Platforma mikroprzepływowa do precyzyjnego przetwarzania próbek o małej objętości i jej wykorzystanie do wymiarowania oddzielnych cząstek biologicznych za pomocą mikrourządzenia akustycznego

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przeprowadzenie zautomatyzowanej separacji cząstek o małej objętości przy użyciu mikrofluidycznego urządzenia fotycznego. Metoda ta może usprawnić kluczowe procedury w dziedzinie inżynierii biomedycznej, w tym stabilne przetwarzanie i separację próbek do zastosowań w detekcji biologicznej oraz badaniach klinicznych. Głównymi zaletami tej techniki są modułowość, precyzja, odporność i automatyzacja, co czyni ją adaptowalną i elastyczną nie tylko w przypadku separacji retikularnej, ale i w szerokim spektrum przepływowych mikrofluidycznych urządzeń separacyjnych.

W pierwszej kolejności zidentyfikowaliśmy potrzebę wprowadzenia możliwości rutynowego i niezawodnego przeprowadzania rozdziałów dla submilimetrowych objętości próbek biologicznych, bez znaczącego rozcieńczenia lub utraty anality. Integracja dozowania próbek i zautomatyzowanego kierowania z materiału źródłowego do plików zbiorczych, wraz ze standardową pracą pompy strzykawkowej, jest kluczowa dla skutecznej pracy w tej skali. Aby rozpocząć, należy zaprojektować urządzenie do retykulacji akustycznej oraz układ dwóch masek fotograficznych, zgodnie z opisem w sekcji pierwszej dołączonego protokołu tekstowego.

Następnie naniesiono wzór portów dopływowych na tylnej stronie dwustronnie polerowanego wafla krzemowego 1 0 0. Przy użyciu standardowej fotolitografii z rezystem pozytywowym wytrawiono tę geometrię metodą głębokiego trawienia jonowego (DRIE) do głębokości od 350 do 400 µm. Następnie obrócono wafel i naniesiono wzór geometrii kanału płynowego na przedniej stronie.

Ponownie, stosując standardową fotolitografię z pozytywem, zamocuj wzorowany wafelek do drugiego, pustego krzemowego wafla nośnego. Używając fotorezystu, wytraw teraz odsłonięte kanały do głębokości 200 micrometers. Wykorzystując głębokie trawienie reaktywne, namocz następnie wafelek urządzenia w roztworze do usuwania rezystu, aby oddzielić go od pustego wafla krzemowego.

Następnie oczyść wafelek urządzenia oraz bezstrukturalny wafelek ze szkła borokrzemianowego o grubości 0,5 mm za pomocą roztworu piranhy. Po oczyszczeniu uszczelnij kanały płynowe, łącząc jonowo wafelek szklany i krzemowy zgodnie z przedstawionymi tutaj warunkami. Na koniec wytnij poszczególne chipy za pomocą tarczy diamentowej w pile do dicingu z zestawu dwuskładnikowej żywicy epoksydowej o niskiej lepkości.

Odważ zalecaną proporcję obu składników i dokładnie je wymieszaj. Następnie umieść ceramikę piezoelektryczną z tytanianu cyrkonianu ołowiu (PZT) lub PCT w odpowiednim uchwycie i za pomocą pipety równomiernie rozprowadź na niej około 10 µL mieszaniny epoksydowej, aby utworzyć cienką, jednorodną warstwę. Następnie umieść chip w uchwycie i wyrównaj stronę ceramiki piezoelektrycznej z epoksydem względem chipu mikrofluidycznego.

Podczas wyrównywania może być konieczne przymocowanie chipa taśmą, aby utrzymać go w miejscu. Zaciśnij zespół w imadle, uważając, aby nie uszkodzić żadnego z komponentów, a następnie utwardź żywicę w temperaturze i przez czas zalecany przez producenta epoksydu. Po utwardzeniu żywicy użyj lutownicy z cienką końcówką, aby przylutować cienkie przewody do każdej strony ceramiki piezoelektrycznej.

W razie potrzeby użyj odpowiedniego topnika do przygotowania powierzchni piezoelektrycznej. Należy zadbać o jak najkrótszy czas kontaktu z elementem piezoelektrycznym, aby uniknąć jego termicznej depolaryzacji. Przymocuj chip do płytki prototypowej do płynów za pomocą uchwytów zaciskowych.

