Wykrywanie epitopów wrażliwych na neutralizację w antygenach wyświetlanych na szczepionkach opartych na cząsteczkach wirusopodobnych (VLP) za pomocą testu wychwytywania
10 lutego 2022
Tutaj prezentujemy protokół wykrywania epitopów neutralizacji na cząsteczkach wirusopodobnych wyświetlających antygen (VLP). Immunoprecypitację VLP pochodzących z ludzkiego wirusa niedoboru odporności (HIV) przeprowadza się przy użyciu przeciwciał monoklonalnych specyficznych dla glikoprotein otoczkowych sprzężonych z kulkami magnetycznymi sprzężonymi z białkiem G. Przechwycone VLP są następnie poddawane analizie SDS-PAGE i Western blot przy użyciu przeciwciał specyficznych dla białka rdzenia wirusa Gag.
W moim laboratorium opracowujemy systemy produkcji wektorów wirusowych i szczepionek opartych na cząsteczkach wirusopodobnych lub VLP. Test wychwytywania VLP pozwala na bardzo czułe wykrywanie docelowych antygenów wyświetlanych na VLP. W tym teście używamy szeroko neutralizujących przeciwciał skierowanych przeciwko epitopom neutralizującym, aby udowodnić ekspozycję tych epitopów na powierzchnię VLP.
Jest to ważna ocena jakości dla kandydatów na szczepionki, ponieważ tylko VLP wykazujące epitopy wrażliwe na neutralizację będą w stanie wywołać neutralizującą odpowiedź przeciwciał u zaszczepionych. Zacznij od zawieszenia kulek magnetycznych, pipetując w górę i w dół lub mieszając na rotatorze z prędkością 50 obr./min przez co najmniej pięć minut. W międzyczasie przygotuj roztwór przeciwciał zawierający bNAB.
Użyj 10 mikrogramów każdego bNAB w 200 mikrolitrach buforu wiążącego przeciwciała i przemłukiwającego na reakcję. Dla każdej reakcji przenieś 50 mikrolitrów roztworu kulek magnetycznych do 1,5-mililitrowej probówki reakcyjnej, a następnie umieść probówki na stojaku do separacji magnetycznej. Poczekaj, aż kulki zgromadzą się na kulce probówki, aby upewnić się, że wszystkie kulki zostały zebrane, a następnie usuń supernatant.
Wyjmij magnes i zawieś koraliki w 200 mikrolitrach wcześniej przygotowanego roztworu bNAB. Inkubować przez 30 minut do trzech godzin, mieszając na rotatorze z prędkością 50 obr./min w temperaturze pokojowej. Po inkubacji umieścić probówki reakcyjne w stojaku do separacji magnetycznej, odczekać i usunąć supernatant.
Wyjmij probówki z magnesu i umyj kulki, ponownie zawieszając w 200 mikrolitrach buforu wiążącego przeciwciała i myjącego. Powtórzyć płukanie z wiązaniem przeciwciał i buforem myjącym, usuwając jak najwięcej buforu myjącego po zakończeniu. Dodaj próbki do bNAB związanych z koralikami.
Jeśli objętość dodanej próbki jest mniejsza niż jeden mililitr, dodaj PBS, aby dostosować objętość próbki do jednego mililitra, a następnie ponownie zawiesić kulki, delikatnie pipetując. Inkubować próbki i kulki przez 2,5 godziny na rotatorze w temperaturze pokojowej, upewniając się, że kulki pozostają w zawiesinie, a roztwór jest dokładnie wymieszany podczas inkubacji. Umieść rurki na magnesie i usuń supernatant, a następnie umyj kulki magnetyczne, zawieszając je w 200 mikrolitrach bufora myjącego.
Zawiesić kulki w 100 mikrolitrach buforu płuczącego i przenieść zawiesinę do czystej, żaroodpornej rurki reakcyjnej. Umieść probówkę na stojaku do separacji magnetycznej i całkowicie usuń supernatant. Aby przygotować denaturowane próbki STS-PAGE, zawiesić kulki w 20 do 80 mikrolitrach buforu Laemmli i inkubować w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez pięć minut.
