Name: Heterotypowe trójwymiarowe modelowanie in vitro interakcji zrębowo-nabłonkowych podczas inicjacji i progresji raka jajnika (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 42 s
Description: Poznaj metodę tworzenia trójwymiarowych heterotypowych modeli raka jajnika z komórek nabłonkowych i zrębowych. Ta technika pozwala badać interakcje komórkowe inicjujące nowotwór.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania te zostały przeprowadzone w Keck School of Medicine, University of California, USA, oraz University College London, UK. KL jest finansowany z grantu National Institute of Health 5 U19 CA148112-02. BG otrzymał finansowanie z grantu projektowego od organizacji charytatywnej zajmującej się onkologią ginekologiczną Eve Appeal (UK). Część prac przeprowadzonych w UCLH/UCL została częściowo sfinansowana w ramach programu finansowania NIHR Biomedical Research Centre Departamentu Zdrowia.

<ol><li>Jelovac, D., Armstrong, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+progress+in+the+diagnosis+and+treatment+of+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22CA+Cancer+J.+Clin%22%5BJournal%5D)">Recent progress in the diagnosis and treatment of ovarian cancer.</a> CA Cancer J. Clin. , (2011).</li>
<li>Office for National Statistics. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Cancer+Statistics+registrations%3A+registrations+of+cancer+diagnosed+in+2008%22">Cancer Statistics registrations: registrations of cancer diagnosed in 2008</a>. , England. (2011).</li>
<li>Köbel, M., Kalloger, S. E., Santos, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+type+and+substage+predict+survival+in+stage+I+and+II+ovarian+carcinoma%3A+insights+and+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Gynecol.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Tumor type and substage predict survival in stage I and II ovarian carcinoma: insights and implications.</a> Gynecol. Oncol. 116, 50-56 (2010).</li>
<li>Köbel, M., Kalloger, S. E., Boyd, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+carcinoma+subtypes+are+different+diseases%3A+implications+for+biomarker+studies%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Med%22%5BJournal%5D)">Ovarian carcinoma subtypes are different diseases: implications for biomarker studies.</a> PLoS Med. 5, e232(2008).</li>
<li>Smith, L. H., Morris, C. R., Yasmeen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+cancer%3A+can+we+make+the+clinical+diagnosis+earlier%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Ovarian cancer: can we make the clinical diagnosis earlier.</a> Cancer. 104, 1398-1407 (2005).</li>
<li>Aviv, A., Hunt, S. C., Lin, J., Cao, X., Kimura, M., Blackburn, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impartial+comparative+analysis+of+measurement+of+leukocyte+telomere+length%2FDNA+content+by+Southern+blots+and+qPCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Impartial comparative analysis of measurement of leukocyte telomere length/DNA content by Southern blots and qPCR.</a> Nucleic Acids Res. 39, e134(2011).</li>
<li>Kim, N. W., Wu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+quantification+and+characterization+of+telomerase+activity+by+the+telomeric+repeat+amplification+protocol+%28TRAP%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Advances in quantification and characterization of telomerase activity by the telomeric repeat amplification protocol (TRAP.</a> Nucleic Acids Res. 25, 2595-2597 (1997).</li>
<li>Lawrenson, K., Grun, B., Benjamin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescent+fibroblasts+promote+neoplastic+transformation+of+partially+transformed+ovarian+epithelial+cells+in+a+three-dimensional+model+of+early+stage+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Senescent fibroblasts promote neoplastic transformation of partially transformed ovarian epithelial cells in a three-dimensional model of early stage ovarian cancer.</a> Neoplasia. 12, 317-325 (2010).</li>
<li>Lawrenson, K., Benjamin, E., Turmaine, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+three-dimensional+modelling+of+human+ovarian+surface+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Prolif%22%5BJournal%5D)">In vitro three-dimensional modelling of human ovarian surface epithelial cells.</a> Cell Prolif. 42, 385-393 (2009).</li>
<li>Lawrenson, K., Sproul, D., Grun, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+genetic+and+clinical+heterogeneity+in+epithelial+ovarian+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Modelling genetic and clinical heterogeneity in epithelial ovarian cancers.</a> Carcinogenesis. 32, 1540-1549 (2011).</li>
<li>Grun, B., Benjamin, E., Sinclair, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+in+vitro+cell+biology+models+of+ovarian+and+endometrial+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Prolif%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional in vitro cell biology models of ovarian and endometrial cancer.</a> Cell Prolif. 42, 219-228 (2009).</li>
<li>Zietarska, M., Maugard, C. M., Filali-Mouhim, A., Alam-Fahmy, M., Tonin, P. N., Provencher, D. M., Mes-Masson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+description+of+a+3D+in+vitro+model+for+the+study+of+epithelial+ovarian+cancer+%28EOC%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Carcinog%22%5BJournal%5D)">Molecular description of a 3D in vitro model for the study of epithelial ovarian cancer (EOC.</a> Mol. Carcinog. 46, 872-885 (2007).</li>
<li>Shield, K., Ackland, M. L., Ahmed, N., Rice, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+spheroids+in+ovarian+cancer+metastases%3A+Biology+and+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Gynecol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Multicellular spheroids in ovarian cancer metastases: Biology and pathology.</a> Gynecol Oncol. 113, 143-148 (2009).</li>
<li>Dafou, D., Grun, B., Sinclair, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microcell-mediated+chromosome+transfer+identifies+EPB41L3+as+a+functional+suppressor+of+epithelial+ovarian+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Microcell-mediated chromosome transfer identifies EPB41L3 as a functional suppressor of epithelial ovarian cancers.</a> Neoplasia. 12, 579-589 (2010).</li>
<li>Levanon, K., Crum, C., Drapkin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+pathogenesis+of+serous+ovarian+cancer+and+its+clinical+impact%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">New insights into the pathogenesis of serous ovarian cancer and its clinical impact.</a> J. Clin. Oncol. 26, 5284-5293 (2008).</li>
<li>Kurman, R. J., Shih, I. eM. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+pathogenesis+and+extraovarian+origin+of+epithelial+ovarian+cancer--shifting+the+paradigm%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Molecular pathogenesis and extraovarian origin of epithelial ovarian cancer--shifting the paradigm.</a> Hum. Pathol. 42, 918-931 (2011).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Biologia wczesnych stadiów nabłonkowego raka jajnika (EOC) jest słabo poznana. Przez wiele lat jedną z głównych przeszkód w tej dziedzinie był prawdopodobnie brak zrozumienia tkankowego pochodzenia tej choroby oraz znaczenia roli mikrośrodowiska w rozwoju EOC. W ciągu ostatnich kilku lat stało się jasne, że EOC jest chorobą heterogenną o wielu odrębnych podtypach histopatologicznych, prawdopodobnie o różnym pochodzeniu komórkowym dla poszczególnych podtypów. Na przykład obecne dane sugerują, że wysokozłośliwe EOC surowic...

