Test immunoenzymatyczny (ELISPOT): Kwantyfikacja odpowiedzi immunologicznej komórek Th-1 przeciwko antygenom drobnoustrojów

Ogólnym celem tej procedury jest wykrycie odpowiedzi limfocytów T na interesujące nas antygeny. Osiąga się to poprzez pierwsze kodowanie przeciwciałami wychwytującymi. Drugim krokiem procedury jest dodanie komórek i antygenów będących przedmiotem zainteresowania, a następnie inkubacja przez noc.

Trzecim krokiem procedury jest dodanie przeciwciał wykrywających. Ostatnim etapem zabiegu jest opracowanie płytki za pomocą odczynników substratowych i analiza plam. Ostatecznie można uzyskać wyniki, które wybrały interesujące nas cytokiny poprzez analizę jednostek tworzących plamki.

Cześć, nazywam się Dr.Ki Richter i jestem instruktorem badawczym w laboratorium dr Wondera Drake'a na Uniwersytecie Vanderbilt na wydziale chorób zakaźnych. Dzisiaj demonstrujemy technikę Ellie Spot, znaną również jako test immunologiczny sprzężony z enzymem. Dr. Isfahan Chambers i Tiffany Cone zademonstrują dziś tę technikę.

W celu utrzymania standardów hodowli komórkowych należy wykonywać manipulacje w sterylnych warunkach w kapturze, otworzyć sprzymierzeńczą płytkę punktową i trzykrotnie przemyć PBS. Przygotować roztwór powlekający przeciwciała wychwytującego w PBS. Dobrze wymieszaj, wirując dla wygody.

Przenieść roztwór przeciwciała do zbiornika dla wielokanałowego, pipetera i podwielokrotności 100 mikrolitrów roztworu powlekającego do każdego. Dobrze uszczelnij płytkę perfilem i wstaw na noc do lodówki. Te płytki pokryte przeciwciałami są dobre przez tygodnie.

Ogólna zasada mówi, że można użyć talerza, jeśli w studzienkach nadal pozostaje płyn. Aby przygotować komórki do tego testu, wybarwić świeżo izolowane komórki jednojądrzaste krwi obwodowej kolorem trien blue w celu zapewnienia żywotności i policzyć je: Płytkę pbmc z 2 milionami komórek na mililitr w naszych 10 pożywkach i inkubuj przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Aby śledzić przebieg eksperymentu, oznacz pokrywę płytki punktowej Ali numerem identyfikacyjnym próbki, warunkami studzienki i datą.

Umyć płytkę sześciokrotnie sterylnym PBS metodą dump and blot. Uważaj, aby nie rozprysnąć talerza podczas zrzucania, ponieważ może to spowodować, że dołki talerza zmienią kolor na fioletowy. Dodaj nasze 20 pożywek do każdej studzienki i inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę.

Podczas inkubacji płytki policz komórki, które odpoczywały przez noc. Zebrać pbmc przez odwirowanie. Zdekantować supernatant i ponownie zawiesić osad w naszych 10 podłożach o stężeniu 1 miliona komórek na mililitr.

Po godzinnej inkubacji płytki plamki sprzymierzeńca, usunąć pożywkę R 20 metodą dump and blot. Uważaj, aby nie zachlapać talerza podczas zrzucania. Dodaj 100 mikrolitrów zawiesiny komórek do każdego.

Dobrze postępuj zgodnie z projektem eksperymentalnym z dodaniem peptydów i antygenów do odpowiednich studzienek testowych. Zawsze uwzględniaj negatywną kontrolę komórek bez peptydów, a także studzienki kontroli pozytywnej z dodatkiem fitohemaglutyniny. Inkubuj płytkę przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla.

Umyj płytkę sześć razy 150 mikrolitrami jednego XPBS metodą dump and blot. Dodaj 100 mikrolitrów PBS do każdego dołka płytki i umieść płytkę w lodówce lub w temperaturze pokojowej na 15 minut. W międzyczasie przygotuj roztwór przeciwciała biotyny w PBS.

Wyjmij płytkę punktową ALI z lodówki i wyrzuć PBS, wrzucając ją do kosza na śmieci. Należy uważać, aby nie rozprysnąć płytki podczas wrzucania podwielokrotnej porcji roztworu przeciwciała biotyny do każdej studzienki i inkubować płytkę w kapturze do hodowli tkankowych w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę. Umyj płytkę sześć razy PBS metodą dump and blot przy ostatnim myciu.

Zostaw teraz PBS na talerzu. Przygotować roztwór przeciwciała STREPTAWIDYNY w PBS, upewniając się, że roztwór miesza się z wirem. Dobrze wyrzuć ostatnie płukanie PBS ze studzienek i nanieś płytkę punktową ALI.

Dodać roztwór przeciwciała streptawidyny do każdej studzienki i inkubować płytkę w kapturze do hodowli tkankowych w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę. W celu usunięcia nadmiaru przeciwciała trevainy, należy przemyć płytkę sześciokrotnie PBS metodą dump and blot przy ostatnim płukaniu, poprowadzić PBS na płytkę. Biorąc pod uwagę wrażliwość na światło roztworu substratu fosfatazy alkalicznej B-C-I-P-M-B-T.

Pracuj w ciemności podczas przygotowywania roztworu łodygi zgodnie z opisem producentów w instrukcji zestawu substratu fosfatazy alkalicznej, wyrzuć pozostały PBS z dołków i osusz płytkę punktową. Dodaj roztwór substratu do każdej studzienki i włącz światło. Po pięciu do 10 minutach rozwoju koloru pozwól odczynnikom pozostać na płytce, aż plamy zaczną zmieniać kolor na fioletowy i staną się dość ciemne.

Trwa to do 20 minut. Umyj płytkę punktową Ali trzykrotnie wodą z kranu i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu. Każda płytka zawiera kontrolę dodatnią, kontrolę ujemną i peptyd będący przedmiotem zainteresowania przeprowadzony co najmniej w dwóch egzemplarzach.

Studzienki kontroli pozytywnej mają ciemnofioletowy kolor, który odbija zlewającą się warstwę komórek i prawie nie ma białego tła. Studzienki kontroli negatywnej nie mają fioletowego tła ani plam, zgodnie z oczekiwaniami. Studzienki na próbki testowe ilustrują tutaj odpowiedzi komórkowe na peptydy drobnoustrojów.

Fioletowe plamki reprezentują pojedynczą reagującą komórkę wyrażającą cytokinę będącą przedmiotem zainteresowania podczas przeprowadzania techniki plamki LA. Należy uważać, aby nie przebić membrany końcówkami pipet ani nie dopuścić do wyschnięcia płytki, ponieważ doprowadzi to do powstania wysokiego tła.