Decelularyzacja kompleksu krążeniowo-oddechowego: technika decelularyzacji serca i płuc na podstawie modelu mysiego

Decelularyzacja pozbawia narządy ich składników komórkowych, pozostawiając nienaruszoną strukturę ECM. Pomaga to w zachowaniu architektury 3D narządów. W celu przeprowadzenia procedury decelularyzacji należy umieścić uśpioną mysz w pozycji leżącej. Wypreparuj mysz i odsłoń kompleks krążeniowo-oddechowy.

Podwiązywać wszystkie główne naczynia wychodzące z serca z wyjątkiem aorty i głównych naczyń krążenia płucnego. Ten krok zapobiega wyciekowi płynu podczas późniejszej procedury perfuzji. Utwórz otwór w tchawicy i wprowadź cewnik przez ten otwór. Cewnikować aortę zstępującą od dołu, aż cewnik dotrze do łuku aorty.

Zszyj cewniki, aby zabezpieczyć ich pozycję i podłącz je do pompy perfuzyjnej. Rozpocznij perfuzję wodą dejonizowaną. Perfuzja przez aortę umożliwia sprawne usunięcie krwi z całego naczynia krwionośnego serca. W końcu woda dostaje się do tętnicy płucnej prowadzącej do płuc.

Po całkowitym usunięciu krwi z układu naczyniowego płuc zatrzymaj perfuzję wody i zastąp ją różnymi roztworami detergentów, od łagodnych do silnych. Ta procedura powoduje lizę komórek uwalniających składniki wewnątrzkomórkowe, dzięki czemu serce i płuca wydają się przezroczyste.

Ponownie przetopić wodą dejonizowaną, aby usunąć wszelkie pozostałe cząsteczki detergentu. Przechowuj bezkomórkowy kompleks krążeniowo-oddechowy w roztworze zawierającym antybiotyk, co zapewnia długi okres przydatności do spożycia.

Zacznij od ogolenia klatki piersiowej, brzucha i pleców uśpionej myszy za pomocą maszynki do strzyżenia włosów. Zdezynfekuj obszar 70% etanolem. Następnie przypnij mysz do styropianowej tacy, wysuwając jej przednie i tylne kończyny, a także głowę i ogon. Umieść go pod mikroskopem mikrochirurgicznym.

Za pomocą nożyczek Mayo z prostym wzorem wykonaj nacięcie skóry biegnące od okolicy podżuchwowej do dolnej części brzucha i wypreparuj podskórnie, aby odsłonić ścianę klatki piersiowej i otrzewną. Następnie za pomocą nożyczek mikrochirurgicznych przeciąć mięśnie piersiowe większe i piersiowe mniejsze wzdłuż szóstej przestrzeni międzyżebrowej po obu stronach ściany klatki piersiowej.

Przetnij mostek wzdłuż poprzednich nacięć nożyczkami o prostym wzorze. Następnie zakończ sternotomię, przecinając mostek wzdłuż jego długiej osi. Podnieś i przypnij obie strony ściany klatki piersiowej, aby odsłonić kompleks krążeniowo-oddechowy. Użyj mikrokleszczyków z okrągłą końcówką, aby wyciąć grasicę i otaczającą ją tkankę tłuszczową, delikatnie ściągając je z przyczepów i przecinając przełyk mikronożyczkami.

Oddziel żyły ramienno-głowowe i tętnicę ramienno-głowową ostrymi mikrokleszkami. Następnie oddziel lewą tętnicę szyjną wspólną i lewą tętnicę podobojczykową od leżącej poniżej tkanki, aby ułatwić podwiązanie i kauteryzację. Użyj uchwytu na mikroigłę i ostrych mikrokleszczyków oraz szwu 9-0, aby umieścić szwy powyżej pojawienia się lewej tętnicy szyjnej ramienno-głowowej i lewej tętnicy podobojczykowej. Kauteryzuj żyły ramienno-głowowe.

Za pomocą mikronożyczek otwórz wejście, przecinając więzadło. Wprowadź cewnik o rozmiarze 27 do tchawicy i delikatnie wciskaj, aż tchawica rozgałęzi się do oskrzeli, uważając, aby nie uszkodzić oskrzeli. Za pomocą szwu 6-0 umieść trzy szwy wokół tchawicy, aby zabezpieczyć cewnik.

Przekrój mysz na wysokości 12. kręgu piersiowego. Aorta zstępująca biegnie do przodu kręgosłupa i powinna być tutaj przecięta wraz z kręgosłupem. Wstecznie cewnikuj aortę i wepchnij cewnik, aż dotrze do łuku aorty. Za pomocą szwu umieść cztery szwy wokół aorty, zaczynając 5 milimetrów poniżej końcówki cewnika.

Podłącz mysz do systemu pompowania za pomocą silikonowej rurki i dolnych złączy. Perfuzja z wodą dejonizowaną w ilości 200 mikrolitrów na minutę przez 15 minut. Następnie zmień środek perfuzyjny na 0,5% DOC rozcieńczony w wodzie dejonizowanej i perfuzuj przez noc. Następnego dnia zmień środek perfuzyjny na 0,1% SDS rozcieńczony w wodzie dejonizowanej i perfuzuj przez 8 godzin. Następnie perfuzjuj wodą dejonizowaną przez 24 godziny, aby zmyć SDS i DOC.

Wytnij pozbawione komórek serce i płuca, dzieląc ich przyczepy na klatkę piersiową. Przechowuj tkankę w sterylnej kriotubie w dejonizowanej wodzie z 1% penicyliną-streptomycyną i 0,3 mikromolowym azydkiem sodu w temperaturze 4 stopni Celsjusza.