<table><tbody><tr><td>PolyHEMA, odpowiedni do hodowli komórkowych</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3932</td><td></td></tr><tr><td>Etanol klasy molecular biology</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Sterylna woda do hodowli komórkowych</td><td>VWR</td><td>12001-356</td><td></td></tr><tr><td>MCDB105</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6395</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka Medium 199</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M2154</td><td></td></tr><tr><td>Hyclone surowica bydlęca z płodu</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30088.03</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycyna</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1397</td><td></td></tr><tr><td>Amfoterycyna B</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2942</td><td></td></tr><tr><td>pBABE-hygro-hTERT</td><td>Addgene</td><td>1773</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>VWR</td><td>12001-766</td><td></td></tr><tr><td>0,25% trypsyna-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25200-072</td><td></td></tr><tr><td>Sito do komórek (40 lub 70&amp;mu;m)</td><td>VWR</td><td>21008-949&lt;br/&gt; 21008-952</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciwko białku powierzchniowemu fibroblastów, klon 1B10</td><td>Sigma</td><td>F4771</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciwko pan-cytokeratynom (C11)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-8018</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene (bromek heksadymetryny)</td><td>Sigma</td><td>107689</td><td></td></tr><tr><td>TeloTAGGG Telomerase PCR ELISA&lt;sup&gt;PLUS&lt;/sup&gt;</td><td>Roche</td><td>12013789001</td><td></td></tr><tr><td>Test długości telomerów TeloTAGGG</td><td>Roche</td><td>12209136001</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;strong&gt;Tabela 1. &lt;/strong&gt; Odczynniki i sprzęt wykorzystane w niniejszym badaniu.&lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

heterotypowe trójwymiarowe modelowanie in vitro oddziaływań stropowo-nabłonkowych podczas inicjacji i progresji raka jajnika

