Name: Test immunoenzymatyczny (ELISPOT): Kwantyfikacja odpowiedzi immunologicznej komórek Th-1 przeciwko antygenom drobnoustrojów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-23T17:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 13 s
Description: Poznaj test ELISPOT do kwantyfikacji odpowiedzi komórek Th-1 przeciwko antygenom drobnoustrojów. Ta metoda pozwala wykryć odpowiedzi limfocytów T i zidentyfikować cele immunologiczne w chorobach idiopatycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wspierane częściowo przez grant Vanderbilt CTSA 1 UL1 RR024975 z National Center for Research Resources, National Institutes of Health. Praca ta była finansowana przez NIH R01 HL 83839; R01 AI 65744.

W poniższym protokole jako komórki docelowe wykorzystano mononuklearne komórki krwi obwodowej (PBMC). Protokół ten można jednak zastosować również w przypadku innych typów komórek. Analizę należy przeprowadzić w komorze z laminarnym przepływem powietrza, stosując technikę sterylną.
Dzień 1: Przygotowanie płytki i komórek
<ol>
 <li>Wyjąć płytkę ELISPOT i otworzyć ją w komorze z laminarnym przepływem powietrza.</li>
 <li>Przemyć płytkę 3 razy 150 μL 1X PBS, używając pipety wielokanałowej, jeśli jest dostępna; w przeciwnym razie dopuszczalne jest pipetowanie pojedynczych dołków.</li>
 <li>Wyjąć opakowanie zbiorników i otworzyć je w komorze z laminarnym przepływem powietrza.</li>
 <li>Dodać 2 μg/mL przeciwciała wychwytującego, anty-ludzkiego Interferonu-γ, do 11 mL 1X PBS. Dokładnie wymieszać na wirówce typu vortex. Przenieść mieszaninę przeciwciał do zbiornika.</li>
 <li>Nanieść 100 μL roztworu powlekającego do każdego dołka za pomocą pipety wielokanałowej.</li>
 <li>Owinąć płytkę parafilmem.</li>
 <li>Umieścić płytkę w lodówce na noc. Płytki zachowują trwałość przez kilka tygodni. Przyjmuje się, że jeśli w dołkach wciąż znajduje się ciecz, płytka nadaje się do użycia.</li>
</ol>
Przygotowanie komórek
Jeśli PBMC są świeże, należy policzyć komórki i inkubować je przez noc w temperaturze 37°C przy 5% CO2. W przypadku PBMC przechowywanych w ciekłym azocie konieczne jest rozmrożenie komórek. Protokół przebiega w następujący sposób:
<ol>
 <li>Rozmrozić krio probówkę z komórkami w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C, aż zostaną niemal całkowicie rozmrożone.</li>
 <li>Natychmiast resuspendować w 5 mL pożywki R10.</li>
 <li>Wirować przez 5 minut przy 225 x g.</li>
 <li>Ponownie resuspendować w 5 mL pożywki R10 i policzyć żywe komórki przy użyciu błękitu trypanu.</li>
 <li>Dostosować stężenie do 2 x 106 komórek/mL w pożywce R10.</li>
 <li>Inkubować przez noc w temperaturze 37°C w atmosferze 5% CO2.</li>
</ol>
Dzień 2: Przygotowanie płytki
<ol>
 <li>Oznacz pokrywkę płytki numerem identyfikacyjnym próbki, warunkami w dołkach oraz datą.</li>
 <li>Przemyj płytkę 6 razy 150 μL sterylnego 1x PBS, stosując metodę odlewania i osuszania (dump and blot). Należy uważać, aby nie rozpryskać zawartości podczas odlewania, ponieważ może to spowodować zabarwienie dołków płytki na fioletowo.</li>
 <li>Dodaj 100 μL medium R20 do każdego dołka.</li>
 <li>Inkubuj płytkę w temperaturze 37°C przez 1 godzinę.</li>
 <li>Podczas inkubacji płytki policz komórki, które odpoczywały przez noc.</li>
 <li>Wirować zawiesinę komórkową z prędkością 1500 rpm przez 5 minut. Odlej nadosad i resuspenduj osad tak, aby uzyskać końcowe stężenie 1X106 komórek na 1mL w medium R10.</li>
 <li>Po 1-godzinnej inkubacji usuń medium R20 metodą odlewania i osuszania. Należy uważać, aby nie rozpryskać zawartości podczas odlewania.</li>
 <li>Dodaj 100 μL roztworu komórek (105 komórek) do każdego dołka. Dodaj odpowiednie peptydy i/lub antygeny do odpowiadających im dołków w duplikacie. Używaj nowej końcówki do pipety za każdym razem, gdy pobierasz roztwór roboczy peptydu. Standardowe stężenie peptydów wynosi 10-40 μg/mL. Ze względu na zróżnicowanie peptydów, każdy badacz powinien miareczkować peptydy w celu uzyskania optymalnych wyników.</li>
 <li>W dołkach kontroli negatywnej dodaj tylko komórki (bez peptydów).</li>
 <li>W dołkach kontroli pozytywnej dodaj fitohemaglutyninę (PHA; 10 μg/mL; Sigma).</li>
 <li>Inkubuj przez noc w temperaturze 37°C z 5% CO2 (~18 godzin).</li>
</ol>
 Dzień 3: Wywoływanie płytki
<ol>
 <li> Płytkę należy przemyć 6 razy 150 μL 1xPBS, stosując metodę wylewania i osuszania (dump and blot).</li>
 <li> Do każdego dołka płytki należy dodać 100 μL PBS za pomocą pipety wielokanałowej.</li>
 <li> Płytkę należy wstawić do lodówki na 15 minut.</li>
 <li> Płytkę należy wyjąć z lodówki i umieścić w komorze do hodowli tkanek.</li>
 <li> Przygotowanie roztworu przeciwciał biotynylowanych:
 <ul>
 <li> Do 11 mL PBS należy dodać 0,5 μg/mL przeciwciał biotynylowanych (mAB 7-B6-1).</li>
 <li> Roztwór należy wymieszać za pomocą wstrząsarki vortex.</li>
 <li> W przypadku planowania aplikacji roztworu pipetą wielokanałową, należy przelać go do zbiornika.</li>
 </ul>
 </li>
 <li> Pozostały PBS należy usunąć, wylewając go do pojemnika na odpady. Należy uważać, aby nie rozpryskać zawartości podczas wylewania.</li>
 <li> Do każdego dołka należy nanieść 100 μL roztworu.</li>
 <li> Płytkę należy inkubować w komorze do hodowli tkanek w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę.</li>
