Mikromielenie mikroprzepływowe urządzenia akrylowego sterowane numerycznie z ograniczeniem naprzemiennym dla testów immunologicznych opartych na nanocząstkach magnetycznych

Nasz protokół opisuje metodę mikromielenia o wysokiej rozdzielczości w celu wytworzenia akrylowego urządzenia mikroprzepływowego do ilościowej immunodetekcji stężeń analitu porównywalnych ze złotym standardem techniki ELISA. Najważniejszym wydarzeniem jest wyprodukowanie prostego i taniego termoplastycznego urządzenia mikroprzepływowego bez pomieszczenia czystego, co pozwala na skrócenie czasu oznaczania i uzyskanie dobrych limitów wykrywalności w sposób ilościowy. Zacznij od szlifowania powierzchni.

Wytnij prostokąty o wymiarach 9 x 25 milimetrów z PMMA o grubości 1,3 milimetra za pomocą frezu palcowego o grubości 800 mikrometrów. Ostrożnie przymocuj jeden z tych prostokątów za pomocą dwustronnej taśmy klejącej do platformy piezoelektrycznej. Podłącz i umieść czujnik Z na powierzchni prostokąta PMMA.

Wybierz kołek detekcyjny i przesuń go po powierzchni czujnika. Opuść sworzeń ręcznie, nie dotykając czujnika. Aktywuj tryb wykrywania Z-zero.

Zakręć wiertłem frezu palcowego o średnicy 200 mikrometrów z prędkością 14 500 obr./min. Powoli opuść go do współrzędnej początku układu współrzędnych na osi z. Następnie zresetuj oś z 30 mikrometrów poniżej początku układu współrzędnych.

Ustaw tę współrzędną jako nowy początek układu współrzędnych Z. Kliknij przycisk Wytnij w oprogramowaniu mikrofrezarki, aby aktywować panel cięcia. Kliknij przycisk Dodaj i wybierz plik TXT z wcześniej utworzonym kodem do szlifowania powierzchni akrylowej.

Kliknij przycisk Wyjście, aby rozpocząć proces. W przypadku frezowania z ograniczeniem pięciu mikrometrów, najpierw ustaw prędkość obrotową wiertła frezu palcowego na 11 000 obr./min. Następnie podnieś platformę o 6,5 mikrometra za pomocą interfejsu platformy piezoelektrycznej.

Przesuń wiertło frezu palcowego wzdłuż osi y o 500 mikrometrów. Przywróć platformę piezoelektryczną do jej wartości początkowej na osi z interfejsem sterowania. Następnie należy wykonać frezowanie mikrokanalików, otwierając wcześniej utworzony plik projektowy z poziomu oprogramowania do projektowania.

Kliknij przycisk Drukuj, przejdź do menu właściwości i kliknij okno koloru odpowiadające warstwie zawierającej projekt do obróbki. Ustaw parametry produkcyjne w panelu narzędzi. Do frezowania otworów należy przełączyć się na frez palcowy o średnicy 800 mikrometrów.

Aktywuj warstwę projektową otworów o średnicy 1,2 milimetra, klikając odpowiednie okno kolorów i wybierając odpowiednie parametry produkcyjne. Obrobić dwa dodatkowe otwory w przeciwległych rogach prostokąta w celu wyrównania akrylu w odwrócony sposób na nowej platformie. Odwróć akryl i przyklej go dwustronną taśmą klejącą do adaptera z obrobionymi słupkami.

Otwórz plik z wymiarem otworów dla przeciwległej ściany z oprogramowania do projektowania. Zmielić pozostałą połowę otworów wlotowych i wylotowych odczynnika o średnicy 1,5 milimetra i głębokości 0,7 milimetra. Wyczyść oba arkusze akrylowego prostokąta alkoholem izopropylowym i spłucz wodą destylowaną.

Zanurz akryl w kąpieli ultradźwiękowej na 10 minut. Wysuszyć oba arkusze akrylowe i przykleić je do wewnętrznej strony szklanej pokrywki szalki Petriego taśmą dwustronną. Następnie umieść podstawę szklanej szalki Petriego w większej szklanej szalce Petriego.

Wlej jeden mililitr chloroformu na dno szalki Petriego i szybko przykryj pokrywką arkusze akrylowe. Natychmiast dodaj wodę destylowaną do podstawy większej szalki Petriego do poziomu pokrywy szalki Petriego. Pozostawić akryl na działanie chloroformu przez jedną minutę.

Następnie przechyl szalkę Petriego, aby zerwać uszczelkę wodną i natychmiast odsłonić szalkę Petriego. W celu klejenia wyrównaj oba akryle z bokami odsłoniętymi na chloroformu twarzą w twarz i uformuj kanapkę. Umieść akryl w prasie na dwa odstępy po dwie minuty, zmieniając ułożenie akrylu.

Następnie przymocuj od dwóch do trzech centymetrów węża do każdego z otworów urządzenia za pomocą kleju w płynie do natychmiastowego schnięcia. Napełnij kanały wodą destylowaną za pomocą strzykawki. Zanurz urządzenie w kąpieli ultradźwiękowej na 10 minut.

