Name: Test immunofluorescencyjny białek naświetlonych powierzchniowo leptospirali (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-01T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 47 s
Description: Poznaj metodę immunofluorescencyjną do oceny białek naświetlonych powierzchniowo leptospirali przy zachowaniu integralności błony zewnętrznej. Technika ta umożliwia identyfikację czynników wirulencji w badaniach mikrobiologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Niniejsze badanie zostało sfinansowane z grantu Public Health Service AI-34431 (przyznanego D.A.H.) z National Institute of Allergy and Infectious Diseases oraz z funduszy VA Medical Research Funds (przyznanych D.A.H.).

1. Fixacja Leptospira na szkiełkach przedmiotowych
<ol>
<li>Leptospira interrogans jest patogenem klasy BSL2. Praca z żywymi komórkami wymaga zachowania odpowiednich środków ostrożności, takich jak noszenie rękawiczek, fartucha laboratoryjnego oraz wykonywanie etapów pipetowania w komorze z laminarnym przepływem powietrza.</li>
<li>Hodować Leptospira w podłożu EMJH1 z dodatkiem 1% surowicy króliczej w temperaturze 30° C aż do osiągnięcia środkowej lub późnej fazy logarytmicznej (gęstość 5 x 107 do 5 x 108 komórek/ml) przez około 6 dni.</li>
<li>Zbiór kultury należy przeprowadzić poprzez wirowanie przy przyspieszeniu ok. 20 x g przez 7 min w temperaturze pokojowej.</li> 
<li>Usunąć nadsącz poprzez aspirację, a następnie delikatnie resuspendować osad w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) z dodatkiem 5 mM MgCl2.2, pH 7,2 do stężenia końcowego 5 x 108 komórek/ml.</li>
<li>Do każdej studni szkiełek przedmiotowych z dwiema komorami należy dodać 1 ml zawiesiny komórkowej, a następnie inkubować w 30° C przez 80 min, aby umożliwić adhezję komórek.</li>
<li>Ostrożnie usuń ciecz zawierającą niezwiązane komórki poprzez aspirację.</li>
<li>Utrwal pozostałe nienaruszone bakterie na szkiełkach przedmiotowych, dodając 1 ml/dołek 2% paraformaldehydu w PBS z 5 mM MgCl2.2Inkubować przez 40 min w temperaturze 30° CPreparaty te będą służyć do oceny białek eksponowanych na powierzchni.</li>
<li>W przypadku preparatów kontrolnych służących do oceny białek podpowierzchniowych, należy przepuścić błonę zewnętrzną poprzez utrwalenie za pomocą 1 ml/dołka 10% lodowatego metanolu. Inkubować w temperaturze -20° C przez 20 min. Metanol działa w kilku obszarach: zwiększa przepuszczalność błony zewnętrznej, denaturuje białka i utrwala komórki na szkiełkach przedmiotowych.</li>
<li>Usunąć środki utrwalające poprzez aspirację.</li>
</ol>
2. Markowanie swoistymi przeciwciałami
<ol>
<li>Zablokuj wiązania niespecyficzne, dodając 1 ml/dołek buforu blokującego (Difco Leptospira Enrichment EMJH). Inkubuj w temperaturze 30° C przez 90 min.</li>
<li>Rozcieńcz swoiste przeciwciała (immunologiczne sera królicze lub mysie przeciwciała monoklonalne, w tym przypadku poliklonalne sera królicze swoiste dla OmpL5410, FlaA112 oraz OmpL113) oraz sera królicze przedimmunizacyjne lub mysi płyn ascytyczny nie zawierający przeciwciał (stosowane jako kontrole negatywne) w buforze blokującym. Rozcieńczenia dla każdego przeciwciała należy wyznaczyć empirycznie, w zależności od miana przeciwciał, reaktywności antygen-przeciwciało oraz zawartości białka w komórce. Zwyczajny zakres rozcieńczeń wynosi od 1:50 do 1:60.</li>
<li>Usuń bufor blokujący za pomocą aspiratora i dodaj 1 ml/dołek rozcieńczonych przeciwciał pierwszorzędowych.</li>
<li>Inkubuj w temperaturze 30° C przez 1h.</li>
<li>Usuń ciecz za pomocą aspiratora i przemyj dołki trzykrotnie przy użyciu PBS (1 ml/dołek).</li>
</ol>
3. Wizualizacja leptospir
<ol>