 <li> Płytkę należy przemyć 6 razy 150 μL 1xPBS, stosując metodę wylewania i osuszania. Po 6tym płukaniu PBS należy pozostawić na płytce do czasu przygotowania przeciwciał streptawidynowych.</li>
 <li> Przygotowanie przeciwciał streptawidynowych:
 <ul>
 <li> Do 11 mL PBS należy dodać 5,5 μl przeciwciał streptawidynowych (Streptavidin-ALP) (rozcieńczenie 1:2000).</li>
 <li> Roztwór należy wymieszać za pomocą wstrząsarki vortex.</li>
 <li> W przypadku planowania aplikacji roztworu pipetą wielokanałową, należy przelać go do zbiornika.</li>
 </ul>
 </li>
 <li> Pozostały w dołkach PBS należy usunąć, a płytkę osuszyć.</li>
 <li> Do każdego dołka należy dodać 100 μL roztworu streptawidyny.</li>
 <li> Płytkę należy inkubować w komorze do hodowli tkanek w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.</li>
 <li> Płytki należy przemyć 6 razy PBS, stosując metodę wylewania i osuszania. Po 6tym płukaniu PBS należy pozostawić na płytce do czasu przygotowania roztworu barwiącego.</li>
 <li> Prace należy prowadzić w ciemności. Przygotowanie roztworu substratu fosfatazy alkalicznej (Alkaline Phosphatase Substrate Kit IV BCIP/NBT):
 <ul>
 <li> Do 11 mL buforu Tris należy dodać 4 krople odczynnika substratowego 1 i dobrze wymieszać na wstrząsarce vortex. Następnie dodać 4 krople odczynnika substratowego 2 do buforu Tris i ponownie wymieszać. Na koniec dodać 4 krople odczynnika substratowego 3 do buforu Tris i ponownie wymieszać na wstrząsarce vortex.</li>
 </ul>
 </li>
 <li> Pozostały PBS należy usunąć, a płytkę osuszyć.</li>
 <li> Do każdego dołka płytki należy nanieść 100 μL roztworu barwiącego za pomocą pipety wielokanałowej.</li>
 <li> Światło należy zapalić po 5 do 10 minutach rozwoju barwy.</li>
 <li> Odczynniki barwiące należy pozostawić na płytce, aż plamki zaczną zmieniać kolor na fioletowy i staną się ciemne. Powinno to zająć od 5 do 20 minut. Należy uważać, aby nie pozostawić roztworu substratu zbyt długo, gdyż może to spowodować wysokie tło.</li>
 <li> Płytkę ELISPOT należy przemyć 3 razy wodą z kranu.</li>
 <li> Płytkę należy pozostawić do wyschnięcia na około godzinę lub na całą noc.</li>
 <li> Odczyt płytki należy przeprowadzić manualnie lub za pomocą czytnika płytek ELISPOT.</li>
 <li> Płytkę należy przechowywać w pudełku, chroniąc ją przed ekspozycją na światło.</li>
</ol>
Reprezentatywne wyniki:
Metoda ELISPOT służy do ilościowego oznaczania odpowiedzi immunologicznej przeciwko antygenom mikrobiologicznym. Każda plamka wskazuje na pojedynczą komórkę reagującą, która wydziela analizowaną cytokinę. Plamki można liczyć ręcznie lub za pomocą czytnika płytek ELISPOT.
Ocena prawidłowości wykonania testu ELISPOT powinna rozpocząć się od zbadania kontroli negatywnej pod kątem tła produkcji analizowanej cytokiny. W studzienkach kontroli negatywnej nie powinno być widocznych plamek, choć może wystąpić niewielkie tło (kolor fioletowy). Zazwyczaj średnia liczba plamek na studzienkę powinna być mniejsza niż pięć. Studzienki kontroli pozytywnej potwierdzają, że reakcja przebiegła prawidłowo, a komórki reagują na stymulację antygenową. W studzienkach kontroli pozytywnej należy spodziewać się intensywnie fioletowego tła wynikającego ze zlewania się plamek (Rys. 1). Tło białe powinno być minimalne lub nieobecne. Jeśli próbki kontroli pozytywnej i negatywnej są prawidłowe, można przystąpić do zliczenia plamek w studzienkach zawierających analizowany antygen. Wynik „suboptymalny” objawia się wysokim tłem (studzienki są fioletowe), brakiem lub bardzo małą liczbą plamek, pustym środkiem, słabo zdefiniowanymi plamkami lub plamkami zlewającymi się. Lista wskazówek dotyczących rozwiązywania problemów została przedstawiona w Tabeli 1.
 <img alt="Wynik testu ELISPOT; eksperyment immunologiczny; fioletowe plamki wskazują komórki produkujące cytokiny." src="/files/ftp_upload/2221/2221fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
 Rycina 1. Reprezentatywny obraz płytki ELISPOT. Każda płytka powinna zawierać kontrolę pozytywną, kontrolę negatywną oraz wybrany peptyd, przy czym badanie należy przeprowadzić w co najmniej dwóch dołkach. Dołki C9, C10, D9 i D10 stanowią kontrolę pozytywną; widoczny jest w nich głęboki fioletowy kolor, zlane komórki i niemal całkowity brak białego tła. Dołki kontroli negatywnej to G11, G12, H11 i H12. Zgodnie z oczekiwaniami, w dołkach tych nie występuje fioletowe tło ani plamki. Plamki w dołkach G7, G8, H7 i H8 obrazują odpowiedzi komórkowe na peptydy mikrobiologiczne; fioletowe plamki reprezentują pojedyncze komórki odpowiadające poprzez ekspresję badanej cytokiny.
Tabela 1
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td> Obserwacja</td>
 <td> Możliwy problem</td>
 <td> Możliwe rozwiązanie</td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Wysokie tło</td>
 <td>1. Niewłaściwe wypłukanie obu stron membrany 
 2. Zbyt duża liczba komórek wydzielających cytokiny 
 3. Płytka niedostatecznie wysuszona 
 4. Prześwietlona płytka</td>
 <td>1. Obie strony membrany należy przemyć wodą destylowaną przed i po wywołaniu barwy. Odczynniki mogą przesiąkać przez membranę do podstawy płytki, co w przypadku braku wypłukania może spowodować wysoki poziom tła. 
