Platforma mikroprzepływowa do precyzyjnego przetwarzania próbek o małej objętości i jej wykorzystanie do wymiarowania oddzielnych cząstek biologicznych za pomocą mikrourządzenia akustycznego
23 listopada 2015
Ten protokół opisuje architekturę systemu do wykonywania automatycznych separacji cząstek o małej objętości (0,15–1,5 ml) za pomocą urządzenia mikroprzepływowego i omawia metody optymalizacji wydajności i działania urządzenia akustycznego.
Ogólnym celem tej procedury jest przeprowadzenie zautomatyzowanej separacji cząstek o małej objętości za pomocą mikroprzepływowego urządzenia fototycznego. Metoda ta może umożliwić kluczowe procedury w dziedzinie inżynierii biomedycznej, w tym solidne przetwarzanie i separację próbek do wykrywania biologicznego i zastosowań w badaniach klinicznych. Główne zalety tej techniki to modułowość, precyzja, solidność i automatyzacja, dzięki czemu można ją dostosować i elastycznie nie tylko do separacji retycznej, ale także do szerokiej gamy przepływu przez urządzenia do separacji mikroprzepływowej.
Po raz pierwszy dostrzegliśmy potrzebę tej zdolności, aby rutynowo i niezawodnie przeprowadzać separacje na submilimetrowych objętościach próbek biologicznych bez znacznego rozcieńczenia lub utraty analitu. Integracja dozowania próbek i automatycznego kierowania od źródła do plików zbiorczych wraz ze standardowymi operacjami pompy strzykawkowej ma kluczowe znaczenie dla pomyślnej pracy na tę skalę. Aby rozpocząć, należy zaprojektować akustyczne urządzenie retyczne i układ dwóch masek fotograficznych, zgodnie z opisem w sekcji pierwszej dołączonego protokołu tekstowego.
Następnie ułóż tylne porty płynu na dwustronnie polerowanej płytce krzemowej 1 0 0. Korzystając ze standardowej fotolitografii o dodatnim oporze Wytraw tę geometrię za pomocą głębokiego reaktywnego trawienia jonowego na głębokość od 350 do 400 mikrometrów. Następnie odwróć wafel i ułóż wzór geometrii kanału płynu po przedniej stronie.
Ponownie, używając standardowej fotolitografii o dodatnim rezystancji, zamontuj wzorzystą płytkę do drugiej pustej płytki nośnej krzemu. Za pomocą fotorezystu wytraw teraz odsłonięte kanały na głębokość 200 mikrometrów. Używając głębokiego wytrawiania jonowego, zanurz płytkę urządzenia w roztworze do usuwania oporu, aby oddzielić ją od pustej płytki krzemowej.
Następnie wyczyść wafel urządzenia i pozbawiony cech charakterystycznych wafel ze szkła boro-krzemianowego o grubości 0,5 milimetra za pomocą roztworu piranii. Po oczyszczeniu uszczelnij kanały płynu jonowo wiążąc szkło i płytkę krzemową w warunkach pokazanych tutaj. Na koniec odetnij poszczególne wióry za pomocą diamentowego ostrza na piłce do krojenia w kostkę z dwuskładnikowego zestawu epoksydowego o niskiej lepkości.
Odważ zalecane proporcje obu składników i dokładnie je wymieszaj. Następnie umieść ołowiany tytanian Zirkin lub ceramikę piezoelektryczny PCT w odpowiednim przyrządzie i za pomocą pipety równomiernie rozprowadź na niej około 10 mikrolitrów mieszanki epoksydowej, aby utworzyć cienką, równą warstwę. Następnie umieść wiór w przyrządzie i wyrównaj epoksydową stronę ceramiki pizo z chipem mikroprzepływowym.
Może być konieczne przyklejenie chipa taśmą, aby utrzymać go na miejscu podczas wyrównywania. Zamocuj zespół w imadle, uważając, aby nie pęknąć żadnego z elementów i utwardź w temperaturze i czasie zalecanym przez producenta żywicy epoksydowej. Po utwardzeniu żywicy epoksydowej użyj lutownicy z cienką końcówką, aby przymocować cienkie przewody z drutu po obu stronach ceramiki pizo.
W razie potrzeby użyj odpowiedniego topnika do przygotowania powierzchni pizo. Uważaj, aby nawiązać jak najkrótszy kontakt z pizo, aby uniknąć jego termicznej depolaryzacji. Przymocuj chip do płynnej płytki stykowej za pomocą uchwytów zaciskowych.
