Wykrywanie epitopów wrażliwych na neutralizację w antygenach wyświetlanych na szczepionkach opartych na cząsteczkach wirusopodobnych (VLP) za pomocą testu wychwytywania

Tutaj prezentujemy protokół wykrywania epitopów neutralizacji na cząsteczkach wirusopodobnych wyświetlających antygen (VLP). Immunoprecypitację VLP pochodzących z ludzkiego wirusa niedoboru odporności (HIV) przeprowadza się przy użyciu przeciwciał monoklonalnych specyficznych dla glikoprotein otoczkowych sprzężonych z kulkami magnetycznymi sprzężonymi z białkiem G. Przechwycone VLP są następnie poddawane analizie SDS-PAGE i Western blot przy użyciu przeciwciał specyficznych dla białka rdzenia wirusa Gag.

W moim laboratorium opracowujemy systemy produkcji wektorów wirusowych i szczepionek opartych na cząsteczkach wirusopodobnych lub VLP. Test wychwytywania VLP pozwala na bardzo czułe wykrywanie docelowych antygenów wyświetlanych na VLP. W tym teście używamy szeroko neutralizujących przeciwciał skierowanych przeciwko epitopom neutralizującym, aby udowodnić ekspozycję tych epitopów na powierzchnię VLP.

Jest to ważna ocena jakości dla kandydatów na szczepionki, ponieważ tylko VLP wykazujące epitopy wrażliwe na neutralizację będą w stanie wywołać neutralizującą odpowiedź przeciwciał u zaszczepionych. Zacznij od zawieszenia kulek magnetycznych, pipetując w górę i w dół lub mieszając na rotatorze z prędkością 50 obr./min przez co najmniej pięć minut. W międzyczasie przygotuj roztwór przeciwciał zawierający bNAB.

Użyj 10 mikrogramów każdego bNAB w 200 mikrolitrach buforu wiążącego przeciwciała i przemłukiwającego na reakcję. Dla każdej reakcji przenieś 50 mikrolitrów roztworu kulek magnetycznych do 1,5-mililitrowej probówki reakcyjnej, a następnie umieść probówki na stojaku do separacji magnetycznej. Poczekaj, aż kulki zgromadzą się na kulce probówki, aby upewnić się, że wszystkie kulki zostały zebrane, a następnie usuń supernatant.

Wyjmij magnes i zawieś koraliki w 200 mikrolitrach wcześniej przygotowanego roztworu bNAB. Inkubować przez 30 minut do trzech godzin, mieszając na rotatorze z prędkością 50 obr./min w temperaturze pokojowej. Po inkubacji umieścić probówki reakcyjne w stojaku do separacji magnetycznej, odczekać i usunąć supernatant.

Wyjmij probówki z magnesu i umyj kulki, ponownie zawieszając w 200 mikrolitrach buforu wiążącego przeciwciała i myjącego. Powtórzyć płukanie z wiązaniem przeciwciał i buforem myjącym, usuwając jak najwięcej buforu myjącego po zakończeniu. Dodaj próbki do bNAB związanych z koralikami.

Jeśli objętość dodanej próbki jest mniejsza niż jeden mililitr, dodaj PBS, aby dostosować objętość próbki do jednego mililitra, a następnie ponownie zawiesić kulki, delikatnie pipetując. Inkubować próbki i kulki przez 2,5 godziny na rotatorze w temperaturze pokojowej, upewniając się, że kulki pozostają w zawiesinie, a roztwór jest dokładnie wymieszany podczas inkubacji. Umieść rurki na magnesie i usuń supernatant, a następnie umyj kulki magnetyczne, zawieszając je w 200 mikrolitrach bufora myjącego.

Zawiesić kulki w 100 mikrolitrach buforu płuczącego i przenieść zawiesinę do czystej, żaroodpornej rurki reakcyjnej. Umieść probówkę na stojaku do separacji magnetycznej i całkowicie usuń supernatant. Aby przygotować denaturowane próbki STS-PAGE, zawiesić kulki w 20 do 80 mikrolitrach buforu Laemmli i inkubować w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez pięć minut.

Postępuj bezpośrednio z SDS-PAGE, umieszczając probówki na stojaku magnetycznym, aby oddzielić kulki od roztworu. Alternatywnie należy przechowywać próbki w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Reprezentatywny wynik VLP po raz pierwszy wychwyconych z supernatantu do hodowli komórkowych i granulek VLP przy użyciu bNAB, a następnie poddanych analizie Western blot w celu wykrycia białek rdzenia wirusa, przedstawiono tutaj.

Koraliki użyte do testu wychwytywania zostały pokryte trzema różnymi bNAB skierowanymi przeciwko epitopom neutralizacyjnym glikoprotein otoczki i przeciwciałom izotypowym służącym jako kontrole negatywne. Używając kulek pokrytych przeciwciałami izotopowymi, nie wykryto żadnych białek Gag w próbkach VLP zawierających łyse VLP, to znaczy Env-ujemne VLP lub VLP wyświetlające Env, co pokazuje, że niespecyficzne wiązanie VLP z kulkami pokrytymi ludzkimi przeciwciałami nie pośredniczyło w wychwytywaniu VLP. Łyse VLP nie były również związane przez kulki pokryte bNAB, w związku z czym w analizie Western blot nie wykryto żadnych białek Gag.

W przeciwieństwie do tego, wszystkie trzy bNAB wychwyciły VLP wykazujące białka Env, dlatego białka Gag były łatwo wykrywane, wykazując obecność epitopów neutralizacji w glikoproteinach Env wyświetlanych na VLP. Kluczowe dla powodzenia testu: dokładne wymieszanie VLP z kulkami pokrytymi przeciwciałami. Najlepiej osiągnąć to przy użyciu objętości większych niż 500 mikrolitrów pod obrotem.

Alternatywnie, przechwycone VLP mogą być eluowane w warunkach nieredukcyjnych. Umożliwia to analizę VLP za pomocą mikroskopii immunoelektronowej lub badanie wyświetlanych antygenów za pomocą natywnego PAGE.