Test immunofluorescencyjny białek naświetlonych powierzchniowo leptospirali

Białka powierzchniowe bakterii mają bezpośredni kontakt z komórkami gospodarza, a także biorą udział w pobieraniu składników odżywczych ze środowiska. Dlatego lokalizacja powierzchniowa białek bakteryjnych jest kluczowym krokiem w kierunku identyfikacji czynników wirulencji. W niniejszej pracy przedstawiono metodę oceny ekspozycji powierzchniowej białek na nienaruszonych aspirach lepto w porównaniu z wcześniej opisanymi testami immunofluorescencyjnymi.

Szczegóły opisanej tutaj metody mają na celu zminimalizowanie manipulacji komórkami w celu utrzymania integralności błony zewnętrznej. Pierwsze zawiesinę spiralną lepto dodaje się do szkiełek komorowych. Szkiełka są inkubowane, aby umożliwić komórkom przyleganie przylegających iglic lepto są mocowane za pomocą 2% aldehydu paraformowego, aby zachować nienaruszoną błonę zewnętrzną do oceny białka powierzchniowego, lub ze 100% metanolem w celu przeniknięcia błony zewnętrznej w celu odsłonięcia białek podpowierzchniowych.

Utrwalone iglice lepto są następnie znakowane specyficznymi przeciwciałami i wizualizowane za pomocą przeciwciał drugorzędowych znakowanych fluorescencyjnie. Białka zlokalizowane powierzchniowo można znakować i obserwować w nienaruszonych i przepuszczalnych komórkach, podczas gdy białka podpowierzchniowe można obserwować tylko w komórkach przepuszczalnych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie patogenezy drobnoustrojów, takie jak białko zlokalizowane na powierzchni bakterii, w którym może odgrywać rolę w interakcjach patogenów gospodarza.

Przedstawiona tutaj metoda ma na celu zminimalizowanie manipulacji komórkami, co powinno pomóc w utrzymaniu integralności błony. Metoda ta polega na niższym stężeniu środka utrwalającego, płukaniu membraną zmieniającą, buforem stabilizującym oraz mniejszą liczbą etapów płukania niż poprzednio opisane testy. Ponadto nasza metoda immunofluorescencji powierzchniowej podkreśla znaczenie zarówno pozytywnych, jak i ujemnych kontroli, które są niezbędne do dokładnej interpretacji danych.

Procedurę zademonstruje dr Maria Pinney, adiunkt w moim laboratorium. Leptospira Interrogans jest drugim patogenem BSL. Praca z żywymi komórkami wymaga odpowiedniego obchodzenia się z nimi i środków ostrożności.

Przez cały czas należy nosić fartuch laboratoryjny i rękawice. Cała procedura pipetowania i/lub obchodzenia się z żywymi komórkami w otwartych pojemnikach powinna odbywać się w przepływie laminarnym. Kaptur bezpieczeństwa biologicznego uprawia leptospira w pożywce EMJH uzupełnionej 1% surowicą króliczą w temperaturze 30 stopni Celsjusza, gdy bakterie osiągną średnią lub późną fazę logarytmiczną.

Około sześć dni później zbierz kulturę, wirując w temperaturze 2000 razy G przez siedem minut w temperaturze pokojowej po wirowaniu. Usunąć supernatant przez aspirację i delikatnie zawiesić osad w PBS z pięcioma milimolowymi chlorkami magnezu do końcowego stężenia pięć razy 10 do ośmiu komórek na mililitr. Obok każdej studzienki znajdują się dwie szklane szkiełka studzienne.

Dodaj tutaj jeden mililitr zawiesiny komórek. Dla każdego testu białka powierzchniowego przygotowuje się jedno szkiełko testowe i jedno szkiełko kontrolne, przy czym drugi studzienka służy do kontroli, jak pokazano tutaj, inkubuje się w temperaturze 30 stopni Celsjusza, aby umożliwić przyleganie komórek. Po 80 minutach ostrożnie zassać płyn, aby usunąć niezwiązane komórki do szkiełek testowych, które zostaną wykorzystane do oceny białek wystawionych na działanie powierzchni.

Dodaj jeden mililitr na studzienkę 2% para formaldehydu w PBS z pięcioma milimolowymi chlorkami magnezu, aby przymocować pozostałe nienaruszone bakterie do szkła. Inkubować przez 40 minut w temperaturze 30 stopni Celsjusza do szkiełek kontrolnych, które zostaną wykorzystane do oceny białek podpowierzchniowych. Napraw komórki i przeniknij przez zewnętrzną błonę, dodając jeden mililitr 100% lodowatego metanolu do każdej studzienki.

Metanol przenika przez błonę zewnętrzną, denaturuje białka i przywiązuje komórki do szkła. Szkiełka inkubuje się w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez 20 minut. Po utrwaleniu zassać środki utrwalające.

Ogniwa nie są już żywotne i nie trzeba ich obsługiwać w kapturze bezpieczeństwa biologicznego. Aby oznaczyć bakterie specyficznymi przeciwciałami, zacznij od dodania jednego mililitra buforu blokującego do każdej studzienki na wszystkich szkiełkach, aby zablokować niespecyficzne wiązanie. Inkubować w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 90 minut.