Następnie należy przymocować wentylator chłodzący do płytki stykowej, aby regulować temperaturę podczas eksperymentów akustycznych. Potem przykręć chip do złączy zewnętrznych. Zamocuj płytkę stykową na stole mikroskopu i połącz złącza zewnętrzne z chipem z dodatkowymi rurkami w otworach wlotowych i wylotowych.

Używając standardowych złączy gwintowanych 1/4-28. Za pomocą rurek o średnicy 1/16 cala połącz chip mikrofluidyczny z pompą strzykawkową, sterowanymi komputerowo wieloportowymi zaworami wyboru, przepływomierzami z interfejsem PC oraz rurkami, jak pokazano tutaj i opisano na rysunku 4 w towarzyszącym protokole tekstowym. Przed rozpoczęciem rozdziału napełnij zbiorniki z odczynnikiem czyszczącym i odpowietrz odpowiadające im linie płynowe.

Następnie ustaw zawory trzy i cztery przy wylotach z układu tak, aby początkowy przepływ kierował się do zbiorników z odpadami. Następnie włącz wentylator chłodzący. Podłącz przewody ceramiki piezoelektrycznej do wzmacniacza mocy i ustaw generator funkcji na częstotliwość rezonansową dla używanego układu akustycznego.

Ustaw wartość napięcia w generatorze funkcji tak, aby wzmacniacz RF generował napięcie od 12 do 25 V szczyt-szczyt, w zależności od pożądanej separacji. Następnie podłącz do systemu odpowiednie fiolki do zbierania oraz fiolkę z buforem wejściowym. Użyj buforu do próbek odpowiedniego dla rozdzielanych komórek lub cząstek lub zgodnie z wymaganiami testu analitycznego, który zostanie przeprowadzony po separacji.

Następnie uruchom oprogramowanie sterujące i wykorzystaj je do kontrolowania zaworów, czujników przepływu oraz pompy w celu przeprowadzenia w pełni automatycznej procedury płukania i separacji. Bezpośrednio przed rozpoczęciem procedury separacji krótko wymieszaj probówkę z próbką na wstrząsarzu (vortex), aby resuspenderć ewentualne osady. Alternatywnie, w przypadku próbek biologicznych bardziej podatnych na uszkodzenia lub tworzenie agregatów podczas wstrząsania, wymieszaj próbkę, pipetując ją w górę i w dół 10 razy.

Następnie podłącz fiolkę z próbką do linii doprowadzającej i bezzwłocznie uruchom procedurę przygotowania i rozdziału. Rozpocznij od użycia oprogramowania do odpowietrzenia wlotu powietrza zaworów jeden i dwa, aby upewnić się, że w przewodach nie ma cieczy. Jednocześnie przeprowadź płukanie przewodów łączących fiolkę z buforem z zaworem dwa oraz fiolkę z próbką z zaworem jeden.

Należy zaprogramować pompę strzykawkową tak, aby pobrała około 15 µL z obu fiolek w celu całkowitego wypełnienia cewki łączącej je z zaworami. Następnie należy przełączyć zawory jeden i dwa na odpływ, aby usunąć nadmiar cieczy lub powietrza, które dostały się do cewki ładującej. W kolejnym kroku należy skonfigurować program ładowania cewki z próbką, rozpoczynając od pobrania 25 µL powietrza z prędkością 50 µL/min.

Następnie należy wprowadzić 250 µL próbki z prędkością 200 µL/min, a następnie 35 µL buforu wiodącego z prędkością 200 µL/min i na koniec kolejne 25 µL powietrza z prędkością 50 µL/min. Następnie należy ustawić pompy strzykawkowe tak, aby wprowadzały załadowane korki cieczy z prędkością 100 µL/min i monitorować natężenie przepływu na wylotach dla małych i dużych cząstek za pomocą czujników przepływu. Odpowiedni stosunek przepływów można wyznaczyć zgodnie z opisem w towarzyszącym protokole tekstowym.

Gdy czujniki przepływu wykryją gwałtowny wzrost natężenia przepływu, wskazujący na przejście pierwszej przerwy powietrznej, należy przełączyć odpowiedni zawór wyjściowy z fiolki na odpady do fiolki na próbkę. Obserwując odczyty czujników przepływu, upewnij się, że przepływ jest stabilny podczas przechodzenia próbki przez chip i jej rozdzielania. W miarę przechodzenia próbki przez chip, rozdzielone frakcje są zbierane przy zaworach wylotowych.

