się przy częstotliwości rezonansowej, co spowoduje wyraźny pik intensywności fluorescencji i migrację do oczekiwanej pozycji ogniskowania (Rysunek 3A). W przeciwieństwie do tego, przy słabym sprzężeniu cząstki nie będą się dobrze ogniskować, a wyniki skanu częstotliwości będą podobne do tych na Rysunku 3B. W takich urządzeniach może być konieczny ponowny montaż przetwornika piezoelektrycznego, jeśli zastosowano klej odwracalny; w przeciwnym razie urządzenie to jest nieodpowiednie, gdy wysokiej jakości ogniskowanie lub szybki przepływ są krytyczne dla wymaganej aplikacji. Dane na Rysunku 3 stanowią podstawę do wyboru częstotliwości roboczej dla kolejnych eksperymentów oraz zakresu napięcia i natężenia przepływu dostępnego dla wydajnej separacji cząstek.
<img alt="Rysunek 5" src="/files/ftp_upload/53051/53051fig5.jpg" /> 
Rysunek 5. Zautomatyzowane przetwarzanie próbek. (A) Schemat próbki załadowanej do cewki próbkowania. (B) Reprezentatywny profil przepływu z udanego eksperymentu rozdzielczego. (C) Profil przepływu z przebiegu rozdzielania, podczas którego wylot SPO został zapchany w około 220 sec. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53051/53051fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Po zidentyfikowaniu płytek, które skutecznie oddzielają składniki, zostają one włączone do systemu przedstawionego na Rysunku 4. Całkowita objętość robocza systemu została zminimalizowana poprzez zastosowanie rurek o średnicy wewnętrznej 0,01” wzdłuż głównej ścieżki przepływu (linie niebieskie). Rysunek 5A ilustruje skład typowej próbki wstrzykiwanej do systemu. Niewielka ilość „buforu prowadzącego” (~35 µl) jest wymagana przed próbką w strumieniu, aby wyeliminować fluktuacje przepływu podczas przemieszczania się próbki przez płytkę separacyjną. Rysunek 5B przedstawia dane przepływu uzyskane podczas udanego zautomatyzowanego eksperymentu separacji akustycznej. Kluczowe cechy udanego przebiegu obejmują: (1) przejściowy wzrost szybkości przepływu zarówno w LPO, jak i SPO w miarę wzrostu ciśnienia i rozpoczęcia przepływu cieczy przez system, (2) gwałtowny skok wskazujący na przejście pęcherzyka powietrza (wstawka pokazuje powiększony profil pojedynczego pęcherzyka), który powinien dotrzeć do SPO przed LPO ze względu na nierównomierny przepływ z dwóch wylotów, (3) stabilny przepływ przez oba wyloty pomiędzy dwoma pęcherzykami powietrza podczas przemieszczania się próbki przez system oraz (4) stopniowy spadek szybkości przepływu w obu wylotach po dostarczeniu pełnej objętości próbki do systemu. Nieprawidłowe przebiegi są natychmiast widoczne na profilach przepływu podobnych do Rysunku 5C, gdzie wydaje się, że SPO uległo zatkaniu po około 220 sekundach. W takim przypadku należy przeprowadzić procedurę czyszczenia podobną do opisanej w kroku 5.3, aby udrożnić kanał.
<img alt="Rysunek 6" src="/files/ftp_upload/53051/53051fig6.jpg" /> 
Rysunek 6. Możliwość regulacji urządzenia: wpływ wielkości cząsteczek i napięcia. Procent polistyrenowych mikrosfer wyizolowanych w LPO zależy od wielkości cząsteczek oraz napięcia przyłożonego do ceramiki piezoelektrycznej. Każda linia odpowiada innemu napięciu roboczemu przy częstotliwości rezonansowej, wyznaczonym zgodnie z opisem w kroku 4. Całkowity przepływ przez urządzenie wynosi 200 µl/min, przy zastosowanych częstotliwościach sterujących między 1,62 a 1,64 MHz. Słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe z co najmniej trzech oddzielnych eksperymentów. Powielone i zmodyfikowane za zgodą The Royal Society of Chemistry z adresu http://pubs.rsc.org /en/Content/ArticleLanding/ 2014/AN/c4an00034j. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53051/53051fig6large.jpg" target="_blank">Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.</a>