Heterotypic Three-dimensional In Vitro Modeling of Stromal-Epithelial Interactions During Ovarian Cancer Initiation and Progression

Rak nadjarmniowy nabłonkowy (EOC) jest główną przyczyną zgonów z powodu nowotworów ginekologicznych w społeczeństwach zachodnich. Pomimo postępów w leczeniu chirurgicznym i udoskonalenia chemioterapii opartych na platynie, w ciągu ponad czterech dekad odnotowano niewielką poprawę w przeżywalności pacjentek z EOC 1,2. Podczas gdy dla guzów w stadium I wskaźnik 5-letniej przeżywalności wynosi &gt;85%, dla choroby w stadium III/IV wskaźniki przeżywalności są niższe niż &lt;40%. Zatem wysoka śmiertelność w przypadku EOC mogłaby zostać znacznie zmniejszona, gdyby guzy były wykrywane we wcześniejszych, łatwiejszych do leczenia stadiach 3-5. Obecnie molekularne, genetyczne i biologiczne podstawy rozwoju choroby we wczesnym stadium są słabo poznane. W szczególności niewiele wiadomo o roli mikrośrodowiska podczas inicjacji guza, jednak znane czynniki ryzyka EOC (np. wiek i liczba porodów) sugerują, że mikrośrodowisko odgrywa kluczową rolę we wczesnej genezie EOC. Opracowaliśmy zatem trójwymiarowe modele heterotypowe zarówno prawidłowego jajnika, jak i raka jajnika we wczesnym stadium. W przypadku prawidłowego jajnika zastosowano kokulturę prawidłowych komórek nabłonkowych powierzchni jajnika (IOSE) oraz prawidłowych fibroblastów zrębu (INOF)&nbsp;, unieśmiertelnionych poprzez transdukcję retrowirusową katalitycznej podjednostki ludzkiego holoenzymu telomerazy (hTERT) w celu wydłużenia czasu życia tych komórek w kulturze. Aby zamodelować najwcześniejsze etapy transformacji nabłonkowych komórek jajnika, zastosowano nadekspresję onkogenu CMYC w komórkach IOSE, które ponownie hodowano w kokulturze z komórkami INOF. Te modele heterotypowe wykorzystano do zbadania wpływu starzenia się i senescencji na transformację i inwazję komórek nabłonkowych. W niniejszej pracy opisujemy kroki metodologiczne w opracowywaniu tych modeli trójwymiarowych; metodologie te nie są specyficzne wyłącznie dla rozwoju tkanek prawidłowego jajnika i raka jajnika i mogą być stosowane do badania innych typów tkanek, w których interakcje między komórkami zrębu a nabłonkowymi stanowią fundamentalny aspekt utrzymania tkanki i rozwoju choroby.

Opisujemy metodologie tworzenia heterotypowych trójwymiarowych modeli in vitro, składających się z fibroblastów jajnika oraz prawidłowych komórek nabłonkowych powierzchni jajnika lub komórek nabłonkowych raka jajnika. Omówiono zastosowanie tych modeli do badania oddziaływań stroma-nabłonek, które zachodzą podczas rozwoju raka jajnika.

Heterotypowe trójwymiarowe modelowanie in vitro oddziaływań stropowo-nabłonkowych podczas inicjacji i progresji raka jajnika

