Heterotypowe trójwymiarowe modelowanie in vitro interakcji zrębowo-nabłonkowych podczas inicjacji i progresji raka jajnika

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wygenerowanie trójwymiarowych typowych modeli rozwoju raka jajnika we wczesnym stadium. Po pierwsze, wygeneruj unieśmiertelnione linie komórkowe H. turt pochodzące z pierwotnych, normalnych tkanek nabłonka jajnika i fibroblastów. Następnie, aby odtworzyć architekturę in vivo i złożone interakcje komórek komórkowych obecne w kohodowli jajników, linie komórek nabłonkowych i zrębowych w trójwymiarowych modelach sferoidalnych S przystępują do utrwalania i barwienia kultur organoidów oraz analizy ekspresji określonych markerów w celu zbadania cech molekularnych interakcji nabłonka zrębu.

Uzyskane wyniki pokazują, w jaki sposób zmiany w przedziale komórek zrębu typowych modeli 3D mogą wpływać na fenotyp komórek nabłonkowych hodowanych w ko. Trójwymiarowe modele typowe mogą pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie badań nad rakiem jajnika, takie jak badanie pochodzenia tej choroby i wyjaśnienie roli mikrośrodowiska zrębu w inicjacji i rozwoju nowotworu. Zastosowania tych technik obejmują diagnostykę i terapię chorób w porównaniu z innymi metodami hodowli 3D.

Technika ta może być stosowana do szerszego zakresu objętości kultur komórkowych i dalszych zastosowań. Na przykład hodowle homo i typowe 3D mogą być wykorzystywane do testowania leków in vitro. Podejście to można również zastosować do innych systemów modelowych, takich jak badanie innych typów guzów litych lub w łagodnej chorobie

Przetransportuj świeżą tkankę jajnika do laboratorium hodowli komórkowych w unieśmiertelnionej pożywce wzrostowej fibroblastów jajników uzupełnionej dodatkowymi antybiotykami i lekami. Umyj próbkę trzykrotnie pięcioma mililitrami PBS, aby usunąć wszelkie komórki nabłonka, które pozostają luźno przyczepione do tkanki. Następnie przenieś próbkę wraz z PBS do czystego naczynia hodowlanego P 100 Za pomocą sterylnych narzędzi przenieś tkankę do drugiego suchego naczynia do hodowli P 100.

Pokrój chusteczkę na kawałki o powierzchni 0,5 centymetra kwadratowego i przenieś każdy kawałek do osobnego naczynia P 100. Kontynuuj krojenie tkanki na kawałki o wielkości mniejszej niż jeden milimetr kwadratowy. Następnie dodaj 20 mililitrów pożywki INOF GM i monitoruj hodowlę komórek za pomocą mikroskopii fazowej.

Upewnij się, że komórki przylegają do naczynia w ciągu 24 godzin. Monitoruj wzrost komórek za pomocą mikroskopii fazowej Komórki zwykle przylegają do naczynia w ciągu 24 godzin Po tygodniu. Usuń wszelkie nieprzylegające tkanki przez aspirację, uzupełnij pożywkę, a następnie ponownie podawaj kultury dwa razy w tygodniu w ciągu jednego do trzech tygodni, gdy kolonie komórkowe mają wielkość około 500 mikronów.

Wyizoluj klony za pomocą tripów i powlekanych dysków klonowania. W celu potwierdzenia 100% komórek fibroblastycznych. Umieść próbkę linii komórkowej na szklanych szkiełkach nakrywkowych i wykonaj barwienie immunofluorescencyjne w poszukiwaniu markera fibroblastycznego, markera nabłonkowego i markera komórek śródbłonka.

Na dzień przed transdukcją retrowirusową pasażu H. Turta, normalna komórka fibroblastów jajnika izoluje się z pojedynczej szalki P 100 na trzy szalki P 100. Gotowy wirusowy sup natan można kupić lub wyprodukować we własnym zakresie przy użyciu standardowych protokołów transfekcji limfocytów T HEC 2 9 3. Aby przygotować roztwór poly hema, odważ 1,5 grama poly hema i umieść w sterylnej butelce.