 2. Zmniejszyć liczbę komórek na dołek; będzie to wymagało optymalizacji 
 3. Suszyć płytkę dłużej przed odczytem 
 4. Skrócenie czasu wywoływania</td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Brak plamek/Bardzo mało plamek</td>
 <td>1. Niewystarczająca liczba komórek wydzielających interesującą cytokinę/białko 
 2. Upewnij się, że komórki zostały prawidłowo stymulowane 
 3. Komórki nie były inkubowane wystarczająco długo lub mogą potrzebować czasu na odpowiedź na stymulator 
 4. Niewystarczający rozwój barwy 
 5. Niewystarczająca ilość przeciwciała pierwszorzędowego lub drugorzędowego</td>
 <td>1. Zwiększyć liczbę komórek. Wymaga to optymalizacji 
 2. Należy również zastosować pozytywną kontrolę stymulacji – stymulant, o którym wiadomo, że indukuje ekspresję badanego cytokiny/białka 
 3. Wydłużyć czas inkubacji komórek lub zastosować metodę pośrednią (wcześniejsze traktowanie komórek stymulatorem) 
 4. Monitoruj rozwój barwy za pomocą mikroskopu odgórnego i upewnij się, że odczynniki do wywoływania były przechowywane prawidłowo i nie utraciły swojej aktywności 
 5. Konieczne będzie zwiększenie stężenia przeciwciała pierwszorzędowego i/lub drugorzędowego. Wymaga to optymalizacji.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Obszary puste</td>
 <td>1. Membrana niepoddana wstępnej obróbce 
 2. Membrana w pewnym momencie wyschła 
 3. Nierównomierne rozmieszczenie komórek</td>
 <td>1. Należy upewnić się, że membrana została odpowiednio poddana wstępnej obróbce 70% etanolem (nie wszystkie membrany wymagają tego etapu, dlatego należy sprawdzić informacje u dostawcy). Następnie membranę należy dokładnie przemyć trzy razy w PBS. 
 2. Należy dopilnować, aby membrana nie wyschła 
 3. Należy delikatnie wymieszać komórki, aby uzyskać jednorodną zawiesinę komórkową przed pipetowaniem ich do dołków.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Puste centrum</td>
 <td>1. Uszkodzenia powstałe w wyniku płukania</td>
 <td>1. Przepływ w automatycznej myjce (lub podczas pipetowania) może być zbyt wysoki. Wymagane jest zastosowanie łagodniejszej procedury płukania.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Wyniki fałszywie dodatnie</td>
 <td>1. Agregaty przeciwciał wtórnych 
 2. Komórki pozostałe na membranie 
 3. Kontaminacja hodowli komórkowych</td>
 <td>1. Przefiltruj przeciwciało wtórne 
 2. Przed inkubacją z przeciwciałem wtórnym należy upewnić się, że wszystkie komórki zostały wypłukane z membrany za pomocą buforu PBS Tween 20. Komórki pozostałe na membranie spowodują powstanie plam o nieregularnych kształtach. 
 3. Odczynniki należy utrzymać w jak największej sterylności i czystości. Należy upewnić się, że technika hodowli komórkowej jest aseptyczna. W celu wykluczenia wyników fałszywie dodatnich należy przeprowadzić kontrolę negatywną z użyciem medium. W przypadku przemieszczania płytek, <a href="http://www.abcam.com/index.html?pageconfig=resource&amp;rid=11457#7">widoczne słabo zdefiniowane plamki</a></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Zlewające się plamki</td>
 <td>1. Niewłaściwa powłoka, zbyt duża ilość przeciwciał 
 2. Przedłużona hodowla komórek 
 3. Komórki nadstymulowane</td>
 <td>1. Zmniejszyć stężenie przeciwciała pierwszorzędowego 
 2. Im dłużej komórki są inkubowane, tym więcej cytokin/białek wydzielają. Będzie to skutkować powstaniem większych plamek, które zaczną się zlewać i staną się nierozróżnialne. 
 3. Skróć czas inkubacji na etapie hodowli komórkowej. Nadmierna stymulacja spowoduje wydzielenie przez komórki dużej ilości cytokin/białek. Doprowadzi to do powstania plamek, które zaczną się zlewać i staną się nierozróżnialne. Zmniejsz ilość stymulatora w pożywce lub skróć czas hodowli.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Niewyraźne plamki</td>
 <td>1. Membrana niepoddana wstępnej obróbce (jeśli membrana wymaga takiej procedury, należy sprawdzić informacje u dostawcy) 
 2. Przesuwanie płytek podczas inkubacji komórek</td>
 <td>1. Membranę należy uprzednio potraktować etanolem, w przeciwnym razie mogą powstać rozmyte, słabo zdefiniowane plamki. Będzie to utrudniać ich rozróżnienie przez badacza. 
 2. Nie dopuszczać do przesuwania się płytki podczas inkubacji komórek, ponieważ komórki, które ulegną przemieszczeniu, stworzą więcej niż jedną plamkę. Jeśli to możliwe, należy użyć dedykowanego inkubatora, który nie będzie otwierany w czasie inkubacji. Nie opukiwać płytki po dodaniu komórek.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Sygnał w studzienkach kontroli pozytywnej jest niski</td>
 <td>1. Niedostateczny wywołać – może być wynikiem zastosowania roztworów Streptawidyny-ALP i/lub BCIP/NBT, które nie zostały doprowadzone do temperatury pokojowej</td>
 <td>1. Przed dodaniem do dołków doprowadzić odczynniki do temperatury pokojowej</td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Gęstość plamek utrudnia ich kwantyfikację</td>
 <td>1. Do dołków dodano zbyt wiele komórek</td>
 <td>1. Przygotować rozcieńczenia komórek (tj. 1 x 106, 5 x 105, 1 x 105, 5 x 104, 1 x 104 komórek na dołek), aby określić optymalną liczbę komórek, która pozwoli na utworzenie wyraźnych skupisk (spotów)</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