Nabłonkowe raki jajnika (EOCs) są główną przyczyną zgonów z powodu nowotworów ginekologicznych w społeczeństwach zachodnich. Pomimo postępów w chirurgii...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest wygenerowanie trójwymiarowych modeli typowych dla wczesnych etapów rozwoju raka jajnika. W pierwszej kolejności należy stworzyć unieśmiertelnione linie komórkowe H turt pochodzące z pierwotnych, prawidłowych tkanek nabłonkowych oraz fibroblastów jajnika. Następnie, aby odtworzyć architekturę in vivo oraz złożone interakcje międzykomórkowe występujące w jajniku, należy przeprowadzić kokulturę linii komórek nabłonkowych i zrębowych w trójwymiarowych modelach sferoidów S. Następnie należy utrwalić i zabarwić kultury organoidów oraz przeanalizować ekspresję specyficznych markerów w celu zbadania cech molekularnych interakcji nabłonkowo-zrębowych.Uzyskane wyniki pokazują, w jaki sposób zmiany w komponencie komórek zrębowych w typowych modelach 3D mogą wpływać na fenotyp współhodowanych komórek nabłonkowych. Trójwymiarowe modele typowe mogą pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie badań nad rakiem jajnika, takie jak badanie pochodzenia tej choroby oraz wyjaśnienie roli mikrośrodowiska zrębowego w inicjacji i rozwoju nowotworu. Zastosowania tych technik, w porównaniu z innymi metodami hodowli 3D, rozszerzają się w stronę diagnostyki i terapii chorób.Tę technikę można zastosować do szerszego zakresu objętości hodowli komórkowych i aplikacji w dalszych etapach analiz. Przykładowo, homogeniczne i typowe hodowle 3D mogą być wykorzystane do testowania leków in vitro. Podejście to można również zastosować w innych systemach modelowych, np. w badaniach nad innymi typami guzów litych lub w przypadku chorób łagodnych.Przenieś świeżą tkankę jajnika do laboratorium hodowli komórkowych w pożywce do wzrostu unieruchomionych normalnych fibroblastów jajnika, uzupełnionej o dodatkowe antybiotyki i antymykotyki. Przemyj próbkę trzykrotnie pięcioma mililitrami PBS, aby usunąć komórki nabłonkowe, które pozostają słabo przytwierdzone do tkanki. Następnie przenieś próbkę wraz z PBS do czystej szalki hodowlanej P 100. Używając sterylnych narzędzi, przenieś tkankę do drugiej, suchej i czystej szalki hodowlanej P 100.Pokrój tkankę na fragmenty o powierzchni 0,5 cm² i przenieś każdy z nich do oddzielnej płytki P 100. Kontynuuj krojenie tkanki na fragmenty o powierzchni mniejszej niż 1 mm². Następnie dodaj 20 ml pożywki INOF GM i inkubuj. Monitoruj wzrost komórek za pomocą mikroskopii fazowej.Należy potwierdzić, że komórki przyległy do naczynia w ciągu 24 godzin. Wzrost komórek należy monitorować za pomocą mikroskopii fazowej. Komórki zazwyczaj przylegają do naczynia w ciągu 24 godzin. Po tygodniu należy usunąć wszelkie nieprzylegające tkanki poprzez aspirację, uzupełnić medium, a następnie dokarmiać kultury dwa razy w tygodniu przez okres od jednego do trzech tygodni, aż kolonie komórek osiągną wielkość około 500 mikronów.Wyizolować klony za pomocą trypsyny i powlekanych dysków do klonowania. W celu potwierdzenia 100% obecności komórek fibroblastycznych, wysiać próbkę linii komórkowej na szkiełka podstawowe i przeprowadzić barwienie immunofluorescencyjne dla markera fibroblastycznego, markera nabłonkowego oraz markera komórek śródbłonka.Na jeden dzień przed transdukcją retrowirusową przejścia H Turt, izolaty prawidłowych fibroblastów jajnika przenosi się z jednej szalki P 100 do trzech szalek P 100. Gotowy nadsącz wirusowy można zakupić lub przygotować we własnym zakresie, stosując standardowe protokoły kotransfekcji komórek HEC 2 9 3 T. Aby przygotować roztwór poly Hema, odważyć 1,5 grama poly hema i umieścić w sterylnej butelce.Dodać 95 ml etanolu absolutnego klasy do biologii molekularnej oraz pięć ml destylowanej wody klasy do hodowli komórkowych. Umieścić roztwór poly HEMA w kąpieli wodnej w temperaturze 65 °C aż do całkowitego rozpuszczenia. Pokryć naczynia do hodowli tkanek świeżo przygotowanym roztworem poly HEMA.Osusz naczynia hodowlane wewnątrz komory z laminarnym przepływem powietrza. W celu zapewnienia równomiernej powłoki w przypadku większych naczyń lub kolb można zastosować delikatne kołysanie na platformie kołyszącej. Jeśli roztwór polyus wyschnie zbyt szybko, powierzchnia nie będzie gładka.W razie potrzeby przeprowadź obróbkę wstępną fibroblastów przed hodowlą 3D; na przykład w celu indukcji starzenia komórkowego poddaj komórki działaniu subletalnych dawek nadtlenku wodoru. Odzyskaj i namnóż hodowle komórek INOF oraz komórek nabłonkowych in vitro, aby przygotować odpowiednią liczbę komórek do utworzenia heterotopowych steroidów 3D. Po pięciominutowym płukaniu w PBS dodaj 15 ml pożywki do płytki z poly hema.W międzyczasie dodaj trypsynę do unieśmiertelnionych normalnych fibroblastów jajnika, aby odlepić je od naczynia hodowlanego. Po trzech do pięciu minutach zneutralizuj trypsynę równą objętością pożywki hodowlanej i zbierz komórki poprzez wirowanie. Resuspenduj osad komórkowy w pięciu mililitrach pożywki i dokładnie wymieszaj, pipetując w górę i w dół lub delikatnie mieszając na wstrząsarce vortex.Następnie należy pobrać 10 µL próbki w celu wyliczenia