Następnie opróżnij wodę z kanałów urządzenia i za pomocą strzykawki wprowadź 5% roztwór BSA. Przygotować zawiesinę mikrocząstek żelaza o średnicy 7,5 mikrometra w 5% BSA. Inkubować chip i zawiesinę mikrocząstek z roztworem blokującym przez co najmniej jedną godzinę w temperaturze pokojowej.

Następnie wprowadź mikrocząsteczki do chipa za pomocą igły strzykawkowej przez wąż wylotowy kanału bocznego. Umieść chip pionowo, a następnie obróć go w dwóch krokach po 90 stopni, tak aby mikrocząsteczki celowały i zagęszczały się przy ograniczeniu pięciu mikrometrów. Uszczelnij wszystkie węże urządzenia akrylowego ciepłem.

Przetnij wąż dopływowy, aż pozostanie tylko kilka milimetrów. Napełnij igłę dozującą buforem do płukania i włóż ją do odciętego węża. Poczekaj, aż roztwór zacznie kapać, a następnie podłącz igłę do urządzenia.

Odciąć wąż odpływowy od kanału bocznego, a następnie podłączyć do pompy strzykawkowej. Następnie powtórz tę samą procedurę dla węża wylotowego kanału głównego. Następnie przymocuj chip do magnesu.

W celu immunodetekcji utrzymuj przepływ buforu płuczącego przez 10 minut z prędkością 50 mikrolitrów na godzinę. Usunąć pozostały bufor do przemywania z igły dozującej za pomocą mikropipety i dodać 50 mikrolitrów zawiesiny nanocząstek. Zawiesinę nanocząstek należy przepływać przez siedem minut z prędkością przepływu 100 mikrolitrów na godzinę.

Następnie zmień natężenie przepływu na 50 mikrolitrów na godzinę i kontynuuj przepływ przez kolejne 15 minut. Zmień igłę dozującą i przepływaj bufor do płukania przez 10 minut z tą samą szybkością. Usunąć pozostały bufor do płukania z igły dozującej za pomocą mikropipety i dodać 100 mikrolitrów substratu fluorogenicznego.

Dostosuj parametry natężenia przepływu i czasu wprowadzania substratu, pomiaru fluorescencji i etapu mycia. Aktywuj przepływ wejściowy substratu fluorogenicznego na sześć minut przy 50 mikrolitrach na godzinę. Na 15 sekund przed zatrzymaniem przepływu substratu włącz fluorescencję mikroskopu.

Rozpocznij rejestrowanie obrazu za pomocą oprogramowania kamery mikroskopowej na 10 sekund przed zatrzymaniem podłoża przy czasie naświetlania wynoszącym 1 000 milisekund. Kliknij przycisk Start żądanego parametru natężenia przepływu natychmiast po zatrzymaniu zmywania podłoża. Wykonuj obrazowanie przez sześć minut z prędkością jednej klatki na sekundę.

Kliknij przycisk Start przepływu mycia natychmiast po zatrzymaniu wybranego przepływu pomiarowego. Do testu immunologicznego użyto nanocząstek sprzężonych z lizozymem i przeciwciała drugorzędowego sprzężonego z peroksydazą chrzanu. Zaobserwowano wzrost intensywności fluorescencji dla różnych stężeń przeciwciał pierwszorzędowych, porównując regiony przed i po pułapce, co pokazuje, że zmiana fluorescencji substratu jest wprost proporcjonalna do stężenia przeciwciała pierwszorzędowego.

Dla danego stężenia przeciwciała pierwszorzędowego intensywność fluorescencji wykreślono jako funkcję czasu przy różnych szybkościach przepływu substratu fluorogenicznego. Zdolność konwersji substratu przez enzym HRP była odwrotnie proporcjonalna do natężenia przepływu, maksymalną intensywność uzyskano dla natężenia przepływu jednego mikrolitra na godzinę. Dla różnych szybkości przepływu dla różnych stężeń przeciwciał pierwotnych, krzywe różnic fluorescencji po i przed reakcją immunologiczną wykazały, że dla stężenia 1 000 nanogramów na mililitr fluorescencja nasyca się dla wszystkich ocenianych szybkości przepływu.

Krzywą kalibracyjną przygotowano przy użyciu maksymalnej wartości różnic w intensywności fluorescencji uzyskanej w odniesieniu do stężenia przeciwciała pierwszorzędowego dla każdego natężenia przepływu. Duża zmienność i wysoki poziom fluorescencji na poziomie jednego mikrolitra na godzinę sugerowały, że szybkość nie sprzyja przepływowi reagującego substratu i ma tendencję do gromadzenia się tuż po pułapce. Szczególną uwagę należy zwrócić na etapy uszczelniania mikrokanalików, ponieważ narażenie na działanie chloroformu jest bardzo wrażliwe na temperaturę.

Aby uzyskać powtarzalne wyniki, temperatura musi być zawsze taka sama. Nasz system pomaga zrozumieć, gdzie zwartość i rozmiar mikrocząstek, rozmiar nanocząstek, antygeny, przeciwciało detekcyjne i substrat są czynnikami decydującymi o granicy wykrywalności w mikroprzepływowym teście immunologicznym opartym na nanocząstkach.