Postępuj bezpośrednio z SDS-PAGE, umieszczając probówki na stojaku magnetycznym, aby oddzielić kulki od roztworu. Alternatywnie należy przechowywać próbki w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Reprezentatywny wynik VLP po raz pierwszy wychwyconych z supernatantu do hodowli komórkowych i granulek VLP przy użyciu bNAB, a następnie poddanych analizie Western blot w celu wykrycia białek rdzenia wirusa, przedstawiono tutaj.
Koraliki użyte do testu wychwytywania zostały pokryte trzema różnymi bNAB skierowanymi przeciwko epitopom neutralizacyjnym glikoprotein otoczki i przeciwciałom izotypowym służącym jako kontrole negatywne. Używając kulek pokrytych przeciwciałami izotopowymi, nie wykryto żadnych białek Gag w próbkach VLP zawierających łyse VLP, to znaczy Env-ujemne VLP lub VLP wyświetlające Env, co pokazuje, że niespecyficzne wiązanie VLP z kulkami pokrytymi ludzkimi przeciwciałami nie pośredniczyło w wychwytywaniu VLP. Łyse VLP nie były również związane przez kulki pokryte bNAB, w związku z czym w analizie Western blot nie wykryto żadnych białek Gag.
W przeciwieństwie do tego, wszystkie trzy bNAB wychwyciły VLP wykazujące białka Env, dlatego białka Gag były łatwo wykrywane, wykazując obecność epitopów neutralizacji w glikoproteinach Env wyświetlanych na VLP. Kluczowe dla powodzenia testu: dokładne wymieszanie VLP z kulkami pokrytymi przeciwciałami. Najlepiej osiągnąć to przy użyciu objętości większych niż 500 mikrolitrów pod obrotem.
Alternatywnie, przechwycone VLP mogą być eluowane w warunkach nieredukcyjnych. Umożliwia to analizę VLP za pomocą mikroskopii immunoelektronowej lub badanie wyświetlanych antygenów za pomocą natywnego PAGE.
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokół wykrywania epitopów neutralizacji na cząsteczkach przypominających wirusy (VLP) z wykorzystaniem testu wychwytu. Metoda ta wykorzystuje szeroko neutralizujące przeciwciała (bNABs) do oceny ekspozycji tych epitopów, co jest kluczowe dla oceny kandydatów na szczepionki.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Immunologia
- Opracowywanie szczepionek
- Wirusologia
Wstęp
- Cząsteczki przypominające wirusy (VLP) są istotne w opracowywaniu szczepionek.
- Epitopy neutralizujące mają krytyczne znaczenie dla wywołania odpowiedzi immunologicznej.
- Przeciwciała o szerokim spektrum neutralizującym mogą być wykorzystane do wykrywania tych epitopów.
- Ocena jakości VLP jest niezbędna w przypadku skutecznych kandydatów na szczepionki.
Cel badania
- Opracowanie czułego testu do wykrywania epitopów neutralizacji na VLP.
- Wykazanie znaczenia tych epitopów dla skuteczności szczepionki.
- Przedstawienie szczegółowego protokołu dla badaczy z tej dziedziny.
Zastosowane metody
- Immunoprecypitacja VLP pochodzących z HIV przy użyciu bNABs.
- Zastosowanie magnetycznych kulek sprzężonych z białkiem G do wychwytu VLP.
- Analiza SDS-PAGE i Western blot w celu wykrycia białek rdzenia wirusa.
- Dokładne mieszanie VLP z kulekami powlekanymi przeciwciałami dla efektywnego wychwytu.
Główne wyniki
- VLP eksponujące białka Env zostały skutecznie wychwycone przy użyciu bNAB.
- W VLP negatywnych pod kątem Env nie wykryto białek Gag, co potwierdza specyficzność metody.
- Wszystkie trzy bNAB wykazały skuteczne wiązanie z VLP wrażliwymi na neutralizację.
- Powodzenie analizy zależy od prawidłowego wymieszania i warunków inkubacji.
Wnioski
- Analiza ta zapewnia niezawodną metodę oceny jakości VLP.
- Epitopy neutralizujące są niezbędne do wywołania odpowiedzi immunologicznej.