Podłącz również wentylator chłodzący do płytki stykowej, aby regulować temperaturę podczas eksperymentów akustycznych. Następnie przykręć chip do złączy światowych. Zamontuj płytkę stykową na stoliku mikroskopu i dołącz do świata, aby chipować złącza do dodatkowych przewodów na wlotach i wylotach.
Korzystanie ze standardowych złączy gwintowanych ćwiartkowych 28. W przypadku jednej rurki 16-calowej podłącz chip mikroprzepływowy do pompy strzykawkowej, sterowanych komputerowo wieloportowych zaworów selekcyjnych, przepływomierzy z interfejsem PC i przewodów, jak pokazano tutaj i opisano na rysunku czwartym dołączonego protokołu tekstowego. Przed rozpoczęciem separacji napełnij zbiorniki odczynnika czyszczącego i zalej odpowiednie przewody płynu.
Ustaw również zawory trzeci i czwarty na wylotach wiórów, aby początkowo przepływały do zbiorników na odpady. Następnie włącz wentylator chłodzący. Podłącz przewody ceramiczne pizo do wzmacniacza mocy i ustaw generator funkcyjny na częstotliwość rezonansową dla używanego chipa akustycznego.
Dostosuj nastawę napięcia w generatorze funkcyjnym tak, aby wzmacniacz RF wychodził od 12 do 25 V od szczytu do szczytu, odpowiednio do żądanej separacji. Następnie podłączyć odpowiednie fiolki do pobierania i fiolkę wejściową buforu do systemu. Należy użyć buforu do próbek odpowiedniego dla komórek lub cząstek, które mają zostać rozdzielone, lub zgodnie z wymaganiami testu analitycznego, który ma być użyty po rozdzieleniu.
Następnie załaduj oprogramowanie sterujące i użyj go do sterowania zaworami, czujnikami przepływu i pompą, aby przeprowadzić w pełni automatyczną procedurę zalewania i separacji. Bezpośrednio przed rozpoczęciem procedury rozdzielania należy krótko przemieszać fiolkę z próbką, aby ponownie zawiesić wszelkie cząstki, które mogły się osiąść. Alternatywnie, należy pipetować próbkę w górę i w dół 10 razy, aby wymieszać próbki biologiczne, które są bardziej podatne na uszkodzenie lub zbrylanie się w wyniku wirowania.
Następnie podłącz fiolkę z próbką do przewodu wejściowego i niezwłocznie rozpocznij procedurę wstępowania i rozdzielania. Zacznij od użycia oprogramowania do zalania wlotu powietrza zaworów pierwszego i drugiego, aby upewnić się, że rurka nie zawiera płynu. Jednocześnie zalać rurkę łączącą fiolkę wejściową buforu z zaworem drugim i fiolkę wprowadzającą próbkę z zaworem pierwszym.
Niech pompa strzykawkowa pobierze około 15 mikrolitrów z obu fiolek, aby całkowicie napełnić rurkę, łącząc je z zaworami. Na koniec przełącz zawory pierwszy i drugi na marnotrawstwo, aby usunąć nadmiar płynu lub powietrza, które dostało się do cewki ładującej. Następnie skonfiguruj program, aby załadować cewkę próbki, najpierw pobierając 25 mikrolitrów powietrza z prędkością 50 mikrolitrów na minutę.
Następnie załadowanie 250 mikrolitrów próbki z prędkością 200 mikrolitrów na minutę, następnie 35 mikrolitrów buforu wiodącego z prędkością 200 mikrolitrów na minutę, a na koniec kolejne 25 mikrolitrów powietrza z prędkością 50 mikrolitrów na minutę. Następnie ustaw pompy strzykawkowe tak, aby zaparzały załadowane korki płynu z prędkością 100 mikrolitrów na minutę i monitoruj natężenie przepływu na wylotach małych i dużych cząstek za pomocą czujników przepływu. Odpowiedni współczynnik przepływu można określić zgodnie z opisem w dołączonym protokole tekstowym.
Gdy czujniki przepływu wykryją skok natężenia przepływu wskazujący na przejście pierwszej szczeliny powietrznej, należy przełączyć odpowiedni zawór wyjściowy z fiolki na fiolkę z odpadami na fiolkę do pobierania próbek. Upewnij się, że przepływ jest stabilny, gdy próbka przechodzi przez chip i jest oddzielana, obserwując odczyty czujnika przepływu. Gdy próbka przechodzi przez chip, oddzielone frakcje są zbierane na zaworach wylotowych.
