Wykrywanie epitopów wrażliwych na neutralizację w antygenach wyświetlanych na szczepionkach opartych na cząsteczkach wirusopodobnych (VLP) za pomocą testu wychwytywania
February 10th, 2022
Tutaj prezentujemy protokół wykrywania epitopów neutralizacji na cząsteczkach wirusopodobnych wyświetlających antygen (VLP). Immunoprecypitację VLP pochodzących z ludzkiego wirusa niedoboru odporności (HIV) przeprowadza się przy użyciu przeciwciał monoklonalnych specyficznych dla glikoprotein otoczkowych sprzężonych z kulkami magnetycznymi sprzężonymi z białkiem G. Przechwycone VLP są następnie poddawane analizie SDS-PAGE i Western blot przy użyciu przeciwciał specyficznych dla białka rdzenia wirusa Gag.
W moim laboratorium opracowujemy systemy produkcji wektorów wirusowych i szczepionek opartych na cząsteczkach wirusopodobnych lub VLP. Test wychwytywania VLP pozwala na bardzo czułe wykrywanie docelowych antygenów wyświetlanych na VLP. W tym teście używamy szeroko neutralizujących przeciwciał skierowanych przeciwko epitopom neutralizującym, aby udowodnić ekspozycję tych epitopów na powierzchnię VLP.
Jest to ważna ocena jakości dla kandydatów na szczepionki, ponieważ tylko VLP wykazujące epitopy wrażliwe na neutralizację będą w stanie wywołać neutralizującą odpowiedź przeciwciał u zaszczepionych. Zacznij od zawieszenia kulek magnetycznych, pipetując w górę i w dół lub mieszając na rotatorze z prędkością 50 obr./min przez co najmniej pięć minut. W międzyczasie przygotuj roztwór przeciwciał zawierający bNAB.
Użyj 10 mikrogramów każdego bNAB w 200 mikrolitrach buforu wiążącego przeciwciała i przemłukiwającego na reakcję. Dla każdej reakcji przenieś 50 mikrolitrów roztworu kulek magnetycznych do 1,5-mililitrowej probówki reakcyjnej, a następnie umieść probówki na stojaku do separacji magnetycznej. Poczekaj, aż kulki zgromadzą się na kulce probówki, aby upewnić się, że wszystkie kulki zostały zebrane, a następnie usuń supernatant.
Wyjmij magnes i zawieś koraliki w 200 mikrolitrach wcześniej przygotowanego roztworu bNAB. Inkubować przez 30 minut do trzech godzin, mieszając na rotatorze z prędkością 50 obr./min w temperaturze pokojowej. Po inkubacji umieścić probówki reakcyjne w stojaku do separacji magnetycznej, odczekać i usunąć supernatant.
Wyjmij probówki z magnesu i umyj kulki, ponownie zawieszając w 200 mikrolitrach buforu wiążącego przeciwciała i myjącego. Powtórzyć płukanie z wiązaniem przeciwciał i buforem myjącym, usuwając jak najwięcej buforu myjącego po zakończeniu. Dodaj próbki do bNAB związanych z koralikami.
Jeśli objętość dodanej próbki jest mniejsza niż jeden mililitr, dodaj PBS, aby dostosować objętość próbki do jednego mililitra, a następnie ponownie zawiesić kulki, delikatnie pipetując. Inkubować próbki i kulki przez 2,5 godziny na rotatorze w temperaturze pokojowej, upewniając się, że kulki pozostają w zawiesinie, a roztwór jest dokładnie wymieszany podczas inkubacji. Umieść rurki na magnesie i usuń supernatant, a następnie umyj kulki magnetyczne, zawieszając je w 200 mikrolitrach bufora myjącego.
Zawiesić kulki w 100 mikrolitrach buforu płuczącego i przenieść zawiesinę do czystej, żaroodpornej rurki reakcyjnej. Umieść probówkę na stojaku do separacji magnetycznej i całkowicie usuń supernatant. Aby przygotować denaturowane próbki STS-PAGE, zawiesić kulki w 20 do 80 mikrolitrach buforu Laemmli i inkubować w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez pięć minut.
Postępuj bezpośrednio z SDS-PAGE, umieszczając probówki na stojaku magnetycznym, aby oddzielić kulki od roztworu. Alternatywnie należy przechowywać próbki w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Reprezentatywny wynik VLP po raz pierwszy wychwyconych z supernatantu do hodowli komórkowych i granulek VLP przy użyciu bNAB, a następnie poddanych analizie Western blot w celu wykrycia białek rdzenia wirusa, przedstawiono tutaj.
Koraliki użyte do testu wychwytywania zostały pokryte trzema różnymi bNAB skierowanymi przeciwko epitopom neutralizacyjnym glikoprotein otoczki i przeciwciałom izotypowym służącym jako kontrole negatywne. Używając kulek pokrytych przeciwciałami izotopowymi, nie wykryto żadnych białek Gag w próbkach VLP zawierających łyse VLP, to znaczy Env-ujemne VLP lub VLP wyświetlające Env, co pokazuje, że niespecyficzne wiązanie VLP z kulkami pokrytymi ludzkimi przeciwciałami nie pośredniczyło w wychwytywaniu VLP. Łyse VLP nie były również związane przez kulki pokryte bNAB, w związku z czym w analizie Western blot nie wykryto żadnych białek Gag.