- Niniejszy protokół może pomóc w opracowaniu skutecznych szczepionek.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Analiza przechwytywania VLP stanowi czułą metodę oceny jakości kandydatów na szczepionki poprzez potwierdzenie obecności epitopów wrażliwych na neutralizację na wirusopodobnych cząsteczkach prezentujących antygen. Umożliwia to wczesne przewidywanie potencjału odpowiedzi neutralizującej limfocytów B, wspierając decyzje o kontynuacji lub przerwaniu prac w procesach opracowywania szczepionek. Analiza ta zmniejsza ryzyko biologiczne poprzez walidację integralności strukturalnej glikoprotein otoczki przed kosztownym przejściem do fazy badań przedklinicznych i klinicznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Potwierdza ekspozycję epitopów wrażliwych na neutralizację na powierzchniach VLP, umożliwiając weryfikację hipotez terapeutycznych dotyczących immunogenności szczepionek.
- Wartość operacyjna: Wykorzystuje szeroko neutralizujące przeciwciała jako sondy funkcjonalne w celu zmniejszenia ryzyka podczas walidacji celu poprzez dostarczenie dowodów na wiązanie specyficzne dla epitopu.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Umożliwia przygotowanie VLP prezentujących antygen do dalszych analiz immunoologicznych poprzez izolację cząsteczek z zachowaną integralnością strukturalną.
- Wartość operacyjna: Zapewnia ilościowe wykrywanie białek rdzenia wirusa (np. Gag) za pomocą techniki Western blot, co wspiera standaryzację i powtarzalność analizy.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Wykazuje ciągłość od produkcji VLP do istotności immunologicznej poprzez powiązanie ekspozycji epitopów z przewidywanymi odpowiedziami przeciwciał neutralizujących u ludzi.
- Wartość operacyjna: Wspiera decyzje o dalszym rozwoju skorygowane o ryzyko poprzez identyfikację VLP zdolnych do wywołania odporności ochronnej przed badaniami z użyciem zwierząt w modelu zakaźnym.
Integracja potoków i przepływów pracy
Analiza ta wpisuje się w kontinuum od etapu odkrywania do badań przedklinicznych, pozycjonując charakterystykę VLP po produkcji przed testami immunogenności, aby dostarczyć informacji niezbędnych do wyboru głównego kandydata.
- Biologia odkrywcza: Potwierdza, że VLP eksponują pokrewne antygeny w natywnej konformacji, co wspiera biologiczne ograniczanie ryzyka w konstrukcjach szczepionek.
- Przesiewanie: Potwierdza gotowość analizy poprzez specyficzne wychwytywanie VLP Env-dodatnich oraz brak sygnału w kontrolach Env-ujemnych.
- Analityka: Generuje odczyty Western blot dla białek Gag jako ilościowy wskaźnik wydajności i integralności wychwyconych VLP.
- Badania translacyjne: Łączy biofizyczną jakość VLP z immunologiczną wartością prognostyczną poprzez potwierdzenie ekspozycji epitopów wrażliwych na neutralizację.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia wielokrotnego użytku platformę kontroli jakości dla kandydatów na szczepionki oparte na VLP dla wielu celów antygenowych i serotypów.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Możliwość przewidywania skuteczności szczepionki poprzez bezpośrednią ocenę ekspozycji epitopów neutralizujących.
- Wartość operacyjna: Standaryzowane etapy wychwytywania i płukania z użyciem kulek magnetycznych zapewniają powtarzalność między laboratoriami i partiami produkcyjnymi.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie lepszych decyzji o kontynuacji lub przerwaniu prac (go/no-go) poprzez odfiltrowywanie VLP pozbawionych funkcjonalnych epitopów, co zmniejsza ryzyko niepowodzenia biologicznego na późnych etapach.
- Wpływ na portfolio: Ułatwia priorytetyzację kandydatów na VLP z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o wskaźniki jakości strukturalnej i funkcjonalnej.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie immunoprecypitacji, pracy z przeciwciałami oraz technik separacji z użyciem kulek magnetycznych.
- Zależny od dostępu do kulek magnetycznych sprzężonych z białkiem A/G, szeroko neutralizujących przeciwciał oraz aparatury do Western blot.
- Wymaga standaryzacji objętości mieszania kulek z VLP (>500 µL) oraz warunków rotacji w celu zapewnienia wydajnego wychwytu.
- Wymaga uwzględnienia modyfikacji dla VLP innych niż HIV, w tym wyboru przeciwciał i optymalizacji buforów dla różnych celów antygenowych.
- Obejmuje ograniczenia praktyczne, takie jak konieczność zastosowania bNAbs o wysokim mianie oraz potencjalne przeszkody steryczne w gęsto upakowanych macierzach VLP.