Rysunek 6 przedstawia zestawione wyniki separacji z wykorzystaniem różnych rozmiarów cząsteczek polistyrenu i napięć sterujących piezoelektrykiem, co obrazuje parametry operacyjne niezbędne do wydajnej separacji. Zgodnie z oczekiwaniami, do wydzielenia mniejszych cząsteczek wymagane są zazwyczaj wyższe napięcia (t.j. większe siły akustyczne). Napięcia sterujące nie mogą być jednak zwiększane w nieskończoność ze względu na większe wydzielanie ciepła i narastające efekty strumieniowania akustycznego.13 Wykres służy jako ogólna wskazówka do separacji cząsteczek — cząsteczki o rozmiarach wykazujących znacząco różną odzyskowalność przy konkretnym napięciu sterującym (np. cząsteczki 10 i 2 µm przy 8,8 Vpp) będą się dobrze separować. Zazwyczaj populacje cząsteczek o dużej różnicy w rozmiarze, takie jak wirusy (~100 nm) i komórki (~10 µm), mogą być oddzielane szybko i wydajnie, podobnie jak komórki o różnych rozmiarach (np. dyskowate erytrocyty 6–8 µm i leukocyty 8–15 µm). Specyficzne warunki wymagane do pracy z innymi typami komórek muszą zostać określone empirycznie, ponieważ oprócz rozmiaru komórki na jej kontrast akustyczny wpływają kształt, gęstość i ściśliwość. W tym celu procedury opisane w Kroku 4 są przydatne do wyznaczania możliwych do zastosowania warunków separacji dla każdego nowego typu komórek lub cząsteczek, a nie tylko do oceny jakości konkretnego urządzenia do akustoforezy.
<img alt="Rycina 7" src="/files/ftp_upload/53051/53051fig7.jpg" /> 
Rycina 7. Efektywność separacji próbek z dodatkiem wirusów i komórek.Wyniki separacji dla (A) komórek Raji z dodatkiem wirusa Dengue (DENV) oraz (B) komórek Raji i komórek nerki Boa z dodatkiem wirusa Golden Gate (GGV). Zebrane wartości procentowe definiuje się jako frakcję wirusów lub komórek opuszczających konkretny wylot w stosunku do całkowitej ilości materiału opuszczającego chip. Słupki błędów dla (A) przedstawiają odchylenie standardowe z 3 prób, natomiast próbki w (B) zostały przetworzone tylko raz ze względu na niską dostępną ilość materiału. Jako bufor do próbek i płyn do odzyskiwania zastosowano 1x PBS, a w kanale obejściowym we wszystkich eksperymentach użyto wody. Częstotliwości pracy chipa mieściły się w zakresie od 1,60 do 1,64 MHz, a napięcia sterujące od 16 do 20 Vpp. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53051/53051fig7large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
Aby zademonstrować użyteczność tej platformy w separacji cząsteczek biologicznych, wykorzystano ją w pierwszej kolejności do analizy dobrze opisanych próbek biologicznych: ludzkich komórek Raji (105 komórek/ml, średnica średnia 8–10 µm25) z dodatkiem wirusa dengue (DENV, 105 pfu/ml, przybliżona średnica 50 nm26). Rycina 7A przedstawia procent komórek Raji oraz DENV zebranych w obu wylotach SPO i LPO (zdefiniowany jako frakcja każdego typu cząsteczek zebrana z każdego wylotu w stosunku do całkowitej ilości każdej cząsteczki zebranej z chipa). Eksperyment powtórzono trzykrotnie; liczbę komórek Raji określono za pomocą licznika Coultera, natomiast ilość DENV wyznaczono za pomocą ilościowej reakcji polimerazy łańcuchowej z odwrotną transkrypcją (RT-qPCR).
Następnie przetestowano wydajność systemu w scenariuszu bardziej realistycznym dla przetwarzania próbek klinicznych, w którym dokładne właściwości fizyczne cząsteczek mogą być nieznane, a dostępne ilości próbek są mniejsze. W tym przypadku oceniono separację niedawno zidentyfikowanego wirusa golden gate (GGV), patogenu węży infekującego komórki nerek boa constrictor.27 Rozmiar cząsteczki wirusa GGV nie został jeszcze zmierzony, ale ponieważ GGV należy do rodziny Arenaviridae, prawdopodobnie ma podobną wielkość, od 100 do 150 nm.28 Przetworzono próbki z GGV dodanym (104 pfu/ml) do ludzkich komórek Raji (niebędących celem infekcji dla wirusa) oraz komórek nerek boa (cel infekcji GGV, przybliżony rozmiar 10 µm27), przy stężeniu obu typów komórek wynoszącym 104 komórek/ml. Ze względu na to, że próbki te były dostępne w niewielkich ilościach, w niniejszej pracy przedstawiono wyniki separacji z tylko jednego przebiegu eksperymentalnego. Rysunek 7B przedstawia procent komórek Raji, komórek boa oraz GGV zebranych z SPO i LPO. Komórki w tych eksperymentach ilościowano poprzez zliczanie na hemacytometrze, a wirusy ilościowano za pomocą RT-qPCR.

