Test immunospot z enzymatycznym sprzężeniem (ELISPOT): Ilościowe oznaczenie komórkowych odpowiedzi immunologicznych Th-1 przeciwko antygenom mikrobiologicznym

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wykrycie odpowiedzi limfocytów T na interesujące badacza antygeny. Jest to realizowane poprzez wstępne kodowanie przeciwciałami wychwytującymi. Drugim krokiem procedury jest dodanie komórek oraz interesujących badacza antygenów, a następnie inkubacja przez noc.

Trzecim krokiem procedury jest dodanie przeciwciał detekcyjnych. Ostatnim etapem procedury jest wywołanie płytki za pomocą odczynników substratowych i analiza plamek. W rezultacie, poprzez analizę jednostek tworzących plamki, można uzyskać wyniki dla wybranych cytokin.

Witajcie, nazywam się dr Ki Richter i jestem instruktorem badawczym w laboratorium dr Wonder Drake'a na Uniwersytecie Vanderbilt w dziale chorób zakaźnych. Dzisiaj zaprezentujemy technikę ELISpot, znaną również jako test immunospotowy z użyciem sprzężonych enzymów. Technikę tę zaprezentują Państwu dr Isfahan Chambers oraz Tiffany Cone.

Aby zachować standardy hodowli komórkowych, należy przeprowadzać manipulacje w warunkach sterylnych w komorze laminarnej; otworzyć płytkę do analizy typu ally spot i trzykrotnie przemyć ją PBS. Przygotować roztwór powlekający z przeciwciałem wychwytującym w PBS. W celu ułatwienia wymieszać dokładnie za pomocą wortexa.

Przenieś roztwór przeciwciał do zbiornika dla pipety wielokanałowej i nanieś 100 µL roztworu powlekającego do każdej dołki. Szczelnie zamknij płytkę folią i przechowuj w lodówce przez noc. Tak przygotowane płytki powlekane przeciwciałami można przechowywać przez wiele tygodni.

Zgodnie z ogólną zasadą płytkę można wykorzystać, jeśli w dołkach wciąż znajduje się ciecz. Aby przygotować komórki do tego testu, świeżo wyizolowane mononuklearne komórki krwi obwodowej należy zabarwić błękitnemcollisions trien w celu oceny żywotności, a następnie je zliczyć. Wysiać PBMC w zagęszczeniu 2 milionów komórek na mililitr w podłożu 10 i inkubować przez noc w temperaturze 37°C w atmosferze 5% carbon dioxide. W celu monitorowania przebiegu eksperymentu, należy oznaczyć pokrywkę płytki Ali spot numerem identyfikacyjnym próbki, warunkami w dołkach oraz datą.

Umyj płytkę sześciokrotnie sterylnym PBS, stosując metodę odlewania i osuszania. Należy uważać, aby nie rozpryskiwać cieczy podczas odlewania, ponieważ może to spowodować zabarwienie studzienek płytki na kolor fioletowy. Dodaj 20 µL pożywki do każdej studzienki i inkubuj płytkę w temperaturze 37 °C przez jedną godzinę.

Podczas inkubacji płytki należy policzyć komórki, które odpoczywały przez noc. Zebrać PBMC poprzez wirowanie. Odlać naddestylat i resuspender osad w 10 ml medium, aby uzyskać stężenie 1 milion komórek na mililitr.

Po jednogodzinnej inkubacji płytki z naniesionymi kropelkami, usuń pożywkę R 20 metodą odlania i osuszenia. Należy uważać, aby nie rozbryzgać zawartości płytki podczas odlewania. Do każdej kropelki dodaj 100 µL zawiesiny komórek.

Należy postępować zgodnie z planem doświadczalnym, dodając peptydy i antygeny do odpowiednich studzienek testowych. Zawsze należy uwzględnić negatywną kontrolę z komórkami bez peptydów, a także studzienki kontroli pozytywnej z dodatkiem fitohemaglutyniny. Inkubować płytkę przez noc w temperaturze 37 °C przy 5% carbon dioxide.

Umyj płytkę sześciokrotnie, używając 150 µL 1x PBS, stosując metodę opróżniania i osuszania (dump and blot). Dodaj 100 µL PBS do każdej studni płytki i pozostaw płytkę w lodówce lub w temperaturze pokojowej na 15 minut. W tym czasie przygotuj roztwór przeciwciała biotynilowanego w PBS.

Wyjmij płytkę spot ALI z lodówki i wylej PBS, energicznie potrząsając płytką nad koszem na odpady. Uważaj, aby nie rozbryzgać zawartości podczas dodawania odpowiedniej ilości roztworu przeciwciał z biotyną do każdego dołka, a następnie inkubuj płytkę w komorze do hodowli tkanek w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę. Przemyj płytkę sześciokrotnie PBS, stosując metodę wylewania i osuszania (dump and blot) podczas ostatniego przemywania.

Pozostaw teraz PBS na płytce. Przygotuj roztwór przeciwciał STREPTAVIDIN w PBS, pamiętając o wymieszaniu roztworu w wstrząsarzu Vortex. Odlej ostatnią porcję PBS z dołków i przygotuj płytkę do nakładania próbek ALI.

Do każdego dołka należy dodać roztwór przeciwciał streptawidyny i inkubować płytkę w komorze do hodowli tkanek w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę. Aby usunąć nadmiar przeciwciał streptawidyny, płytkę należy przemyć sześciokrotnie PBS, stosując metodę odlewania i osuszania; przy ostatnim płukaniu należy pozostawić PBS na płytce. Należy pamiętać o światłoczułości roztworu substratu fosfatazy alkalicznej B-C-I-P-M-B-T.

Przygotowując roztwór barwiący zgodnie z instrukcjami producenta dołączonymi do zestawu substratów fosfatazy alkalicznej, należy pracować w ciemności. Odpić pozostały PBS z dołków i osuszyć płytkę do analizy plam. Dodać roztwór substratu do każdego dołka i zapalić światło. Po 5 do 10 minutach wywoływania koloru pozostawić odczynniki na płytce do momentu, aż plamy zaczną zmieniać barwę na fioletową i staną się wyraźnie ciemne.

Proces ten trwa do 20 minut. Płytkę Ali spot plate należy przemyć trzykrotnie wodą z kranu i pozostawić do wyschnięcia. Każda płytka zawiera kontrolę pozytywną, kontrolę negatywną oraz analizowany peptyd, przy czym wszystkie pomiary wykonuje się co najmniej w duplikacie.

Dołki kontroli dodatniej mają głęboki fioletowy kolor, co odzwierciedla obecność konfluencyjnej warstwy komórek i niemal całkowity brak białego tła. Dołki kontroli ujemnej nie wykazują fioletowego tła ani plamek, zgodnie z oczekiwaniami. Dołki z próbkami testowymi ilustrują tutaj reakcje komórkowe na peptydy mikrobiologiczne.

Fioletowe punkty reprezentują pojedynczą komórkę respondentną wykazującą ekspresję badanej cytokiny podczas stosowania techniki LA spot. Należy uważać, aby nie przebić membrany końcówkami pipet oraz nie dopuścić do wyschnięcia płytki, ponieważ spowoduje to wysokie tło.