Dodaj 95 mililitrów biologii molekularnej, gatunku, absolutnego etanolu i pięć mililitrów wody destylowanej do hodowli komórkowych. Umieść roztwór poly Hema w łaźni wodnej o temperaturze 65 stopni Celsjusza, aż do całkowitego rozpuszczenia. Posmaruj naczynia z kulturami tkankowymi świeżo przygotowanym roztworem poly Hema.

Wysuszyć na powietrzu naczynia do hodowli komórkowych wewnątrz okapu z przepływem laminarnym. Delikatne kołysanie na bujanej platformie może być stosowane w celu zapewnienia równomiernego pokrycia naczyń lub kolb o większych rozmiarach. Jeśli roztwór poliusu wyschnie zbyt szybko, powierzchnia nie będzie gładka.

W razie potrzeby wstępnie potraktuj fibroblasty przed hodowlą 3D, na przykład w celu indukcji starzenia, wstępnie potraktuj komórki subletalnymi dawkami nadtlenku wodoru. Odzyskaj i rozszerz INOF i hodowle komórek nabłonkowych in vitro, aby przygotować wystarczającą liczbę komórek do ustanowienia steroidów heterotopowych 3D. Po pięciominutowym myciu PBS dodaj 15 mililitrów podłoża do płytki poly hema.

W międzyczasie dodaj trypsynę do unieśmiertelnionych normalnych komórek fibroblastów jajnika, aby odłączyć je od naczynia hodowlanego. Po trzech do pięciu minutach zneutralizuj trypsynę równą objętością pożywki hodowlanej i zbierz komórki przez odwirowanie. Ponownie zawiesić osad komórkowy w podłożu o pojemności pięciu mililitrów i dobrze wymieszać, pipetując w górę iw dół lub delikatnie wirując.

Następnie użyj próbki o wielkości 10 mikrolitrów, aby policzyć żywotne komórki za pomocą błękitu trianowego. Teraz dodaj 4 miliony komórek INOF do podłoża już dozowanego do płytki pokrytej polihemą. Uzupełnić objętość pożywki hodowlanej do 20 mililitrów i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla.

Monitoruj agregację komórkową do wielokomórkowego steroidu za pomocą mikroskopii fazowej, aby ponownie zasilać kultury sferoidalne S co dwa do trzech dni. Ułóż płytki pod kątem na pipecie. Poczekaj, aż sferoidy osiądną i ostrożnie usuń około 16 mililitrów wyczerpanego podłoża za pomocą pięciomililitrowej pipety.

Dodaj 16 mililitrów świeżej pożywki do kultury i wróć do inkubatora Siódmego dnia. Twórz heterotypowe kultury, dodając komórki nabłonkowe do fibroblastów phe. Najpierw przygotuj zawiesiny komórek nabłonka jajników za pomocą trypsyny, jak opisano wcześniej po zliczeniu komórek.

Umyć raz w pożywce INOF GM, aby zapobiec przenoszeniu jakichkolwiek czynników wzrostu z nabłonkowej pożywki wzrostowej. Po uzupełnieniu pożywki kultur OID fibroblastów, dodać komórki nabłonkowe w stosunku cztery do jednego fibroblastów do hodowli komórek nabłonkowych. Heterotopowe OID w INOF GM dokarmiają typowe kultury co dwa do trzech dni przez dodatkowe 14 dni.

Do celów immunohistochemicznych utrwal PHE za pomocą obojętnej buforowanej forminy, otocz PHE i zastąp formalinę 70% etanolem. Przystąp do przetworzenia na parafinę przy użyciu standardowych protokołów stosowanych w przypadku tkanek ludzkich. Steroidy osadzone w parafinie mogą być cięte i barwione h i e specyficznych markerów molekularnych przy użyciu chemii immunohistycznej.