liczby żywych komórek przy użyciu błękitu trypanowego. Teraz dodaj 4 miliony komórek INOF do pożywki wcześniej naniesionej na płytkę powlekoną poly-HEMA. Uzupełnij objętość pożywki hodowlanej do 20 mL i inkubuj w temperaturze 37 °C, w atmosferze 5% CO2.Monitoruj agregację komórek w wielokomórkowe sferoidy za pomocą mikroskopii fazowej, aby dokarmiać hodowle sferoidów co dwa do trzech dni. Ustaw płytki pod kątem, opierając je o pipetę. Pozostaw sferoidy do osadzenia i ostrożnie usuń około 16 ml zużytej pożywki za pomocą pipety 5 ml.W siódmym dniu dodaj do hodowli 16 mililitrów świeżej pożywki i przenieś ją z powrotem do inkubatora. Utwórz hodowle heterotypowe, dodając komórki nabłonkowe do fibroblastów phe. Najpierw, po policzeniu komórek, przygotuj zawiesiny komórek nabłonka jajnika za pomocą trypsyny, zgodnie z wcześniejszym opisem.Przemyj raz w pożywce INOF GM, aby zapobiec przeniesieniu czynników wzrostu z pożywek do hodowli nabłonkowych. Po uzupełnieniu pożywki w hodowlach OID fibroblastów, dodaj komórki nabłonkowe w stosunku czterech fibroblastów na jedną komórkę nabłonkową. Heterotopowe OID w pożywce INOF GM należy dokarmiać typowo co dwa do trzech dni przez kolejne 14 dni.W celu przeprowadzenia immunohistochemii utrwalić PHE w neutralnym buforowanym formalinie, odwirirmek PHE i zastąpić formalinę 70% etanolem. Następnie przetworzyć tkankę do parafiny, stosując standardowe protokoły wykorzystywane dla tkanek ludzkich. Steroidy zatopione w parafinie można kroić i barwić H&E lub specyficznymi markerami molekularnymi przy użyciu immunohistochemii.Alternatywnie sterydy należy przemyć w PBS i utrwalić w 4% paraformaldehydzie. Następnie próbki należy zatopić w medium OCT i zamrozić gwałtownie w celu wykonania cięć na kriostacie oraz barwienia immunofluorescencyjnego do analizy metodą cytometrii przepływowej. Sterydy należy przemyć w PBS i dysocjować poprzez trawienie trypsyną lub Accutanem w temperaturze 37 °C.Pełną dysocjację steroidów do postaci pojedynczej zawiesiny komórek można wspomóc poprzez pipetowanie roztworu w górę i w dół za pomocą końcówki do pipety o pojemności 1 ml. Należy uważać, aby nie doprowadzić do nadmiernego obciążenia komórek. Reakcję należy zneutralizować równą objętością pożywki hodowlanej, a agregaty komórkowe usunąć, przepuszczając zawiesinę przez sitko komórkowe o oczkach od 40 do 70 µm. Następnie należy zcentryfugować komórki, przemyć je PBS, przeprowadzić zliczanie, a po zawieszeniu pożądanej liczby komórek w buforze fiksacyjnym, przeprowadzić barwienie zgodnie z instrukcjami producenta. W naszym laboratorium wykorzystaliśmy częściowo przekształcone komórki nabłonka jajnika i hodowaliśmy je wspólnie z normalnymi oraz starzejącymi się fibroblastami jajnika, aby naśladować wczesne stadium rozwoju raka jajnika.W jajniku kobiety przed menopauzą barwienie immunofluorescencyjne zimmortalizowanych prawidłowych fibroblastów jajnika h hert wykazało, że zarówno pierwotne prawidłowe fibroblasty jajnika, jak i zimmortalizowane prawidłowe fibroblasty jajnika wykazują ekspresję białka specyficznego dla fibroblastów, lecz nie wykazują ekspresji cytokeratyny siedem i wykazują ekspresję vimentyny. Prawidłowe komórki fibroblastów jajnika hodowane samodzielnie w 3D w formie PHE wykazują morfologię wrzecionowatą i obfitą macierz pozakomórkową. W niniejszym doświadczeniu prawidłowe fibroblasty jajnika poddano działaniu nadtlenku wodoru w celu indukcji starzenia przez siedem dni, a następnie hodowano z częściowo transformowanymi komórkami nabłonka jajnika przez 14 dni.Aby rozróżnić dwa typy komórek, uzyskane sferoidy poddano immunobarwieniu na Ki67 jako marker proliferacji oraz pan-cytokeratynę jako marker nabłonkowy. Ilościowa analiza danych sugeruje, że starzejące się mikrośrodowisko promuje cechy neoplastyczne częściowo przekształconych komórek nabłonkowych, podczas gdy prawidłowe mikrośrodowisko hamuje progresję neoplastyczną; przywrócone zostają cechy histologiczne komórek prawidłowych i złośliwych, których nie można wykryć podczas hodowli komórek w monowarstwie. Przykładowo, po przejściu komórek do hodowli sferoidalnej, cechy histologiczne jasnokomórkowego raka jajnika można wykryć w hodowlach 3D linii komórkowych jasnokomórkowego raka jajnika, ale nie w hodowlach monowarstwowych tych samych komórek.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak przygotować trójwymiarowe kultury typiczne, służące do badania oddziaływań między komórkami nabłonkowymi a zrębowymi podczas wczesnej kancerogenezy. Podczas przygotowywania hodowli 3D ważne jest dostosowanie liczby komórek do planowanego zastosowania, z uwzględnieniem pewnych strat materiału podczas przetwarzania.Po opanowaniu tej procedury, hodowle 3D można przygotować w ciągu jednej godziny. W celu analizy globalnych zmian w ekspresji genów, które występują w typowych hodowlach 3D, a nie są wykrywane w warunkach hodowli monowarstwowej, można zastosować inne metody, takie jak cytometria przepływowa w połączeniu z profilowaniem mikromacierzy ekspresji genów. Pozwoli to na przeanalizowanie dwukierunkowych szlaków sygnałowych występujących specyficznie w mikrośrodowisku hodowli rdzeniowej 3D.