Podczas inkubacji rozcieńczyć pierwszorzędowe przeciwciało w buforze blokującym. Zastosowane tutaj przeciwciała są skierowane przeciwko białkom Leptospira interrogans. Przeciwciało MPL 54 rozpoznaje odsłonięte na powierzchni białko błony zewnętrznej o mocy 54 kilodaltonów.

Przeciwciało anty płaskie A one rozpoznaje podjednostkę A plazmowego gellanu, a przeciwciało anty OL one rozpoznaje lepto spiral poin, która jest białkiem błony zewnętrznej. Należy również przygotować kontrole ujemne przez rozcieńczenie przedimmunologicznych surowic króliczych lub płynu puchatego myszy niezawierających przeciwciał w buforze blokującym. Po inkubacji przez 90 minut usunąć bufor blokujący przez aspirację i dodać jeden mililitr rozcieńczonych przeciwciał pierwszorzędowych lub cera kontrolnej do każdej studzienki inkubowanej w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez jedną godzinę.

Usunąć ciecz przez aspirację i umyć studzienki trzykrotnie PBS, dodać jeden mililitr przeciwciał drugorzędowych znakowanych LOR 4 88 do każdej studzienki i fluorescencyjnego barwnika kwasu nukleinowego DPI rozcieńczonego w buforze blokującym. Ten etap zapewnia wykrycie wiązania przeciwciał i obecność wszystkich spiro keets niezależnie odpowiednio od wiązania przeciwciał. Inkubuj szkiełka w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 45 minut.

Usunąć ciecz przez aspirację i umyć studzienki dwukrotnie PBS i raz wodą destylowaną, usunąć komory i pasek samoprzylepny ze szkiełek szklanych. Następnie suszyć szkiełka na powietrzu przez około 10 minut. Dodaj 20 mikrolitrów przedłużonego złotego podłoża do mocowania zapobiegającego blaknięciu dla każdej próbki na szkiełku.

Następnie umieść szkiełko nakrywkowe o wymiarach 24 na 50 milimetrów, inkubuj przez noc w temperaturze pokojowej w ciemności. Ten krok jest niezbędny, aby umożliwić utwardzenie się podłoża montażowego. Następnego dnia.

Uszczelnij szkiełko nakrywkowe lakierem do paznokci. Wizualizacja barwienia za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej przy użyciu cyjanowego lub niebieskiego filtra detekcji dla DPI i zielonego filtra detekcji dla LOR 4 88. Aby zapewnić dokładne odwzorowanie próbek, należy ocenić cały obszar komory dla każdej próbki.

Rejestrować dane poprzez obrazowanie reprezentatywnego pola dla każdej próbki. Podczas obrazowania fluorescencji exor 4 88 należy stosować ten sam czas naświetlania dla wszystkich próbek. Stosowanie spójnego czasu ekspozycji pozwoli na dokładniejsze porównanie wyników z antygenami testowymi w porównaniu z kontrolami.

Pamiętaj, aby ocenić cały obszar komory dla każdej próbki przed wyciągnięciem wniosków. Przeprowadzono analizę immunofluorescencyjną w celu oceny ekspozycji powierzchniowej MPL 54 w Leptospira inters. Jak pokazano tutaj, wykryto silny sygnał fluorescencyjny.

Sygnał ten był nieobecny w komórkach inkubowanych z surowicami przedimmunologicznymi, ale pozostał spójny w komórkach przepuszczalnych. Jeśli białko znajduje się na powierzchni, w nienaruszonych aspirach leptycznych zostanie wykryta znaczna intensywność fluorescencji. Jeśli białko znajduje się pod powierzchnią, zostanie wykryte tylko w komórkach przesiąkniętych, zwykle w teście dodatnim.

W przybliżeniu taką samą intensywność fluorescencji obserwuje się zarówno w komórkach nienaruszonych, jak i perme. Gdy nieprzepuszczalne komórki inkubowano na płasko z białkiem podpowierzchniowym, nie zaobserwowano jednego barwienia, co wskazuje, że zewnętrzna błona pozostała nienaruszona podczas eksperymentu. Dlatego można wywnioskować, że ML 54 jest odsłonięty powierzchniowo, gdy w nienaruszonych komórkach obserwuje się znacznie mniejszą fluorescencję niż w komórkach przesiąkniętych.

Albo białko znajduje się w położeniu podpowierzchniowym z pewnym niespecyficznym barwieniem tła nienaruszonych komórek, albo przeciwciała wiążą się preferencyjnie z nienatywnymi epitopami, które są odsłonięte po przepuszczalności metanolu. W obu przypadkach niejednoznaczne wyniki, takie jak ten, wymagają alternatywnych podejść, takich jak biotyna powierzchniowa lub proteoliza powierzchniowa, aby określić, czy białko jest odsłonięte powierzchniowo, czy nie. Podczas próby wykonania tej procedury ważne jest, aby uwzględnić wystarczającą liczbę kontroli, aby zapewnić, że błona przeciwdziałająca pozostaje nienaruszona.

Kontrole te obejmują premium metanol w surowicy, komórki trwałej ondulacji i surowicę odpornościową na białka podpowierzchniowe.