Alternatywnie, umyj sterydy w PBS i utrwal w 4% para formaldehydu. Następnie zanurz próbki w pożywce OCT i zamroź błyskawicznie w celu przecięcia kriostatu i barwienia immunofluorescencyjnego do analizy za pomocą cytometrii przepływowej. Umyj sterydy w PBS i dysocjuj przez trypsynę lub trawienie Accutane w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Całkowita dysocjacja sterydów w zawiesinę jednokomórkową może być promowana przez pipetowanie roztworu w górę iw dół za pomocą jednomililitrowej końcówki pipety. Uważaj, aby nie przewymiarować komórek, zneutralizować reakcję równą objętością pożywki hodowlanej i usunąć grudki komórek, przepuszczając zawiesinę przez sitko komórkowe o wielkości od 40 do 70 mikronów. Następnie osadzać komórki i przemywać PBS i wyliczać, ponownie zawiesić żądaną liczbę komórek w buforze faktów i barwieniu zgodnie z instrukcjami producenta W naszym laboratorium częściowo przekształciliśmy komórki nabłonka jajników i wspólnie wyhodowaliśmy te komórki z prawidłowym i starczym fibroblastem jajnika, aby naśladować rozwój raka jajnika we wczesnym stadium.

W jajniku przed menopauzą Barwienie immunofluorescencyjne normalnych fibroblastów jajnika pokazuje, że zarówno pierwotne normalne fibroblasty jajnika, jak i unieśmiertelnione normalne fibroblasty jajnika wykazują ekspresję białka specyficznego dla fibroblastów, ale nie wyrażają cytokeratyny siedem i nie wyrażają mentonu. Normalne komórki fibroblastów jajnika hodowane samodzielnie w formie 3D PHE wykazują wrzecionowatą morfologię i obfitą macierz zewnątrzkomórkową. W tym przypadku normalne fibroblasty jajników wystawiono na działanie nadtlenku wodoru w celu wywołania starzenia się w ciągu siedmiu dni, a następnie hodowano je z częściowo przekształconymi komórkami nabłonka jajnika przez 14 dni.

Aby odróżnić te dwa typy komórek, otrzymane steroidy wybarwiono immunologicznie dla mim one jako markera proliferacji i cytokeratyny pan jako markera nabłonkowego. Kwantyfikacja danych sugeruje, że starzejące się mikrośrodowisko sprzyja cechom nowotworowym częściowo przekształconych komórek nabłonkowych, podczas gdy normalne mikrośrodowisko hamuje postęp nowotworu, cechy histologiczne normalnych i złośliwych komórek, które nie są wykrywalne, gdy komórki są hodowane w miarę przywracania monowarstw. Na przykład, gdy komórki są przenoszone do hodowli sferoidalnej, cechy histologiczne jasnokomórkowego raka jajnika można wykryć w hodowlach 3D linii komórkowych jasnokomórkowego raka jajnika, ale nie w jednowarstwowych hodowlach tych samych komórek.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak skonfigurować trójwymiarowe typowe kultury, za pomocą których można badać interakcje między komórkami nabłonkowymi i zrębowymi. Podczas wczesnej genezy nowotworu. Podczas ustawiania hodowli 3D ważne jest, aby dostosować liczbę komórek do dalszej aplikacji, co pozwala na pewne straty materiału podczas przetwarzania.

Po opanowaniu hodowle 3D można skonfigurować w ciągu jednej godziny, postępując zgodnie z tą procedurą. Inne metody, takie jak cytometria przepływowa w połączeniu z profilowaniem mikrorentgenowskim ekspresji genów, mogą być wykonywane w celu analizy globalnych zmian ekspresji genów, które występują w typowych kulturach 3D, ale nie są wykrywane w warunkach hodowli jednowarstwowej. Umożliwi to analizę dwukierunkowych ścieżek sygnałowych, które występują specyficznie w kulturze rdzeniowej 3D. Mikrośrodowisko.