<li>Do każdej studni dodaj 1 ml przeciwciał wtórnych znakowanych Alexa Fluor 48 (kozich anty-rabbit IgG lub kozich anty-mouse IgG) rozcieńczonych 1:20 oraz fluorescencyjnego barwnika kwasów nukleinowych, dihydrochlorku 4’,6-diamidyno-2-fenylopentanu (DAPI), rozcieńczonego do stężenia końcowego 0,25 μg/ml w buforze blokującym. Ten etap służy odpowiednio do wykrycia wiązania przeciwciał oraz obecności wszystkich krętków, niezależnie od wiązania przeciwciał.</li>
<li>Inkubuj preparaty w temperaturze 30° C przez 45 min.</li>
<li>Usuń ciecz poprzez aspirację, a następnie przemyj studnie dwukrotnie PBS i raz wodą destylowaną (1 ml/studnia).</li>
<li>Zdejmij komory oraz pasek klejący z szkiełek przedmiotowych i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu przez ok. 10 min.</li>
<li>Nałóż medium montażowe zapobiegające blaknięciu ProLong Gold (2 x 20 μl na szkiełko) oraz nakrywek 24 x 50 mm.</li>
<li>Inkubuj przez noc w temperaturze pokojowej w ciemności. Krok ten jest niezbędny, aby medium montażowe mogło utwardzić się.</li>
<li>Zabezpiecz nakryvkę lakierem do paznokci.</li>
<li>Wizualizuj barwienie za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, używając filtra detekcyjnego cyjanowego/niebieskiego dla DAPI oraz filtra detekcyjnego zielonego dla Alexa Fluor 48. Aby zapewnić dokładną reprezentację próbek, należy ocenić cały obszar komory dla każdej próbki.</li>
<li>Zapisz dane, wykonując obrazowanie reprezentatywnego pola dla każdej próbki. Podczas obrazowania fluorescencji Alexa Fluor 48 zastosuj ten sam czas ekspozycji dla wszystkich próbek. Zastosowanie spójnego czasu ekspozycji pozwoli na dokładniejsze porównanie wyników dla antygenów testowych względem kontroli.</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki: 
Przykłady wyników powierzchniowej metody IFA dla komórek Leptospira interrogans z użyciem przeciwciał przeciwko białkom powierzchniowym i podpowierzchniowym przedstawiono na rysunku 2. Test uznaje się za pozytywny, gdy w próbkach z nienaruszonymi leptospirami wykryta zostanie znaczna fluorescencja dla badanego białka eksponowanego na powierzchni (Rys. 2A). Zazwyczaj w przypadku testu pozytywnego (tutaj: białko OmpL54 eksponowane na powierzchni) obserwuje się zbliżoną intensywność fluorescencji zarówno w komórkach nienaruszonych, jak i permeabilizowanych (Rys. 2A). Niezbędne jest uwzględnienie kontroli negatywnej dla integralności błony zewnętrznej przy użyciu przeciwciał przeciwko białku podpowierzchniowemu, najlepiej periplazmatycznemu (np. leptospiralnemu FlaA1, Rys. 2B). Dopiero gdy dane wykażą, że błona zewnętrzna pozostała nienaruszona podczas eksperymentu, tj. przeciwciała przeciwko białku podpowierzchniowemu nie reagują z nienaruszonymi komórkami (brak fluorescencji lub fluorescencja znacznie słabsza w porównaniu z próbką permeabilizowaną, jak na Rys. 2B), można wyciągnąć wniosek, że badane białko(a) jest eksponowane na powierzchni. W celu uzyskania jednoznacznych danych niezbędne jest włączenie do eksperymentów surowic przedimmunizacyjnych (w przypadku przeciwciał poliklonalnych) jako dodatkowej kontroli negatywnej; nie powinny one dawać znacznej fluorescencji w komórkach nienaruszonych ani permeabilizowanych (Rys. 2A, 2C). Barwienie DAPI jest konieczne do wizualizacji leptospir w przypadku uzyskania wyników negatywnych (brak fluorescencji Alexa Fluor 48). Akceptywalną alternatywą dla DAPI jest przeciwbarwienie jodkiem propidium.