Na końcu wtyczki próbki należy obserwować czujnik przepływu i wykryć drugą przerwę powietrzną. W tym momencie należy przełączyć zawory wyjściowe z powrotem na odpływ. Po dozowaniu pełnej objętości należy zatrzymać infuzję pompą strzykawkową i zakończyć rutynę automatyzacji.

Po zakończeniu eksperymentu z separacją odłącz fiolki do zbierania próbek cząstek małych i dużych, a następnie przechowuj je w odpowiedni sposób do dalszych analiz. Umieść rurkę do pobierania próbek w pustych fiolkach, aby zebrać nadmiar roztworów czyszczących, które zostaną przepłukane przez rurki. Następnie uruchom automatyczną procedurę czyszczenia systemu, zgodnie z opisem w towarzyszącym protokole tekstowym.

Podczas tego procesu program będzie sterował zaworami i pompą strzykawkową, aby sekwencyjnie napełniać cewkę zatrzymującą odczynnikami czyszczącymi i przepłukiwać nimi system. Po zakończeniu zautomatyzowanego procesu czyszczenia i dekontaminacji należy zutylizować nadmiar roztworów płuczących oraz fiolki, w których zostały one zebrane, zgodnie z odpowiednimi procedurami postępowania z odpadami biologicznymi lub chemicznymi. Przedstawiony tutaj skan częstotliwości jest reprezentatywnym wynikiem dla dobrze sprzężonego elementu piezoelektrycznego i urządzenia mikroprzepływowego.

Gdy sprzężenie między elementem piezoelektrycznym a urządzeniem mikrofluidycznym jest prawidłowe, cząsteczki skupiają się ściśle przy częstotliwości rezonansowej, co skutkuje wyraźnym pikiem intensywności fluorescencji i migracją do oczekiwanej pozycji ogniskowania. W przeciwnym razie, przy słabym sprzężeniu, cząsteczki nie będą się odpowiednio skupiać, a urządzenie okaże się nieprzydatne w sytuacjach, gdy kluczowe dla danej aplikacji jest wysokiej jakości ogniskowanie lub szybki przepływ. Każda linia na tym wykresie reprezentuje wyniki rozdziału z wykorzystaniem cząsteczek polistyrenu o różnych rozmiarach oraz różnych napięć sterujących elementem piezoelektrycznym.

Generalnie do ekstrakcji mniejszych cząstek wymagane są wyższe napięcia. Jednak napięć w środowisku suchym nie można zwiększać w nieskończoność ze względu na większe rozpraszanie ciepła i nasilające się efekty strumieniowania akustycznego. Aby zademonstrować użyteczność tej platformy w separacji cząstek biologicznych, ludzkie komórki Raji o średniej średnicy od 8 do 10 µm domieszkano wirusem dengi o przybliżonej średnicy 50 nm, a następnie rozdzielono za pomocą akustycznego urządzenia mikroprzepływowego.

Po złożeniu i zaprogramowaniu takiego systemu rozdzielenia można rutynowo przeprowadzać w ciągu około pięciu minut. W ciągu godziny można przetworzyć około trzech próbek, uwzględniając całkowite czyszczenie i dekontaminację pomiędzy nimi. Po zastosowaniu tej procedury można wykonać inne metody, takie jak liczenie komórek, western blotting lub sekwencjonowanie nowej generacji, aby potwierdzić czystość rozdzielenia i wyjaśnić znaczenie biologiczne.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak wykonać typowe mikrofluidalne urządzenie separacyjne. Należy wykorzystać połączenia świata zewnętrznego z układem (world-to-chip), aby zintegrować go z urządzeniami sprzętowymi i przeprowadzić zautomatyzowaną procedurę separacji w sposób precyzyjny i stabilny. Należy pamiętać, że praca z materiałami zakaźnymi może być niezwykle niebezpieczna i musi być wykonywana wyłącznie przez odpowiednio przeszkolony personel, z zastosowaniem właściwego sprzętu i procedur bezpieczeństwa biologicznego określonych przez daną instytucję.