JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Badania nad rakiem
0 wyświetleń • 4:35 min. • April 30th, 2023
Komórki nabłonkowe obecne na zewnętrznej powierzchni jajnika mogą ulegać złośliwej transformacji w komórki rakowe, które mogą przekształcić się w guzy jajnika.
Aby wyizolować te nabłonkowe komórki raka jajnika lub EOC, zacznij od pobrania próbki guza jajnika i zmielenia jej na małe kawałki. Przenieść zmielone kawałki do probówki zawierającej bufor wytrawiający uzupełniony pożądanym enzymem proteazą.
Proteazy te degradują białka macierzy zewnątrzkomórkowej w tkance, uwalniając komórki EOC, erytrocyty i kilka zdysocjowanych fibroblastów do zawiesiny.
Przefiltruj zawiesinę komórek przez sitko, aby oddzielić zawieszone pojedyncze komórki od niezdysocjowanych kawałków tkanki. Odwirować zawiesinę w celu granulacji komórek EOC, erytrocytów i fibroblastów. Odrzucić supernatant zawierający enzym.
Zawiesić osad komórkowy w nabłonkowym pożywce wzrostowej i przenieść go do naczynia hodowlanego. Inkubuj kulturę, aby umożliwić komórkom EOC i fibroblastom przyczepienie się do podstawy szalki, podczas gdy erytrocyty unoszą się w pożywce.
Usuń zawieszone erytrocyty, odświeżając pożywkę. Z biegiem czasu pożywka ułatwia selektywny wzrost komórek EOC nad fibroblastami, tworząc monowarstwę komórek pierwotnego raka jajnika.
Pobrać próbkę z sali operacyjnej i przetransportować ją na lodzie do laboratorium. Pozostając w transportowanym pojemniku, umieścić próbkę w biologicznym kapturze bezpieczeństwa. Przenieś próbkę z 50-mililitrowej stożkowej rurki na szalkę Petriego o wymiarach 60 milimetrów na 60 milimetrów zawierającą 10 mililitrów świeżego, lodowatego PBS.
Następnie za pomocą sterylnej żyletki pokrój próbkę na 2 milimetry lub mniejsze kawałki. Następnie potraktuj DMEM dyspazą II w 15-mililitrowej stożkowej probówce. Przenieść zmielone tkanki do probówki z mieszaniną DMEM dispazy II. Następnie inkubuj próbkę w 5% dwutlenku węgla i temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. Ręcznie mieszaj gnojowicę komórkową co pięć minut, aby zapewnić optymalne trawienie.
Po inkubacji przenieś zawiesinę komórek przez sitko o siatce 70 mikrometrów umieszczone na 50-mililitrowej stożkowej rurce. Delikatnie docisnąć siatkę za pomocą tłoka strzykawki. Wyrzuć wszelką niezdysocjowaną tkankę pozostałą na wierzchu siatki i zbierz uzyskaną zawiesinę komórek w 50-mililitrowej sterylnej stożkowej probówce.
Następnie odwirować stożkową probówkę o sile 320 x g przez siedem minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Wyrzuć supernatant i ponownie zawieś osad komórkowy w 10 mililitrach DMEM zawierającym 10% FBS i 1% PS. Następnie przenieś zawiesinę komórkową na szalkę Petriego i inkubuj zawiesinę w 5% dwutlenku węgla i 37 stopniach Celsjusza. Zmień pożywkę 24 godziny po początkowym posiewie, aby usunąć resztki komórkowe i większość erytrocytów obecnych w hodowli.
Na koniec należy zmieniać pożywkę co trzy dni przez kolejne dwa tygodnie, po czym hodowle pierwotnych komórek EOC są gotowe do dalszych zastosowań.