<ol><li>Dosanjh, D. P., Hinks, T. S., Innes, J. A., Deeks, J. J., Pasvol, G., Hackforth, S., Varia, H., Millington, K. A., Gunatheesan, R., Guyot-Revol, V., Lalvani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+diagnostic+evaluation+of+suspected+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Intern+Med%22%5BJournal%5D)">Improved diagnostic evaluation of suspected tuberculosis.</a> Ann Intern Med. 148, 325-336 (2008).</li>
<li>Sung, H. K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+of+abdominal+tuberculosis+by+T-cell+based+assays+on+peripheral+blood+and+peritoneal+fluid+mononuclear+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Infection%22%5BJournal%5D)">Diagnosis of abdominal tuberculosis by T-cell based assays on peripheral blood and peritoneal fluid mononuclear cells.</a> Journal of Infection. 59, 409-415 (2009).</li>
<li>Kim, S. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+of+Central+Nervous+System+Tuberculosis+by+T-Cell-Based+Assays+on+Peripheral+Blood+and+Cerebrospinal+Fluid+Mononuclear+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Vaccine+Immunology%22%5BJournal%5D)">Diagnosis of Central Nervous System Tuberculosis by T-Cell-Based Assays on Peripheral Blood and Cerebrospinal Fluid Mononuclear Cells.</a> Clinical and Vaccine Immunology. , 1356-1362 (2008).</li>
<li>Drake, W. P., Dhason, M. S., Nadaf, M., Shepherd, B. E., Vadivelu, S., Hajizadeh, R., Newman, L. S., Kalams, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+recognition+of+Mycobacterium+tuberculosis+ESAT-6+and+KatG+peptides+in+systemic+sarcoidosis%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Cellular recognition of Mycobacterium tuberculosis ESAT-6 and KatG peptides in systemic sarcoidosis.</a> Infect Immun. 75, 527-530 (2007).</li>
<li>Allen, S. S., Evans, W., Carlisle, J., Hajizadeh, R., Nadaf, M., Shepherd, B. E., Pride, D. T., Johnson, J. E., Drake, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superoxide+dismutase+A+antigens+derived+from+molecular+analysis+of+sarcoidosis+granulomas+elicit+systemic+Th-1+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Respir+Res%22%5BJournal%5D)">Superoxide dismutase A antigens derived from molecular analysis of sarcoidosis granulomas elicit systemic Th-1 immune responses.</a> Respir Res. 25, 36-36 (2008).</li>
<li>Mutsvangwa, J., Millington, K. A., Chaka, K., Mavhudzi, T., Cheung, Y. B., Mason, P. R., Butterworth, A. E., Corbett, E. L., Lalvani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+recent+Mycobacterium+tuberculosis+transmission+in+the+setting+of+high+HIV+and+TB+burden%5BTitle%5D)+AND+%22Thorax%22%5BJournal%5D)">Identifying recent Mycobacterium tuberculosis transmission in the setting of high HIV and TB burden.</a> Thorax. 65, 315-320 (2010).</li>
<li>Streeck, H., Frahm, N., Walker, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+IFN-gamma+Elispot+assay+in+HIV+vaccine+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">The role of IFN-gamma Elispot assay in HIV vaccine research.</a> Nat Protoc. 4, 461-469 (2009).</li>
<li>Chaudhary, N., Staab, J. F., Marr, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Healthy+human+T-Cell+Responses+to+Aspergillus+fumigatus+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Healthy human T-Cell Responses to Aspergillus fumigatus antigens.</a> PLoS One. 5, e9036-e9036 (2010).</li>
<li>Manigold, T., Mori, A., Graumann, R., Llop, E., Simon, V., Ferr, S. M., Valdivieso, F., Castillo, C., Hjelle, B., Vial, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+differentiated%2C+resting+gn-specific+memory+CD8%2B+T+cells+persist+years+after+infection+by+andes+hantavirus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Highly differentiated, resting gn-specific memory CD8+ T cells persist years after infection by andes hantavirus.</a> PLoS Pathog. 6, e1000779-e1000779 (2010).</li>
<li>Ndongala, M. L., Kamya, P., Boulet, S., Peretz, Y., Rouleau, D., Tremblay, C., Leblanc, R., Côté, P., Baril, J. G., Thomas, R., Vézina, S., Boulassel, M. R., Routy, J. P., Sékaly, R. P., Bernard, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+function+of+HIV-specific+T-cell+responses+with+increasing+time+from+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Viral+Immunol%22%5BJournal%5D)">Changes in function of HIV-specific T-cell responses with increasing time from infection.</a> Viral Immunol. 2, 159-168 (2010).</li>
</ol>