Na końcu korka próbki obserwować czujnik przepływu, wykryć drugą szczelinę powietrzną. W tym momencie przełącz zawory wyjściowe z powrotem na odpływ. Po dozowaniu pełnej objętości należy przerwać infuzję pompy strzykawkowej i zakończyć procedurę automatyzacji.
Po zakończeniu eksperymentu rozdzielania odłączyć fiolki do pobierania próbek małych i dużych cząstek i przechowywać je w odpowiedni sposób do późniejszej analizy. Zabezpiecz probówkę do pobierania próbki w pustych fiolkach, aby zebrać nadmiar roztworów czyszczących, które zostaną przepłukane przez probówki. Następnie rozpocznij procedurę automatycznego czyszczenia systemu zgodnie z opisem w dołączonym protokole tekstowym.
Podczas tego procesu program będzie sterował zaworami i pompą strzykawkową, aby sekwencyjnie załadować cewkę podtrzymującą odczynnikami czyszczącymi i przepłukać je przez system. Po zakończeniu automatycznego procesu czyszczenia i odkażania należy wyrzucić nadmiar roztworów płuczących i fiolki, w których się zebrały, postępując zgodnie z odpowiednimi procedurami postępowania z odpadami biologicznymi lub chemicznymi. Pokazano tutaj reprezentatywny skan częstotliwości z dobrze sprzężonego urządzenia pizo i mikroprzepływowego.
Gdy sprzężenie między urządzeniem pizo a urządzeniem mikroprzepływowym jest dobre, cząstki skupiają się ściśle na częstotliwości rezonansowej, co skutkuje wyraźnym szczytem intensywności fluorescencji i migracją do oczekiwanej pozycji ogniskowania. W przeciwieństwie do tego, tam, gdzie występuje słabe sprzężenie, cząstki nie będą dobrze skupiać się, a urządzenie nie nadaje się, gdy wysoka jakość ostrości lub szybki przepływ mają kluczowe znaczenie dla wymaganego zastosowania. Każda linia na tym wykresie przedstawia wyniki separacji przy użyciu różnych rozmiarów cząstek polistyrenu i napięć sterujących pizo.
Ogólnie rzecz biorąc, do ekstrakcji mniejszych cząstek wymagane są wyższe napięcia. Napięcia suche nie mogą być jednak zwiększane w nieskończoność ze względu na większe rozpraszanie ciepła i nasilające się efekty strumieniowania akustycznego. Aby zademonstrować użyteczność tej platformy do biologicznej separacji cząstek, ludzkie komórki raji o średniej średnicy od 8 do 10 mikrometrów zostały wzbogacone wirusem dengi o przybliżonej średnicy 50 nanometrów, a następnie oddzielone za pomocą akustycznego urządzenia mikroprzepływowego.
Po zmontowaniu i zaprogramowaniu takiego systemu, separacje można rutynowo przeprowadzić w ciągu około pięciu minut. Można przetwarzać około trzech próbek na godzinę z całkowitym czyszczeniem i odkażaniem między próbkami. Po tej procedurze można zastosować inne metody, takie jak liczenie komórek, western blotting lub sekwencjonowanie nowej generacji, w celu potwierdzenia czystości separacji i wyjaśnienia znaczenia biologicznego.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wyprodukować typowe urządzenie do separacji mikroprzepływowej. Korzystaj z połączeń world to chip, aby łączyć się ze sprzętem i uruchamiać zautomatyzowaną procedurę separacji w precyzyjny i niezawodny sposób. Nie zapominaj, że praca z materiałami zakaźnymi może być niezwykle niebezpieczna i może być wykonywana wyłącznie przez odpowiednio przeszkolony personel przy użyciu odpowiedniego, instytucjonalnie zalecanego sprzętu i procedur zapewniających bezpieczeństwo biologiczne.
Przegląd
Ten protokół opisuje architekturę systemu do zautomatyzowanego separacji cząstek w małej objętości z wykorzystaniem urządzenia mikrofluidycznego. Skłania się na metody poprawy wydajności i działania urządzeń akustofluidycznych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Inżynieria biomedyczna
- Mikrofluidyka
- Techniki separacji cząstek
Tło
- Potrzeba niezawodnej separacji submilimetrowych próbek biologicznych.
- Ważność minimalizowania rozcieńczenia i utraty analitów.
- Integracja pomiaru próbek i zautomatyzowanej trasy.
- Wykorzystanie standardowych operacji pompy strzykawki dla efektywności.
Cel badania
- Rozwój metody zautomatyzowanej separacji cząstek.
- Poprawa wytrzymałości i precyzji urządzeń mikrofluidycznych.
- Ułatwienie zastosowań w badaniach klinicznych poprzez poprawę przetwarzania próbek.