Metoda ta ma charakter jakościowy, a nie ilościowy, ponieważ silniejsza fluorescencja może wynikać z rozpoznawania wielu eksponowanych na powierzchni epitopów antygenowych w obrębie jednego antygenu w porównaniu do innych antygenów o tej samej obfitości, ale z mniejszą liczbą epitopów powierzchniowych. W związku z tym intensywność fluorescencji może służyć jedynie do porównywania reaktywności tych samych przeciwciał, na przykład w przypadku komórek nienaruszone kontra permeabilizowanych, a nie do porównywania intensywności fluorescencji różnych białek. Rozróżnienie to jest istotne w przypadku uzyskania niejednoznacznego wyniku, w którym w komórkach nienaruszonych obserwuje się znacznie słabszą fluorescencję niż w komórkach permeabilizowanych (Rys. 2C). Taki wynik wskazuje, że białko znajduje się w lokalizacji podpowierzchniowej (przy pewnym nieswoistym barwieniu tła komórek nienaruszone), przeciwciała wiążą się preferencyjnie z epitopami nienatywnymi, które zostają odsłonięte po permeabilizacji metanolem, lub białko może posiadać wiele miejsc lokalizacji, jak opisano dla białek Erp i Elp innej krętkicy, Borrelia burgdorferi14. W każdym z tych przypadków niejednoznaczny wynik IFA, taki jak ten, wymaga zastosowania alternatywnych podejść, np. biotinylacji powierzchniowej lub proteolizy powierzchniowej, aby określić, czy badane białko jest eksponowane na powierzchni, czy nie 10.
<img src="/files/ftp_upload/2805/2805fig1.jpg" alt="Schemat wiązania białek w próbie i kontroli z użyciem paraformaldehydu i metanolu, przedstawiający oddziaływania antygenów." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rycina 1. Schemat analizy immunofluorescencyjnej powierzchni krętków Leptospira interrogans. Najpierw do każdej studni szkiełek z dwukomorową komorą (co najmniej dwa szkiełka dla każdego eksperymentu) dodaje się 1 ml zawiesiny komórkowej i inkubuje w celu przytwierdzenia leptospir. Następnie leptospiry utrwala się na szkiełkach komorowych poprzez dodanie 1 ml/studnię 2% paraformaldehydu (PFA) w przypadku próbek z nienaruszoną błoną zewnętrzną (OM) lub 1 ml/studnię 10% zimnego metanolu w przypadku próbek z permeabilizowaną błoną OM. Następnie leptospiry inkubuje się z przeciwciałami rozpoznającymi białka eksponowane na powierzchni oraz przeciwciałami kontrolnymi przeciwko białkom podpowierzchniowym (przeciwciała pierwotne) w 30° C przez 90 min. Następnie przeciwciała pierwotne są wykrywane poprzez inkubację z 1 ml/dołek przeciwciał wtórnych sprzężonych z Alexa Fluor 48. Na koniec komórki są wizualizowane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.
<img src="/files/ftp_upload/2805/2805fig2.jpg" alt="Równowaga statyczna; lokalizacja białek; mikroskopia; porównanie surowic odpornych i przedodpornych; komórki." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rysunek 2. Analiza immunofluorescencji powierzchniowej białek leptospir. Spirochety *Leptospira interrogans* poddano badaniu z użyciem serum odpornościowego i przedimmunizacyjnego; w przypadku wyników negatywnych zastosowano przeciwbarwienie DAPI w celu wykazania obecności spirochet. Do detekcji wiązania znakowanego Alexa Fluor 48 przeciwciała wtórnego z białkami eksponowanymi na powierzchni użyto filtra fluorescencji zielonej, natomiast do detekcji wiązania DAPI z DNA komórkowym użyto filtra fluorescencji niebiesko-cyjanowej. A) Leptospiry poddane badaniu z przeciwciałami rozpoznającymi białko eksponowane na powierzchni, OmpL5410B) Komórki znakowane przeciwciałami przeciwko białku podpowierzchniowemu periplazmy, FlaA1 (kontrola negatywna). C) Komórki znakowane przeciwciałami przeciwko porynie leptospiralnej, OmpL1. Wiązanie surowic króliczych z leptospirami wykryto za pomocą fragmentów IgG kozich przeciwko króliczym sprzężonych z Alexa Fluor 48. Wszystkie obrazy wykonano przy czasie ekspozycji wynoszącym 4 s.