Ten protokół opisuje architekturę systemu do wykonywania automatycznych separacji cząstek o małej objętości (0,15–1,5 ml) za pomocą urządzenia mikroprzepływowego i omawia metody optymalizacji wydajności i działania urządzenia akustycznego.

Platforma mikroprzepływowa do precyzyjnego przetwarzania próbek o małej objętości i jej wykorzystanie do wymiarowania oddzielnych cząstek biologicznych za pomocą mikrourządzenia akustycznego

A major advantage of microfluidic devices is the ability to manipulate small sample volumes, thus reducing reagent waste and preserving precious sample. ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przeprowadzenie zautomatyzowanej separacji cząstek o małej objętości przy użyciu mikrofluidycznego urządzenia fotycznego. Metoda ta może usprawnić kluczowe procedury w dziedzinie inżynierii biomedycznej, w tym stabilne przetwarzanie i separację próbek do zastosowań w detekcji biologicznej oraz badaniach klinicznych. Głównymi zaletami tej techniki są modułowość, precyzja, odporność i automatyzacja, co czyni ją adaptowalną i elastyczną nie tylko w przypadku separacji retikularnej, ale i w szerokim spektrum przepływowych mikrofluidycznych urządzeń separacyjnych.W pierwszej kolejności zidentyfikowaliśmy potrzebę wprowadzenia możliwości rutynowego i niezawodnego przeprowadzania rozdziałów dla submilimetrowych objętości próbek biologicznych, bez znaczącego rozcieńczenia lub utraty anality. Integracja dozowania próbek i zautomatyzowanego kierowania z materiału źródłowego do plików zbiorczych, wraz ze standardową pracą pompy strzykawkowej, jest kluczowa dla skutecznej pracy w tej skali. Aby rozpocząć, należy zaprojektować urządzenie do retykulacji akustycznej oraz układ dwóch masek fotograficznych, zgodnie z opisem w sekcji pierwszej dołączonego protokołu tekstowego.Następnie naniesiono wzór portów dopływowych na tylnej stronie dwustronnie polerowanego wafla krzemowego 1 0 0. Przy użyciu standardowej fotolitografii z rezystem pozytywowym wytrawiono tę geometrię metodą głębokiego trawienia jonowego (DRIE) do głębokości od 350 do 400 µm. Następnie obrócono wafel i naniesiono wzór geometrii kanału płynowego na przedniej stronie.Ponownie, stosując standardową fotolitografię z pozytywem, zamocuj wzorowany wafelek do drugiego, pustego krzemowego wafla nośnego. Używając fotorezystu, wytraw teraz odsłonięte kanały do głębokości 200 micrometers. Wykorzystując głębokie trawienie reaktywne, namocz następnie wafelek urządzenia w roztworze do usuwania rezystu, aby oddzielić go od pustego wafla krzemowego.Następnie oczyść wafelek urządzenia oraz bezstrukturalny wafelek ze szkła borokrzemianowego o grubości 0,5 mm za pomocą roztworu piranhy. Po oczyszczeniu uszczelnij kanały płynowe, łącząc jonowo wafelek szklany i krzemowy zgodnie z przedstawionymi tutaj warunkami. Na koniec wytnij poszczególne chipy za pomocą tarczy diamentowej w pile do dicingu z zestawu dwuskładnikowej żywicy epoksydowej o niskiej lepkości.Odważ zalecaną proporcję obu składników i dokładnie je wymieszaj. Następnie umieść ceramikę piezoelektryczną z tytanianu cyrkonianu ołowiu (PZT) lub PCT w odpowiednim uchwycie i za pomocą pipety równomiernie rozprowadź na niej około 10 µL mieszaniny epoksydowej, aby utworzyć cienką, jednorodną warstwę. Następnie umieść chip w uchwycie i wyrównaj stronę ceramiki piezoelektrycznej z epoksydem względem chipu mikrofluidycznego.Podczas wyrównywania może być konieczne przymocowanie chipa taśmą, aby utrzymać go w miejscu. Zaciśnij zespół w imadle, uważając, aby nie uszkodzić żadnego z komponentów, a następnie utwardź żywicę w temperaturze i przez czas zalecany przez producenta epoksydu. Po utwardzeniu żywicy użyj lutownicy z cienką końcówką, aby przylutować cienkie przewody do każdej strony ceramiki