W przeciwieństwie do tego, wszystkie trzy bNAB wychwyciły VLP wykazujące białka Env, dlatego białka Gag były łatwo wykrywane, wykazując obecność epitopów neutralizacji w glikoproteinach Env wyświetlanych na VLP. Kluczowe dla powodzenia testu: dokładne wymieszanie VLP z kulkami pokrytymi przeciwciałami. Najlepiej osiągnąć to przy użyciu objętości większych niż 500 mikrolitrów pod obrotem.
Alternatywnie, przechwycone VLP mogą być eluowane w warunkach nieredukcyjnych. Umożliwia to analizę VLP za pomocą mikroskopii immunoelektronowej lub badanie wyświetlanych antygenów za pomocą natywnego PAGE.
Przegląd
W tym artykule przedstawiono protokół wykrywania epitopów neutralizujących na cząstkach przypominających wirusy (VLPs) przy użyciu testu wychwytującego. Metoda wykorzystuje szeroko neutralizujące przeciwciała (bNABs) do oceny ekspozycji tych epitopów, co ma kluczowe znaczenie dla oceny kandydatów na szczepionki.
Kluczowe elementy badania
Dział Area of Science
- Immunologia
- Opracowywanie szczepionek
- Wiroλογία
Background
- Cząstki przypominające wirusy (VLPs) są ważne w opracowywaniu szczepionek.
- Epitopy neutralizujące są krytyczne dla wywoływania odpowiedzi immunologicznej.
- Szeroko neutralizujące przeciwciała mogą być wykorzystane do wykrywania tych epitopów.
- Ocena jakości VLPs jest niezbędna dla skutecznych kandydatów na szczepionki.
Cel badania
- Opracowanie czułego testu do wykrywania epitopów neutralizujących na VLPs.
- Wykażanie znaczenia tych epitopów w skuteczności szczepionek.
- Dostarczenie szczegółowego protokołu dla badaczy w tej dziedzinie.
Wykorzystane metody
- Immunoprecypitacja pochodnych HIV VLPs za pomocą bNABs.
- Użycie magnetycznych kulek sprzężonych z białkiem G do wychwytywania VLP.
- Analiza SDS-PAGE i Western blot w celu wykrywania wirusowych białek rdzeniowych.
- Dokładne mieszanie VLPs z kulkami pokrytymi przeciwciałami w celu skutecznego wychwytywania.
Główne wyniki
- VLPs wyświetlające białka Env zostały pomyślnie wychwytywane za pomocą bNABs.
- Białka Gag nie zostały wykryte w VLPs o ujemnych białkach Env, co potwierdza specyficzność.
- Wszystkie trzy bNABs wykazały skuteczne wiązanie z VLPs wrażliwymi na neutralizację.
- Sukces testu zależy od prawidłowego mieszania i warunków inkubacji.
Wnioski
- Test zapewnia niezawodną metodę oceny jakości VLP.
- Epitopy neutralizujące są niezbędne do wywoływania odpowiedzi immunologicznej.
- Ten protokół może pomóc w opracowywaniu skutecznych szczepionek.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
The VLP capture assay provides a sensitive method to evaluate vaccine candidate quality by confirming the presence of neutralization-sensitive epitopes on antigen-displaying virus-like particles. This enables early prediction of neutralizing B-cell response potential, supporting go/no-go decisions in vaccine development pipelines. The assay reduces biological risk by validating structural integrity of envelope glycoproteins prior to costly preclinical and clinical advancement.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Confirms exposure of neutralization-sensitive epitopes on VLP surfaces, enabling therapeutic hypothesis interrogation of vaccine immunogenicity.
- Operational Value: Uses broadly neutralizing antibodies as functional probes to de-risk target validation through epitope-specific binding evidence.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Enables preparation of antigen-displaying VLPs for downstream immunoassays by isolating particles with preserved structural integrity.
- Operational Value: Delivers quantitative detection of viral core proteins (e.g., Gag) via Western blot, supporting assay standardization and reproducibility.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Demonstrates continuity from VLP production to immune relevance by linking epitope exposure to predicted neutralizing antibody responses in humans.
- Operational Value: Supports risk-adjusted advancement decisions by identifying VLPs capable of eliciting protective immunity before animal challenge studies.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery-to-preclinical continuum, positioning post-production VLP characterization before immunogenicity testing to inform lead candidate selection.
- Discovery Biology: Validates that VLPs display cognate antigens in native conformation, supporting biological de-risking of vaccine constructs.
- Screening: Confirms assay readiness through specific capture of Env-positive VLPs and absence of signal in Env-negative controls.
- Analytics: Generates Western blot readouts of Gag proteins as a quantitative proxy for captured VLP yield and integrity.
- Translational Research: Connects biophysical VLP quality to immunological predictive value by confirming exposure of neutralization-sensitive epitopes.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable QC platform for VLP-based vaccine candidates across multiple antigen targets and serotypes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in vaccine efficacy through direct assessment of neutralizing epitope exposure.
- Operational Value: Standardized capture and wash steps using magnetic beads ensure reproducibility across laboratories and production batches.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions by filtering VLPs lacking functional epitopes, reducing late-stage biological failure risk.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of VLP candidates based on structural and functional quality metrics.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunoprecipitation, antibody handling, and magnetic bead-based separation techniques.
- Depends on access to protein A/G-conjugated magnetic beads, broadly neutralizing antibodies, and Western blot instrumentation.
- Necessitates standardization of bead-VLP mixing volumes (>500 µL) and rotation conditions to ensure efficient capture.
- Involves adaptation considerations for non-HIV VLPs, including antibody selection and buffer optimization for different antigen targets.
- Includes practical limitations such as the need for high-titer bNAbs and potential steric hindrance in densely packed VLP arrays.