<ol><li>Achouak, W., Heulin, T., Pages, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+facets+of+bacterial+porins%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Lett%22%5BJournal%5D)">Multiple facets of bacterial porins.</a> FEMS Microbiol Lett. 199, 1-7 (2001).</li>
<li>Haake, D. A., Matsunaga, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+leptospiral+outer+membrane+and+description+of+three+novel+leptospiral+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Characterization of the leptospiral outer membrane and description of three novel leptospiral membrane proteins.</a> Infect Immun. 70, 4936-4945 (2002).</li>
<li>Haake, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+surface+of+Leptospira+interrogans+serovar+grippotyphosa+during+in+vitro+cultivation%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Changes in the surface of Leptospira interrogans serovar grippotyphosa during in vitro cultivation.</a> Infect Immun. 59, 1131-1140 (1991).</li>
<li>Nally, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+proteomic+analysis+of+outer+membrane+vesicles+from+a+clinical+isolate+of+Leptospira+interrogans+serovar+Copenhageni%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Purification and proteomic analysis of outer membrane vesicles from a clinical isolate of Leptospira interrogans serovar Copenhageni.</a> Proteomics. 5, 144-152 (2005).</li>
<li>Zuerner, R. L., Knudtson, W., Bolin, C. A., Trueba, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+outer+membrane+and+secreted+proteins+of+Leptospira+interrogans+serovar+pomona%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Pathog%22%5BJournal%5D)">Characterization of outer membrane and secreted proteins of Leptospira interrogans serovar pomona.</a> Microb Pathog. 10, 311-322 (1991).</li>
<li>Cullen, P. A., Haake, D. A., Adler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outer+membrane+proteins+of+pathogenic+spirochetes%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Outer membrane proteins of pathogenic spirochetes.</a> FEMS Microbiol Rev. 28, 291-318 (2004).</li>
<li>Haake, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spirochaetal+lipoproteins+and+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Spirochaetal lipoproteins and pathogenesis.</a> Microbiology. 146, 1491-1504 (2000).</li>
<li>Koebnik, R., Locher, K. P., Gelder, P. V. an <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+bacterial+outer+membrane+proteins%3A+barrels+in+a+nutshell%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Structure and function of bacterial outer membrane proteins: barrels in a nutshell.</a> Mol Microbiol. 37, 239-253 (2000).</li>
<li>Schulz, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSchulz%2C+G+%22The+structures+of+general+porins%22">The structures of general porins</a>. Benz, R. , WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. Weinheim/Germany. (2004).</li>
<li>Pinne, M., Haake, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+approach+to+identification+of+surface-exposed%2C+outer+membrane-spanning+proteins+of+Leptospira+interrogans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A comprehensive approach to identification of surface-exposed, outer membrane-spanning proteins of Leptospira interrogans.</a> PLoS One. 4, e6071-e6071 (2009).</li>