heterotypic-three-dimensional-vitro-modeling-stromal-epithelial

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Heterotypowe trójwymiarowe in vitro modelowanie interakcji stroma-epitelium podczas inicjacji i postępu raka jajnika

Opisany tutaj test oczyszczania mezotelium wykorzystuje komórki znakowane fluorescencyjnie oraz mikroskopię wideo poklatkową do wizualizacji i ilościowego pomiaru interakcji między wielokomórkowymi sferoidami raka jajnika a monowarstwami komórek mezoteliów. Test ten modeluje wczesne etapy przerzutowania raka jajnika.

Test oczyszczania mezotelialnego in vitro modelujący wczesne etapy przerzutowania raka jajnika

W tym filmie demonstrujemy rozwój trójwymiarowego modelu in vitro wyściółki jamy otrzewnej. Ta kultura organotypowa może pomóc w badaniu adhezji, inwazji i proliferacji komórek raka jajnika.

Modelowanie przerzutów raka jajnika w błonie śluzowej jamy otrzewnej: metoda tworzenia modelu 3D wyściółki otrzewnej in vitro

Tutaj prezentujemy protokół do ko-hodowli w trzech wymiarach, który jest przydatny do badania interakcji wielokomórkowych i zależnej od macierzy zewnątrzkomórkowej modulacji zachowania komórek rakowych. W tym eksperymentalnym modelu komórki rakowe są hodowane na żelach kolagenowych osadzonych w ludzkich fibroblastach związanych z rakiem.