Nie zgłoszono konfliktów interesów.

Test ELISPOT stał się jednym z najważniejszych i najszerzej stosowanych testów do monitorowania odpowiedzi immunologicznych u ludzi oraz u wielu innych gatunków. Dzięki testowi ELISPOT częstotliwość występowania komórek odpornościowych można mierzyć na poziomie pojedynczych komórek, bez konieczności ekspansji lub manipulacji populacjami komórkowymi. Test ELISPOT był szeroko stosowany do badania swoistych odpowiedzi immunologicznych na antygeny w różnych schorzeniach, w tym w infekcjach, nowotworach, alergiach i chorobach...

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_title">A. Przygotowanie pożywek&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;img src=&quot;/files/ftp_upload/2221/2221materialsA.jpg&quot; alt=&quot;Materiały A&quot;/&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_title">B. Przygotowanie buforu Tris&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;ol&gt; &lt;li&gt; Wlać 800 ml ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O do zlewki o pojemności 1 L.&lt;/li&gt; &lt;li&gt; Odważyć 12 g Trisu i dodać do zlewki.&lt;/li&gt; &lt;li&gt; Dodać do zlewki 0,12 g sześciowodnego chlorku magnezu (MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;:6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O).&lt;/li&gt; &lt;li&gt; Mieszać za pomocą magnetycznego mieszadła na automatycznej płycie grzejno-mieszalnej. &lt;/li&gt; &lt;li&gt; Po rozpuszczeniu składników dostosować pH roztworu do 9,5.&lt;/li&gt; &lt;li&gt; Dodać do zlewki 200 mL ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, aby uzyskać objętość 1000 mL.&lt;/li&gt; &lt;li&gt; Przefiltrować roztwór przez filtr o rozmiarze porów 0,22 &amp;mu;m.&lt;/li&gt; &lt;/ol&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_title">C. Materiały niezbędne do analizy ELISPOT:&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;img src=&quot;/files/ftp_upload/2221/2221materialsb.jpg&quot; alt=&quot;Materiały B&quot;/&gt;</td></tr></tbody></table>

test immunospot z enzymatycznym sprzężeniem (elispot): ilościowe oznaczenie komórkowych odpowiedzi immunologicznych th-1 przeciwko antygenom mikrobiologicznym