<li>Johnson, R. C., Rogers, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolism+of+leptospires.+II.+The+action+of+8-azaguanine%5BTitle%5D)+AND+%22Can+J+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Metabolism of leptospires. II. The action of 8-azaguanine.</a> Can J Microbiol. 13, 1621-1629 (1967).</li>
<li>Cullen, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surfaceome+of+Leptospira+spp%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Surfaceome of Leptospira spp.</a> Infect Immun. 73, 4853-4863 (2005).</li>
<li>Haake, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning+and+sequence+analysis+of+the+gene+encoding+OmpL1%2C+a+transmembrane+outer+membrane+protein+of+pathogenic+Leptospira+spp%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning and sequence analysis of the gene encoding OmpL1, a transmembrane outer membrane protein of pathogenic Leptospira spp.</a> J Bacteriol. 175, 4225-4234 (1993).</li>
<li>Hefty, P. S., Jolliff, S. E., Caimano, M. J., Wikel, S. K., Akins, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+temporal+and+spatial+patterns+of+outer+surface+lipoprotein+expression+generate+population+heterogeneity+and+antigenic+diversity+in+the+Lyme+disease+spirochete%2C+Borrelia+burgdorferi%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Changes in temporal and spatial patterns of outer surface lipoprotein expression generate population heterogeneity and antigenic diversity in the Lyme disease spirochete, Borrelia burgdorferi.</a> Infect Immun. 70, 3468-3478 (2002).</li>
<li>Noppa, L., Östberg, Y., Lavrinovicha, M., Bergström, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P13+an+integral+membrane+protein+of+Borrelia+burgdorferi%2C+is+C-terminally+processed+and+contains+surface-exposed+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">P13 an integral membrane protein of Borrelia burgdorferi, is C-terminally processed and contains surface-exposed domains.</a> Infect Immun. 69, 3323-3334 (2001).</li>
<li>Parveen, N., Leong, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+candidate+glycosaminoglycan-binding+adhesin+of+the+Lyme+disease+spirochete+Borrelia+burgdorferi%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification of a candidate glycosaminoglycan-binding adhesin of the Lyme disease spirochete Borrelia burgdorferi.</a> Mol Microbiol. 35, 1220-1234 (2000).</li>
<li>Ristow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+OmpA-like+protein+Loa22+is+essential+for+leptospiral+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">The OmpA-like protein Loa22 is essential for leptospiral virulence.</a> PLoS Pathog. 3, e97-e97 (2007).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Nasza technika powierzchniowej IFA jest podobna do tej, której użyto do wykazania ekspozycji powierzchniowej różnych białek borrelialnych 15, 16 oraz leptospiralnych 12, 17. Szczegóły opisanej tutaj metody powierzchniowej IFA zostały opracowane w celu zminimalizowania manipulacji komórkami, aby zachować integralność błony zewnętrznej, wykorzystując jednocześnie tendencję komórek Leptospira do przylegania do szkiełek przedmiotowych. Metoda ta zakłada zastosowanie niższego stężenia (2% zamiast 4%) par...