piezoelektrycznej.W razie potrzeby użyj odpowiedniego topnika do przygotowania powierzchni piezoelektrycznej. Należy zadbać o jak najkrótszy czas kontaktu z elementem piezoelektrycznym, aby uniknąć jego termicznej depolaryzacji. Przymocuj chip do płytki prototypowej do płynów za pomocą uchwytów zaciskowych.Następnie należy przymocować wentylator chłodzący do płytki stykowej, aby regulować temperaturę podczas eksperymentów akustycznych. Potem przykręć chip do złączy zewnętrznych. Zamocuj płytkę stykową na stole mikroskopu i połącz złącza zewnętrzne z chipem z dodatkowymi rurkami w otworach wlotowych i wylotowych.Używając standardowych złączy gwintowanych 1/4-28. Za pomocą rurek o średnicy 1/16 cala połącz chip mikrofluidyczny z pompą strzykawkową, sterowanymi komputerowo wieloportowymi zaworami wyboru, przepływomierzami z interfejsem PC oraz rurkami, jak pokazano tutaj i opisano na rysunku 4 w towarzyszącym protokole tekstowym. Przed rozpoczęciem rozdziału napełnij zbiorniki z odczynnikiem czyszczącym i odpowietrz odpowiadające im linie płynowe.Następnie ustaw zawory trzy i cztery przy wylotach z układu tak, aby początkowy przepływ kierował się do zbiorników z odpadami. Następnie włącz wentylator chłodzący. Podłącz przewody ceramiki piezoelektrycznej do wzmacniacza mocy i ustaw generator funkcji na częstotliwość rezonansową dla używanego układu akustycznego.Ustaw wartość napięcia w generatorze funkcji tak, aby wzmacniacz RF generował napięcie od 12 do 25 V szczyt-szczyt, w zależności od pożądanej separacji. Następnie podłącz do systemu odpowiednie fiolki do zbierania oraz fiolkę z buforem wejściowym. Użyj buforu do próbek odpowiedniego dla rozdzielanych komórek lub cząstek lub zgodnie z wymaganiami testu analitycznego, który zostanie przeprowadzony po separacji.Następnie uruchom oprogramowanie sterujące i wykorzystaj je do kontrolowania zaworów, czujników przepływu oraz pompy w celu przeprowadzenia w pełni automatycznej procedury płukania i separacji. Bezpośrednio przed rozpoczęciem procedury separacji krótko wymieszaj probówkę z próbką na wstrząsarzu (vortex), aby resuspenderć ewentualne osady. Alternatywnie, w przypadku próbek biologicznych bardziej podatnych na uszkodzenia lub tworzenie agregatów podczas wstrząsania, wymieszaj próbkę, pipetując ją w górę i w dół 10 razy.Następnie podłącz fiolkę z próbką do linii doprowadzającej i bezzwłocznie uruchom procedurę przygotowania i rozdziału. Rozpocznij od użycia oprogramowania do odpowietrzenia wlotu powietrza zaworów jeden i dwa, aby upewnić się, że w przewodach nie ma cieczy. Jednocześnie przeprowadź płukanie przewodów łączących fiolkę z buforem z zaworem dwa oraz fiolkę z próbką z zaworem jeden.Należy zaprogramować pompę strzykawkową tak, aby pobrała około 15 µL z obu fiolek w celu całkowitego wypełnienia cewki łączącej je z zaworami. Następnie należy przełączyć zawory jeden i dwa na odpływ, aby usunąć nadmiar cieczy lub powietrza, które dostały się do cewki ładującej. W kolejnym kroku należy skonfigurować program ładowania cewki z próbką, rozpoczynając od pobrania 25 µL powietrza z prędkością 50 µL/min.Następnie należy wprowadzić 250 µL próbki z prędkością 200 µL/min, a następnie 35 µL buforu wiodącego z prędkością 200 µL/min i na koniec kolejne 25 µL powietrza z prędkością 50 µL/min. Następnie należy ustawić pompy strzykawkowe tak, aby wprowadzały załadowane korki cieczy z prędkością 100 µL/min i monitorować natężenie przepływu na wylotach dla małych i dużych cząstek za pomocą czujników przepływu. Odpowiedni stosunek przepływów można wyznaczyć zgodnie z opisem w towarzyszącym protokole tekstowym.Gdy czujniki przepływu wykryją gwałtowny wzrost natężenia przepływu, wskazujący na przejście pierwszej przerwy powietrznej, należy przełączyć odpowiedni zawór