Enzyme-linked Immunospot Assay (ELISPOT):  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Odporność adaptacyjna jest istotnym elementem eliminacji patogenów wewnątrzkomórkowych. Zdolność do wykrywania i ilościowego określania tych odpowiedzi u ludzi stanowi ważne narzędzie diagnostyczne. Test immunospot z zastosowaniem enzymów (ELISPOT) zyskuje na popularności dzięki możliwości identyfikacji komórkowych odpowiedzi immunologicznych przeciwko antygenom drobnoustrojów, w tym w populacjach z immunosupresją, takich jak osoby z zakażeniem HIV, po transplantacji oraz stosujące sterydy. Test ten pozwala na ilościowe określenie odpowiedzi immunologicznych przeciwko specyficznym antygenom drobnoustrojów, a także na rozróżnienie, czy odpowiedzi te mają charakter Th1 czy Th2. Metoda ELISPOT nie jest ograniczona do miejsca stanu zapalnego. Jest wszechstronna i umożliwia ocenę odpowiedzi immunologicznych we krwi obwodowej, jak i w miejscach aktywnego procesu zapalnego, takich jak płukanie pęcherzyków płucnych, płyn mózgowo-rdzeniowy i wysięk w jamie brzusznej. Możliwe jest wykrywanie odpowiedzi immunologicznych przeciwko pojedynczemu lub wielu antygenom, a także przeciwko specyficznym epitopom w białkach drobnoustrojów. Test ten ułatwia monitorowanie odpowiedzi immunologicznych w czasie oraz rozróżnianie antygenów rozpoznawanych przez limfocyty T gospodarza. Dostępne są dwukolorowe testy ELISPOT do jednoczesnego wykrywania ekspresji dwóch cytokin. Niedawne zastosowania tej techniki obejmują diagnostykę gruźlicy pozapłucnej oraz badanie wpływu antygenów zakaźnych na rozwój chorób autoimmunizacyjnych.

Identyfikacja mikrobiologicznych celów odporności adaptacyjnej w chorobach idiopatycznych może zostać przeprowadzona przy użyciu testu ELISpot (enzyme-linked immunospot assay).

Test immunospot z enzymatycznym sprzężeniem (ELISPOT): Ilościowe oznaczenie komórkowych odpowiedzi immunologicznych Th-1 przeciwko antygenom mikrobiologicznym