Stosowane metody
- Projektowanie i produkcja urządzenia akustycznego.
- Fotolitografia do kształtowania geometrii kanałów.
- Integracja piezoceramicznych elementów do manipulacji akustycznej.
- Automatyczne sterowanie systemami fluidycznymi do separacji próbek.
Główne wyniki
- Udana implementacja zautomatyzowanej separacji cząstek.
- Wykazana modułowość i precyzja w działaniu urządzenia.
- Skuteczna obsługa małych objętości próbek bez strat.
- Walidacja metody dla różnych zastosowań mikrofluidycznych.
Wnioski
- Opracowany protokół poprawia wydajność separacji cząstek.
- Urządzenia akustofluidyczne mogą być optymalizowane dla różnych zastosowań.
- Ta metoda wspiera postęp w badaniach biomedycznych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This microfluidic platform enables precise, automated processing of small-volume biological samples (0.15–1.5 mL), reducing reagent waste and preserving precious analytes in early discovery workflows. By integrating modular device design with closed-loop fluid handling, it supports robust, reproducible particle separation—critical for target validation and assay development where sample integrity directly impacts data quality. The system’s adaptability to various microfluidic devices, including acoustofluidic chips, allows seamless integration into discovery pipelines requiring high-confidence, low-input separations for mechanistic de-risking and lead identification.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by isolating specific biological particles (e.g., cells, viruses) from complex mixtures without significant dilution or loss.
- Operational Value: Supports functional target validation through precise size-based separation, clarifying pathway involvement and reducing mechanistic ambiguity in early-stage targets.
- Predictive Value: Enhances portfolio triage by generating reliable separation data that informs go/no-go decisions based on particle purity and yield.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological subsystems for downstream assays by concentrating target particles and removing interferents, improving signal-to-noise in detection assays.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility via automated, closed-loop sample processing, priming, and cleaning cycles that minimize variability between runs.
- Scalability: Facilitates screening readiness through modular chip exchange and consistent world-to-chip connections, enabling platform reuse across multiple separation targets.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Maintains sample integrity from discovery through preclinical validation by enabling concentration of rare biological particles (e.g., circulating cells, viral particles) for biomarker analysis.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports data-driven decisions by providing quantitative, reproducible separation outputs that correlate with biological relevance and reduce false positives in preclinical models.
- Mechanistic De-risking: When applied to disease-relevant systems, helps isolate pathogenic particles to clarify mechanism of action and de-risk translational candidates.
Pipeline & Workflow Integration
The platform integrates into the discovery continuum from early target validation through lead identification to preclinical studies, particularly where low-volume, high-purity particle separation is required for downstream analysis.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling precise isolation of biological particles (e.g., Raji cells, dengue virus) from heterogeneous samples.
- Screening: Delivers assay-ready samples through automated, reproducible fluid handling that ensures consistent particle separation and collection.
- Analytics: Generates quantitative outputs (e.g., flow rate spikes, particle fractionation) monitored via integrated flow sensors, enabling objective comparison of separation conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by concentrating low-abundance biological particles (e.g., viral particles spiked into cells) for subsequent validation via cell counting, Western blotting, or sequencing.
- Enterprise Reuse: Designed as a reusable capability—modular architecture allows rapid device exchange and standardized operation across teams and projects without re-optimization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through precise, size-based particle separation.
- Operational Value: Delivers standardization, reproducibility, and scalability via automated priming, separation, and cleaning routines that ensure consistent performance across runs.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by enabling reliable, low-input separations that de-risk biological targets early in the pipeline.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by generating high-fidelity separation data that informs advancement decisions based on particle purity and yield.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic device fabrication, photolithography, and acoustic transducer integration.
- Depends on instrumentation including syringe pumps, multiport valves, flow sensors, function generators, power amplifiers, and temperature control (cooling fan).
- Necessitates cross-team standardization of world-to-chip connections, fluidic tubing, and valve programming for reproducible operation.
- Involves adaptation considerations when applying to different biological systems (e.g., cell types, particle sizes) due to varying acoustic properties and optimal driving voltages.
- Practical limitations include thermal management during prolonged acoustic operation and the need for careful handling of piezo ceramics to avoid depolarization.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:04
Cleanroom Fabrication of Microfluidic Chips for Acoustophoresis
2:32
Piezo Transducer Attachement
3:51
Separation Procedure
8:26
Automated Cleaning and Decontamination
9:08
Results: Size Separation of Biological Particles Using an Acoustic Microdevice
10:24
Conclusion