wyjściowy z fiolki na odpady do fiolki na próbkę. Obserwując odczyty czujników przepływu, upewnij się, że przepływ jest stabilny podczas przechodzenia próbki przez chip i jej rozdzielania. W miarę przechodzenia próbki przez chip, rozdzielone frakcje są zbierane przy zaworach wylotowych.Na końcu wtyczki próbki należy obserwować czujnik przepływu i wykryć drugą przerwę powietrzną. W tym momencie należy przełączyć zawory wyjściowe z powrotem na odpływ. Po dozowaniu pełnej objętości należy zatrzymać infuzję pompą strzykawkową i zakończyć rutynę automatyzacji.Po zakończeniu eksperymentu z separacją odłącz fiolki do zbierania próbek cząstek małych i dużych, a następnie przechowuj je w odpowiedni sposób do dalszych analiz. Umieść rurkę do pobierania próbek w pustych fiolkach, aby zebrać nadmiar roztworów czyszczących, które zostaną przepłukane przez rurki. Następnie uruchom automatyczną procedurę czyszczenia systemu, zgodnie z opisem w towarzyszącym protokole tekstowym.Podczas tego procesu program będzie sterował zaworami i pompą strzykawkową, aby sekwencyjnie napełniać cewkę zatrzymującą odczynnikami czyszczącymi i przepłukiwać nimi system. Po zakończeniu zautomatyzowanego procesu czyszczenia i dekontaminacji należy zutylizować nadmiar roztworów płuczących oraz fiolki, w których zostały one zebrane, zgodnie z odpowiednimi procedurami postępowania z odpadami biologicznymi lub chemicznymi. Przedstawiony tutaj skan częstotliwości jest reprezentatywnym wynikiem dla dobrze sprzężonego elementu piezoelektrycznego i urządzenia mikroprzepływowego.Gdy sprzężenie między elementem piezoelektrycznym a urządzeniem mikrofluidycznym jest prawidłowe, cząsteczki skupiają się ściśle przy częstotliwości rezonansowej, co skutkuje wyraźnym pikiem intensywności fluorescencji i migracją do oczekiwanej pozycji ogniskowania. W przeciwnym razie, przy słabym sprzężeniu, cząsteczki nie będą się odpowiednio skupiać, a urządzenie okaże się nieprzydatne w sytuacjach, gdy kluczowe dla danej aplikacji jest wysokiej jakości ogniskowanie lub szybki przepływ. Każda linia na tym wykresie reprezentuje wyniki rozdziału z wykorzystaniem cząsteczek polistyrenu o różnych rozmiarach oraz różnych napięć sterujących elementem piezoelektrycznym.Generalnie do ekstrakcji mniejszych cząstek wymagane są wyższe napięcia. Jednak napięć w środowisku suchym nie można zwiększać w nieskończoność ze względu na większe rozpraszanie ciepła i nasilające się efekty strumieniowania akustycznego. Aby zademonstrować użyteczność tej platformy w separacji cząstek biologicznych, ludzkie komórki Raji o średniej średnicy od 8 do 10 µm domieszkano wirusem dengi o przybliżonej średnicy 50 nm, a następnie rozdzielono za pomocą akustycznego urządzenia mikroprzepływowego.Po złożeniu i zaprogramowaniu takiego systemu rozdzielenia można rutynowo przeprowadzać w ciągu około pięciu minut. W ciągu godziny można przetworzyć około trzech próbek, uwzględniając całkowite czyszczenie i dekontaminację pomiędzy nimi. Po zastosowaniu tej procedury można wykonać inne metody, takie jak liczenie komórek, western blotting lub sekwencjonowanie nowej generacji, aby potwierdzić czystość rozdzielenia i wyjaśnić znaczenie biologiczne.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak wykonać typowe mikrofluidalne urządzenie separacyjne. Należy wykorzystać połączenia świata zewnętrznego z układem (world-to-chip), aby zintegrować go z urządzeniami sprzętowymi i przeprowadzić zautomatyzowaną procedurę separacji w sposób precyzyjny i stabilny. Należy pamiętać, że praca z materiałami zakaźnymi może być niezwykle niebezpieczna i musi być wykonywana wyłącznie przez odpowiednio przeszkolony personel, z zastosowaniem właściwego sprzętu i procedur bezpieczeństwa biologicznego określonych przez daną instytucję.