Odporność adaptacyjna jest istotnym elementem eliminacji patogenów wewnątrzkomórkowych. Zdolność do wykrywania i ilościowego określania tych odpowiedzi u ludzi jest...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wykrycie odpowiedzi limfocytów T na interesujące badacza antygeny. Jest to realizowane poprzez wstępne kodowanie przeciwciałami wychwytującymi. Drugim krokiem procedury jest dodanie komórek oraz interesujących badacza antygenów, a następnie inkubacja przez noc.Trzecim krokiem procedury jest dodanie przeciwciał detekcyjnych. Ostatnim etapem procedury jest wywołanie płytki za pomocą odczynników substratowych i analiza plamek. W rezultacie, poprzez analizę jednostek tworzących plamki, można uzyskać wyniki dla wybranych cytokin.Witajcie, nazywam się dr Ki Richter i jestem instruktorem badawczym w laboratorium dr Wonder Drake'a na Uniwersytecie Vanderbilt w dziale chorób zakaźnych. Dzisiaj zaprezentujemy technikę ELISpot, znaną również jako test immunospotowy z użyciem sprzężonych enzymów. Technikę tę zaprezentują Państwu dr Isfahan Chambers oraz Tiffany Cone.Aby zachować standardy hodowli komórkowych, należy przeprowadzać manipulacje w warunkach sterylnych w komorze laminarnej; otworzyć płytkę do analizy typu ally spot i trzykrotnie przemyć ją PBS. Przygotować roztwór powlekający z przeciwciałem wychwytującym w PBS. W celu ułatwienia wymieszać dokładnie za pomocą wortexa.Przenieś roztwór przeciwciał do zbiornika dla pipety wielokanałowej i nanieś 100 µL roztworu powlekającego do każdej dołki. Szczelnie zamknij płytkę folią i przechowuj w lodówce przez noc. Tak przygotowane płytki powlekane przeciwciałami można przechowywać przez wiele tygodni.Zgodnie z ogólną zasadą płytkę można wykorzystać, jeśli w dołkach wciąż znajduje się ciecz. Aby przygotować komórki do tego testu, świeżo wyizolowane mononuklearne komórki krwi obwodowej należy zabarwić błękitnemcollisions trien w celu oceny żywotności, a następnie je zliczyć. Wysiać PBMC w zagęszczeniu 2 milionów komórek na mililitr w podłożu 10 i inkubować przez noc w temperaturze 37°C w atmosferze 5% carbon dioxide. W celu monitorowania przebiegu eksperymentu, należy oznaczyć pokrywkę płytki Ali spot numerem identyfikacyjnym próbki, warunkami w dołkach oraz datą.Umyj płytkę sześciokrotnie sterylnym PBS, stosując metodę odlewania i osuszania. Należy uważać, aby nie rozpryskiwać cieczy podczas odlewania, ponieważ może to spowodować zabarwienie studzienek płytki na kolor fioletowy. Dodaj 20 µL pożywki do każdej studzienki i inkubuj płytkę w temperaturze 37 °C przez jedną godzinę.Podczas inkubacji płytki należy policzyć komórki, które odpoczywały przez noc. Zebrać PBMC poprzez wirowanie. Odlać naddestylat i resuspender osad w 10 ml medium, aby uzyskać stężenie 1 milion komórek na mililitr.Po jednogodzinnej inkubacji płytki z naniesionymi kropelkami, usuń pożywkę R 20 metodą odlania i osuszenia. Należy uważać, aby nie rozbryzgać zawartości płytki podczas odlewania. Do każdej kropelki dodaj 100 µL zawiesiny komórek.Należy postępować zgodnie z planem doświadczalnym, dodając peptydy i antygeny do odpowiednich studzienek testowych. Zawsze należy uwzględnić negatywną kontrolę z komórkami bez peptydów, a także studzienki kontroli pozytywnej z dodatkiem fitohemaglutyniny. Inkubować płytkę przez noc w temperaturze 37 °C przy 5% carbon dioxide.Umyj płytkę sześciokrotnie, używając 150 µL 1x PBS, stosując metodę opróżniania i osuszania (dump and blot). Dodaj 100 µL PBS do każdej studni płytki i pozostaw płytkę w lodówce lub w temperaturze pokojowej na 15 minut. W tym czasie przygotuj roztwór przeciwciała biotynilowanego w PBS.Wyjmij płytkę spot ALI z lodówki i wylej PBS, energicznie potrząsając płytką nad koszem na odpady. Uważaj, aby nie rozbryzgać zawartości podczas dodawania odpowiedniej ilości roztworu przeciwciał z biotyną do każdego dołka, a następnie inkubuj płytkę w komorze do hodowli tkanek w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę. Przemyj płytkę sześciokrotnie PBS, stosując metodę wylewania i osuszania (dump and blot) podczas ostatniego przemywania.Pozostaw teraz PBS na płytce. Przygotuj roztwór przeciwciał STREPTAVIDIN w PBS, pamiętając o wymieszaniu roztworu w wstrząsarzu Vortex. Odlej ostatnią porcję PBS z dołków i przygotuj płytkę do nakładania próbek ALI.Do każdego dołka należy dodać roztwór przeciwciał streptawidyny i inkubować płytkę w komorze do hodowli tkanek w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę. Aby usunąć nadmiar przeciwciał streptawidyny, płytkę należy przemyć sześciokrotnie PBS, stosując metodę odlewania i osuszania; przy ostatnim płukaniu należy pozostawić PBS na płytce. Należy pamiętać o światłoczułości roztworu substratu fosfatazy alkalicznej B-C-I-P-M-B-T.Przygotowując roztwór barwiący zgodnie z instrukcjami producenta dołączonymi do zestawu substratów fosfatazy alkalicznej, należy pracować w ciemności. Odpić pozostały PBS z dołków i osuszyć płytkę do analizy plam. Dodać roztwór substratu do każdego dołka i zapalić światło. Po 5 do 10 minutach wywoływania koloru pozostawić odczynniki na płytce do momentu, aż plamy zaczną zmieniać barwę na fioletową i staną się wyraźnie ciemne.Proces ten trwa do 20 minut. Płytkę Ali spot plate należy przemyć trzykrotnie wodą z kranu i pozostawić do wyschnięcia. Każda płytka zawiera kontrolę pozytywną, kontrolę negatywną oraz analizowany peptyd, przy czym wszystkie pomiary wykonuje się co najmniej w duplikacie.Dołki kontroli dodatniej mają głęboki fioletowy kolor, co odzwierciedla obecność konfluencyjnej warstwy komórek i niemal całkowity brak białego tła. Dołki kontroli ujemnej nie wykazują fioletowego tła ani plamek, zgodnie z oczekiwaniami. Dołki z próbkami testowymi ilustrują tutaj reakcje komórkowe na peptydy mikrobiologiczne.Fioletowe punkty reprezentują pojedynczą komórkę respondentną wykazującą ekspresję badanej cytokiny podczas stosowania techniki LA spot. Należy uważać, aby nie przebić membrany końcówkami pipet oraz nie dopuścić do wyschnięcia płytki, ponieważ spowoduje to wysokie tło.

enzyme-linked-immunospot-assay-elispot-quantification-th-1-cellular

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Test Enzyme-Linked Immunospot Assay (ELISPOT):  Ilość odpowiedzi odpornościowych komórek Th-1 przeciwko antygenom drobnomiejscym

Charakterystyka epitopów limfocytów T patogenów wywołujących infekcje miejscowe, takich jak wirus brodawczaka ludzkiego, stanowi wyzwanie ze względu na ograniczoną liczbę krążących limfocytów T. Opisano metodę, w której rzadkie limfocyty T zostały wyizolowane i scharakteryzowane, zaczynając od bardzo małej liczby komórek.

Wykorzystanie testu Enzyme-linked Immunospot (ELISpot) dla interferonu $\gamma$ do charakterystyki nowych epitopów limfocytów T wirusa papilomawirusa ludzkiego

Ten film demonstruje użycie testu ELISpot do oceny funkcji komórek B wydzielających przeciwciała, ASC. Przeciwciała wydzielane przez ASC oddziałują z fragmentami przeciwciał poliklonalnych związanymi z błoną, które są wykrywane przez przeciwciała IgG lub IgM sprzężone z enzymem. Kolorowa plamka wytworzona w każdym dołku wskazuje na obecność specyficznego izotypu przeciwciała, który koreluje z aktywnością wydzielniczą limfocytów B.