Trójwymiarowy model kokultury dla interakcji guz-zręb

Tutaj prezentujemy protokół do budowy trójwymiarowego modelu in vitro wyściółki jamy otrzewnej, składającego się z pierwotnych ludzkich komórek międzybłonka i fibroblastów pokrytych macierzą zewnątrzkomórkową, jako narzędzie do badania adhezji, inwazji i proliferacji komórek raka jajnika.

Modelowanie wczesnych etapów rozsiewu raka jajnika w organotypowym posiewie ludzkiej jamy otrzewnowej

Pokazujemy metodę generowania 3D surogatek raka piersi, które mogą być hodowane za pomocą systemu bioreaktora perfuzyjnego do dostarczania tlenu i składników odżywczych. Po wzroście surogaty są utrwalane i przetwarzane na parafinę w celu oceny parametrów będących przedmiotem zainteresowania. Wyjaśniono ocenę jednego z takich parametrów, gęstości komórek.

Przygotowanie i analiza trójwymiarowych substytutów raka piersi in vitro

Aby zbadać progresję guza jajnika w fizjologicznie istotnym modelu, wielokomórkowe sferoidy zostały wyhodowane w mikrourządzeniu pod symulowanym przepływem płynu. Ten dynamiczny model 3D emuluje środowisko wewnątrzotrzewnowe z komponentami komórkowymi i mechanicznymi, w których dochodzi do przerzutów raka jajnika.

Modelowanie wielokomórkowego zachowania sferoidalnego raka jajnika w dynamicznym mikrourządzeniu otrzewnowej 3D

Komórki macierzyste raka jajnika (OCSC) są odpowiedzialne za inicjację, nawrót, oporność terapeutyczną i przerzuty. Uważa się, że nisza naczyniowa OCSC sprzyja samoodnowie OCSC, co prowadzi do chemooporności. Protokół ten stanowi podstawę do ustanowienia odtwarzalnego modelu niszy naczyniowej OCSC in vitro.

Ocena właściwości angiogenetycznych komórek macierzystych podobnych do raka jajnika przy użyciu trójwymiarowego systemu kohodowli, NICO-1

Ten protokół opisuje ustanowienie trójwymiarowego (3D) modelu ex vivo interakcji komórka rakowa - sieć komórkowa. Model ten stanowi platformę do wyjaśnienia mechanizmów pronowotworowych w niszy tkanki tłuszczowej oraz do testowania nowych terapii.

Model ex vivo przerzutów do otrzewnej raka jajnika z wykorzystaniem ludzkiej sieci

Istnieje krytyczna potrzeba modeli 3D raka, które rejestrują przesłuchy heterokomórkowe do badania przerzutów nowotworowych. Nasze badanie przedstawia wytwarzanie heterowielokomórkowego nabłonka podścielisko-podścieliskowego w środowisku wolnym od rusztowań i rusztowań, które można wykorzystać do badania inwazji i przestrzennych rozkładów komórkowych.

Heterowielokomórkowe komórki zrębu w wolnych od rusztowań hodowlach 3D nabłonkowych komórek nowotworowych w celu napędzania inwazji

Protokół ten szczegółowo opisuje opracowanie wysokostopieńskich modeli mysich raka surowicy (HGSOC) in vitro oraz in vivo. Od wyprowadzenia myszych jajowodów, ich modyfikacji genetycznej w celu powtórzenia genetyki ludzkiego HGSOC, aż po ich wprowadzenie do kaletki jajnikowej myszy syngenetycznych w celu in vivo rozwoju guzów.

Rozwój linii organoidalnych pochodzących z myszy z komórek nabłonkowych jajowodów do modelowania wysokopoziomowego surowiczego raka jajnika

Poznaj metodę tworzenia trójwymiarowych heterotypowych modeli raka jajnika z komórek nabłonkowych i zrębowych. Ta technika pozwala badać interakcje komórkowe inicjujące nowotwór.

Heterotypowe trójwymiarowe modelowanie in vitro oddziaływań stropowo-nabłonkowych podczas inicjacji i progresji raka jajnika

Przeglądaj więcej filmów