a-microfluidic-platform-for-precision-small-volume-sample-processing

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Źródło: Choi, H. J., et al. Akustoforeza mikroprzepływowa do przepływowego rozdzielania bakterii Gram-ujemnych za pomocą kulek powinowactwa aptamerowego. J. Vis. Exp. (2022)Ten film przedstawia metodę selektywnego oddzielania bakterii Gram-ujemnych od mieszanej próbki bakteryjnej za pomocą mikrogranulek pokrytych aptamerem i sił akustycznych w chipie mikroprzepływowym.

Akustoforeza wspomagana aptamerem do mikroprzepływowej separacji bakterii Gram-ujemnych

W tym filmie najpierw opisujemy procedury produkcji i obsługi akustycznego urządzenia przeciwprądowego powierzchniowej fali akustycznej (SAW). Następnie demonstrujemy eksperymentalną konfigurację, która pozwala zarówno na jakościową wizualizację przepływu, jak i analizę ilościową złożonych przepływów w urządzeniu pompującym SAW.

Wytwarzanie, eksploatacja i wizualizacja przepływu w mikrofluidyce akustyczno-przeciwprądowej opartej na powierzchniowych falach akustycznych

W tym artykule prezentujemy mikroprzepływowy chip do analizy pojedynczych komórek. Umożliwia ilościowe oznaczanie wewnątrzkomórkowych białek, enzymów, kofaktorów i drugich przekaźników za pomocą testów fluorescencyjnych lub testów immunologicznych.