Ocena funkcjonalna limfocytów B wydzielających przeciwciała za pomocą testu ELISpot

Nowatorskie generacje testów funkcjonalnych, takich jak interferon gamma (IFN-γ) ELISpot, które wykrywają produkcję cytokin na poziomie pojedynczej komórki i zapewniają zarówno ilościową, jak i jakościową charakterystykę odpowiedzi limfocytów T, mogą być używane do oceny komórkowych odpowiedzi immunologicznych skierowanych przeciwko wirusowi ospy wietrznej i półpaśca (VZV).

Opracowanie testu ELISpot IFN-γ do oceny odporności komórkowej specyficznej dla wirusa ospy wietrznej i półpaśca po przeszczepieniu krwi pępowinowej

Długoterminowy test immunologiczny związany z interferonem γ enzymem jest używany jako miara odpowiedzi pamięci centralnej i koreluje z ochronnymi odpowiedziami na szczepionkę przeciw prątkom. Dzięki temu testowi komórki jednojądrzaste krwi obwodowej są stymulowane antygenami prątkami i interleukiną-2 przez 14 dni, umożliwiając różnicowanie i ekspansję limfocytów T pamięci centralnej.

Zastosowanie długotrwale hodowanego testu immunologicznego związanego z enzymem interferonu γ do oceny odpowiedzi efektorowych i pamięciowych limfocytów T u bydła

Ludzka krew obwodowa jest powszechnie używana do oceny humoralnej odpowiedzi immunologicznej. W tym miejscu opisano metody izolowania ludzkich limfocytów B z krwi obwodowej, różnicowania ludzkich komórek B w limfocyty B wydzielające przeciwciała (Ab) (ASC) w hodowli oraz liczenia całkowitych IgM- i IgG-ASC za pomocą testu ELISpot.

Izolacja, różnicowanie i kwantyfikacja ludzkich limfocytów B wydzielających przeciwciała z krwi: ELISpot jako funkcjonalny odczyt odporności humoralnej

Qa-1 (HLA-E u człowieka) należy do grupy nieklasycznych cząsteczek głównego kompleksu zgodności tkankowej 1b. Wykazano, że immunizacja epitopami wiążącymi Qa-1 zwiększa tkankową regulację immunologiczną i łagodzi kilka chorób autoimmunologicznych. W niniejszym artykule opisujemy nakładającą się strategię biblioteki peptydów do identyfikacji epitopów Qa-1 w białku.

Nakładająca się biblioteka peptydów do mapowania epitopów Qa-1 w białku

W tym artykule opisujemy protokół charakteryzujący odpowiedzi immunoglobuliny (Ig) zależnej od T i niezależnej od T u myszy za pomocą testu ELISA. Ta metoda stosowana samodzielnie lub w połączeniu z cytometrią przepływową pozwoli naukowcom zidentyfikować różnice w odpowiedziach izotypu Ig za pośrednictwem komórek B u myszy po immunizacji antygenu T zależnej i niezależnej od T.

Charakterystyka odpowiedzi izotypu immunoglobuliny zależnej i niezależnej od grasicy u myszy przy użyciu testu immunoenzymatycznego

Rozwój testu interferon-gamma ELISpot dla PBMC świnek morskich pozwala na scharakteryzowanie odpowiedzi limfocytów T w tym bardzo istotnym modelu do badania chorób zakaźnych. Zastosowaliśmy test do pomiaru odpowiedzi limfocytów T związanych z śródskórnym dostarczaniem szczepionek DNA.

Zoptymalizowany test ELISpot interferonu gamma do pomiaru odpowiedzi limfocytów T w modelu świnki morskiej po szczepieniu

Tutaj prezentujemy protokół jakościowego wykrywania ex vivo specyficznych dla antygenu limfocytów T CD8+. Analiza jest możliwa w przypadku zawiesin pojedynczych komórek z narządów lub z niewielkich ilości krwi. Szeroki zakres badań wymaga analizy odpowiedzi cytotoksycznych limfocytów T (badania nad szczepieniami i immunoterapią nowotworów).

Jednoczesna kwantyfikacja limfocytów T CD8 + specyficznych dla antywektorów i anty-transgenów za pomocą barwienia tetramerem MHC I po szczepieniu wektorem wirusowym

Protokół przedstawia szczegółowe metody oceny, czy adiuwant nanoemulsji ofiopogoniny D wspomaga skuteczne komórkowe odpowiedzi immunologiczne.

In vitro Ocena aktywności komórkowej adiuwantu szczepionki nanoemulsyjnej ofiopogoniny D

Poznaj test ELISPOT do kwantyfikacji odpowiedzi komórek Th-1 przeciwko antygenom drobnoustrojów. Ta metoda pozwala wykryć odpowiedzi limfocytów T i zidentyfikować cele immunologiczne w chorobach idiopatycznych.

Test immunospot z enzymatycznym sprzężeniem (ELISPOT): Ilościowe oznaczenie komórkowych odpowiedzi immunologicznych Th-1 przeciwko antygenom mikrobiologicznym

Przeglądaj więcej filmów