<table><tbody><tr><td>Szkiełka przedmiotowe z dwiema komorami</td><td>Lab-Tek</td><td>177380</td><td></td></tr><tr><td>Surowica królika</td><td>Rockland Immunochemicals</td><td>D209-00-0100</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Leptospira&lt;/em&gt; Pożywka wzbogacona EMJH</td><td>BD Biosciences</td><td>279510</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 przeciwko IgG (H+L) królika, kozie</td><td>Invitrogen</td><td>A-11034</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 przeciwko IgG (H+L) myszy, kozie</td><td>Invitrogen</td><td>A-11029</td><td></td></tr><tr><td>4&amp;rsquo;6-diamidyno-2-fenyloindol dihydrochlorek (DAPI)</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Medium montażowe ProLong Gold anti-fade</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td>Przed użyciem doprowadzić do temperatury pokojowej</td></tr><tr><td>Lampki cover glass Fisherfinest Premium</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-14</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>Axioskop 40</td><td></td></tr></tbody></table>

analiza immunofluorescencyjna białek powierzchniowych leptospir**

Immuno-fluorescence Assay of Leptospiral Surface-exposed Proteins

Białka powierzchniowe bakterii biorą udział w bezpośrednim kontakcie z komórkami gospodarza oraz w pobieraniu składników odżywczych ze środowiska 1. Z tego powodu lokalizacja komórkowa może dostarczyć informacji na temat funkcjonalnej roli białek bakteryjnych. Lokalizacja powierzchniowa białek bakteryjnych jest kluczowym krokiem w kierunku identyfikacji czynników wirulencji zaangażowanych w mechanizmy patogenności.
Metody frakcjonowania błon leptospiralnych 2-5 mogą być selektywne dla określonej klasy białek błony zewnętrznej (OMPs), takich jak lipoproteiny w przeciwieństwie do transbłonowych OMPs, co może prowadzić do błędnej klasyfikacji. Jest to prawdopodobnie spowodowane różnicami strukturalnymi oraz sposobem ich powiązania z błoną zewnętrzną. Lipoproteiny wiążą się z błonami poprzez oddziaływanie hydrofobowe między lipidową częścią N-końcową (trzema kwasami tłuszczowymi) a fosfolipidami dwuwarstwy lipidowej 6, 7. Z kolei transbłonowe OMPs są zazwyczaj wbudowane w dwuwarstwę lipidową za pomocą amfipatycznych beta-harmonijek (β-sheets) ułożonych w strukturę beczułkowatą 8, 9. Ponadto obecność białka w błonie zewnętrznej nie gwarantuje koniecznie, że białko to lub jego domeny są eksponowane na powierzchni. Błony zewnętrzne krętków są znane z tego, że są kruche, co wymaga stosowania metod obejmujących delikatne manipulowanie komórkami oraz uwzględnienia kontroli białek podpowierzchniowych w celu oceny integralności błony zewnętrznej.
W niniejszej pracy przedstawiamy metodę testu immunofluorescencji (IFA) do bezpośredniej oceny ekspozycji powierzchniowej białek na nienaruszonych leptospirach. Metoda ta opiera się na rozpoznawaniu białek powierzchniowych leptospir przez przeciwciała swoiste względem antygenu. W opisanym badaniu wykrywane są przeciwciała swoiste dla OmpL5410 po ich związaniu z natywnymi, eksponowanymi na powierzchni epitopami. Porównanie reaktywności przeciwciał względem komórek nienaruszonych i permeabilizowanych umożliwia ocenę dystrybucji komórkowej oraz ustalenie, czy dane białko znajduje się selektywnie na powierzchni leptospir. Integralność błony zewnętrznej należy ocenić przy użyciu przeciwciał przeciwko jednemu lub kilku białkom podpowierzchniowym, najlepiej zlokalizowanym w periplazmie.
Metodę IFA powierzchniowej można wykorzystać do analizy ekspozycji powierzchniowej każdego białka leptospiralnego, do którego dostępne są swoiste przeciwciała. Zarówno użyteczność, jak i ograniczenia tej metody zależą od tego, czy zastosowane przeciwciała są w stanie wiązać się z epitopami natywnymi. Ponieważ przeciwciała są często wytwarzane przeciwko białkom rekombinowanym, epitopy natywnych białek eksponowanych na powierzchni mogą nie zostać rozpoznane. Niemniej jednak, metoda IFA powierzchniowa jest cennym narzędziem do badania składników nienaruszonych powierzchni bakteryjnych. Metodę tę można stosować nie tylko w przypadku leptospir, ale także innych krętków i bakterii gram-ujemnych. W celu sformułowania bardziej jednoznacznych wniosków dotyczących ekspozycji powierzchniowej OMP, zaleca się kompleksowe podejście obejmujące kilka metod lokalizacji komórkowej 10.

Opisano wydajną metodę oceny ekspozycji powierzchniowej białek leptospir. Metoda ta została zaprojektowana specjalnie w celu uniknięcia uszkodzenia delikatnej błony zewnętrznej komórek leptospir. Technika ta wymaga zastosowania kilku kontroli negatywnych w celu oceny integralności błony zewnętrznej oraz specyficzności reakcji przeciwciał.