Mikroprzepływowy chip do wszechstronnej analizy chemicznej pojedynczych komórek

Tutaj demonstrujemy prostą metodę produkcji mikrokropelek o kontrolowanej wielkości, monodyspersyjnych, typu woda w oleju (W/O) za pomocą kapilarnego odśrodkowego urządzenia mikroprzepływowego. Metoda ta wymaga jedynie niewielkiej objętości próbki i umożliwia produkcję o wysokiej wydajności. Spodziewamy się, że ta metoda będzie przydatna do szybkich analiz biochemicznych i komórkowych.

Kapilarne odśrodkowe urządzenie mikroprzepływowe do formowania mikrokropel monodyspersyjnych o kontrolowanej wielkości

Urządzenia akustofluidyczne wykorzystują fale ultradźwiękowe w kanałach mikroprzepływowych do manipulowania, koncentracji i izolowania zawieszonych mikro i nanoskopowych jednostek. Protokół ten opisuje produkcję i działanie takiego urządzenia obsługującego masowe akustyczne fale stojące w celu skupienia cząstek w centralnym strumieniu bez pomocy płynów osłonowych.

Wytwarzanie i eksploatacja urządzeń akustyczno-przepływowych wspomagających masowe akustyczne fale stojące do bezosłonowego ogniskowania cząstek

Tutaj prezentujemy protokół izolacji i hodowli pojedynczych komórek za pomocą platformy mikroprzepływowej, który wykorzystuje nową koncepcję projektowania mikrostudzienek, aby umożliwić wysokowydajną izolację pojedynczych komórek i długoterminową hodowlę klonalną.

Platforma mikroprzepływowa do wysokowydajnej izolacji i hodowli pojedynczych komórek

Prezentujemy platformę mikroprzepływową ze zintegrowaną siecią elektrod powierzchniowych, która łączy rezystancyjne wykrywanie impulsów (RPS) z wielokrotnym dostępem z podziałem kodu (CDMA), do wielokrotnego wykrywania i wymiarowania cząstek w wielu kanałach mikroprzepływowych.

Platforma mikroprzepływowa z multipleksowaną detekcją elektroniczną do przestrzennego śledzenia cząstek

Przedstawiono protokół manipulowania mikrocząstkami w kanale mikroprzepływowym z wzbudzeniem o podwójnej częstotliwości.

Manipulacja mikrocząstkami poprzez powierzchniowe fale akustyczne z wzbudzeniami o podwójnej częstotliwości

Ten protokół opisuje montaż i działanie taniego urządzenia akustofluidycznego do szybkiego dostarczania molekularnego do komórek poprzez sonoporację wywołaną przez ultradźwiękowe środki kontrastowe.

Montaż i eksploatacja urządzenia akustyczno-fluidycznego w celu lepszego dostarczania związków molekularnych do komórek

Ten artykuł opisuje wytwarzanie i działanie mikroprzepływowych chipów akustoforetycznych przy użyciu techniki akustoforezy mikroprzepływowej i mikrogranulek modyfikowanych aptamerem, które mogą być używane do szybkiej, efektywnej izolacji bakterii Gram-ujemnych z pożywki.

Akustoforeza mikroprzepływowa do przepływowego rozdzielania bakterii Gram-ujemnych za pomocą kulek powinowactwa aptamerowego

Obecny protokół opisuje pneumatyczną platformę mikroprzepływową, która może być używana do efektywnego koncentracji mikrocząstek.

Pneumatycznie napędzana platforma mikroprzepływowa do zagęszczania mikrocząstek

Poznaj metodę automatycznej separacji cząstek w mikroprzepływowym urządzeniu akustycznym. Technika zapewnia precyzję, modularność i minimalną utratę analitu w małych objętościach próbek biologicznych.

Platforma mikroprzepływowa do precyzyjnego przetwarzania próbek o małej objętości i jej wykorzystanie do wymiarowania oddzielnych cząstek biologicznych za pomocą mikrourządzenia akustycznego (Wideo) | JoVE Journal

Platforma mikroprzepływowa do precyzyjnego przetwarzania próbek o małej objętości i jej wykorzystanie do wymiarowania oddzielnych cząstek biologicznych za pomocą mikrourządzenia akustycznego

Przeglądaj więcej filmów