Analiza immunofluorescencyjna białek powierzchniowych leptospir**

Białka powierzchniowe bakterii biorą udział w bezpośrednim kontakcie z komórkami gospodarza oraz w pobieraniu składników odżywczych ze środowiska 1. Z tego powodu komórkowe ...

Białka powierzchniowe bakterii wchodzą w bezpośredni kontakt z komórkami gospodarza i biorą również udział w pobieraniu składników odżywczych ze środowiska. W związku z tym lokalizacja białek bakteryjnych na powierzchni jest kluczowym krokiem w kierunku identyfikacji czynników wirulencji. W niniejszej pracy przedstawiono metodę oceny ekspozycji powierzchniowej białek w nienaruszonych leptospirach w porównaniu z wcześniej opisanymi testami immunofluorescencyjnymi.Szczegóły opisanego tutaj метода zostały opracowane w celu zminimalizowania manipulacji komórkami, aby zachować integralność błony zewnętrznej. Najpierw zawiesinę lepto-spirali dodaje się do szkiełek z komorą szklaną. Szkiełka są inkubowane, aby umożliwić adhezję komórek; przylegające lepto-spirale utrwalane są 2%paraform aldehydem w celu zachowania nienaruszonej błony zewnętrznej do oceny białek powierzchniowych lub 100%metanolem w celu permeabilizacji błony zewnętrznej, aby odsłonić białka podpowierzchniowe.Następnie unieruchomione spirale leptospir są znakowane swoistymi przeciwciałami i wizualizowane przy użyciu przeciwciał wtórnych znakowanych fluorescencyjnie. Białka zlokalizowane na powierzchni można znakować i obser

immuno-fluorescence-assay-of-leptospiral-surface-exposed-proteins

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Badanie immunofluorescencyjne białek narażonych na powierzchni leptospir

Identyfikacja mikrobiologicznych celów odporności adaptacyjnej w chorobach idiopatycznych może zostać przeprowadzona przy użyciu testu ELISpot (enzyme-linked immunospot assay).

Test immunospot z enzymatycznym sprzężeniem (ELISPOT): Ilościowe oznaczenie komórkowych odpowiedzi immunologicznych Th-1 przeciwko antygenom mikrobiologicznym

Ten film prezentuje pośredni test immunoenzymatyczny lub test immunoenzymatyczny ELISA, przeznaczony do oceny poziomów immunogennej glikoproteiny w szczepionkach. Płytka testowa, zawierająca przeciwciała specyficzne dla glikoproteiny, jest inkubowana z seryjnie rozcieńczanymi próbkami szczepionki, w tym szczepionkami referencyjnymi i testowymi, a następnie przeprowadza się test immunologiczny w celu ilościowego określenia zawartości glikoproteiny w badanej szczepionce.

Za pomocą testu ELISA typu kanapkowego w celu określenia zawartości glikoproteiny immunogennej w szczepionce

Ten film demonstruje metodę monitorowania zakażonego białka komórkowego 0, ICP0 w zakażeniu wirusem opryszczki pospolitej-1. Po syntezie de novo ICP0 przemieszcza się do jądra, a następnie przemieszcza się do cytoplazmy podczas progresji infekcji. Mikroskopia immunofluorescencyjna ujawnia i analizuje subkomórkową lokalizację białka, oferując wgląd w jego transport w różnych fazach infekcji.

Technika immunofluorescencji lokalizacji białek wirusowych w zakażonych komórkach

Możliwość szczegółowego monitorowania odpowiedzi limfocytów T in vivo jest ważna dla rozwoju naszego zrozumienia odpowiedzi immunologicznej. W tym miejscu opisujemy zastosowanie docelowych macierzy fluorescencyjnych (FTA) w teście in vivo limfocytów T, który ocenia &gt;250 parametrów jednocześnie za pomocą cytometrii przepływowej.

Zastosowanie fluorescencyjnych macierzy docelowych do oceny odpowiedzi limfocytów T in vivo

Opisujemy test lektyny sprzężony z enzymem (ELLA) do pomiaru miana przeciwciał hamujących neuraminidazę grypy (NA) w surowicach. Test wykorzystuje aglutyninę z orzeszków ziemnych do ilościowego określenia reszt galaktozy, które stają się dostępne, gdy NA usuwa kwas sjalowy z 96-dołkowych płytek pokrytych fetuiną.

Pomiar mian przeciwciał hamujących neuraminidazę grypy za pomocą testu lektyny sprzężonej z enzymem

Tutaj opisujemy pośrednie wychwytywanie immunologiczne metodą ELISA w celu określenia zawartości immunogennej glikoproteiny w szczepionkach przeciwko wściekliźnie. Ten test wykorzystuje neutralizujące przeciwciało monoklonalne (mAb-D1) rozpoznające trimery glikoproteiny. Jest to alternatywa dla testu NIH in vivo w celu śledzenia spójności siły działania szczepionki podczas produkcji.

Test ELISA in vitro do oceny siły działania szczepionki przeciwko wściekliźnie

Tutaj prezentujemy protokół wykrywania epitopów neutralizacji na cząsteczkach wirusopodobnych wyświetlających antygen (VLP). Immunoprecypitację VLP pochodzących z ludzkiego wirusa niedoboru odporności (HIV) przeprowadza się przy użyciu przeciwciał monoklonalnych specyficznych dla glikoprotein otoczkowych sprzężonych z kulkami magnetycznymi sprzężonymi z białkiem G. Przechwycone VLP są następnie poddawane analizie SDS-PAGE i Western blot przy użyciu przeciwciał specyficznych dla białka rdzenia...

Wykrywanie epitopów wrażliwych na neutralizację w antygenach wyświetlanych na szczepionkach opartych na cząsteczkach wirusopodobnych (VLP) za pomocą testu wychwytywania

W tym badaniu, aplikacja dot-blot została zaprojektowana do wykrywania Leptospira z trzech głównych kladów w próbkach wody. Metoda ta pozwala na identyfikację minimalnych ilości DNA specyficznie ukierunkowanych na sondę znakowaną digoksygeniną, łatwo wykrywalnych przez przeciwciało anty-digoksygeninowe. Takie podejście jest cennym i zadowalającym narzędziem do celów badań przesiewowych.

Reakcja łańcuchowa polimerazy i hybrydyzacja kropkowa do wykrywania Leptospira w próbkach wody

Tutaj opisujemy nowo opracowany multipleksowy fluorescencyjny test immunologiczny, który wykorzystuje system cytometrii z podwójnym przepływem reporterowym do jednoczesnego wykrywania dwóch unikalnych epitopów białka kolca na nienaruszonych cząsteczkach wirusa SARS-CoV-2 (SARS-CoV-2) zespołu ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej, które zostały wychwycone przez mikrosfery magnetyczne sprzężone z enzymem konwertującym angiotensynę.

Profilowanie epitopów białek powierzchniowych na cząsteczkach wirusa za pomocą strategii multipleksu dual-reporter

Chociaż prokariota nie mają układu organellarnego, istnieją regiony subkomórkowe ze zlokalizowanymi białkami. Ilościowa i jakościowa analiza enzymów i białek w regionach subkomórkowych jest ważna dla opracowania celów dla leków i szczepionek. Tutaj ilustrujemy subkomórkowe frakcjonowanie białek leptospiralnych za pomocą Triton X-114 i jego analizę.

Wzbogacanie białek subkomórkowych w Leptospira przy użyciu metody frakcjonowania opartej na Triton X-114

Poznaj metodę immunofluorescencyjną do oceny białek naświetlonych powierzchniowo leptospirali przy zachowaniu integralności błony zewnętrznej. Technika ta umożliwia identyfikację czynników wirulencji w badaniach mikrobiologicznych.

Analiza immunofluorescencyjna białek powierzchniowych leptospir**

Przeglądaj więcej filmów