Name: Decelularyzacja i recelularyzacja płuc naczelnych przy użyciu specjalistycznego bioreaktora wielkonarządowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-15T20:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 45 s
Description: Poznaj metodę decelularyzacji i recelularyzacji płuc naczelnych w bioreaktorze wielkonarządowym. Technika ta wykorzystuje komórki macierzyste i śródbłonkowe do inżynierii tkankowej płuc.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy pragną podziękować redakcji Tissue Engineering za zgodę na wykorzystanie zdjęć z poprzedniej publikacji w tym raporcie.

1. Decelularyzacja płuc makaków całoorganowych
<ol>
	<li>Przygotowanie roztworów
	<ol>
		<li>Autoklaw 10-15 L wody dejonizowanej (dH2O) w butelkach o pojemności 1-2 L.</li>
		<li>Przygotować "roztwór Triton" (0,1% Triton X-100 w dH2O), mieszając 1 ml Triton X-100 w 999 mldH2O, mieszając na mieszadle magnetycznym. Przefiltrować roztwór przez aparat filtrujący 0,22 μm. Przechowywać w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Przygotować "roztwór SDC" (2% SDC w dH2O), powoli dodając 20 g deoksycholanu sodu (SDC) do ~900 mldH 2O, mieszając. Po rozpuszczeniu SDC przenieść roztwór do cylindra miarowego i doprowadzić objętość do 1 ml za pomocądH2O. Przefiltrować roztwór przez aparat filtrujący 0,22 μm. Przechowywać w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Przygotować "roztwór NaCl", dodając 58 g NaCl do ~900 mldH2Oi mieszać aż do całkowitego rozpuszczenia. Dodać dH2O do końcowej objętości 1 l, przefiltrować i przechowywać w temperaturze pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie organów
	<ol>
		<li>Należy zachować najwyższą ostrożność, aby zapobiec przypadkom zakaźnego narażenia podczas pracy z tkankami makaka. Przed kontaktem z tkankami naczelnych należy założyć następujące środki ochrony osobistej (PPE): maskę chirurgiczną, osłonę twarzy, rękawice chirurgiczne, fartuch jednorazowy i drugą warstwę rękawic chirurgicznych.</li>
		<li>Pobrać nienaruszone bloki płucoserca z sekcji zwłok zwierząt w PBS zawierającym 50 j./ml heparyny, aby zapobiec krzepnięciu krwi zewnętrznej.</li>
		<li>Gdy płuca leżą płasko na tacy preparucyjnej, kaniuluj tętnicę płucną za pomocą żeńskiego łącznika Luer z odpowiednio dobranym zadziorem. Zamocuj kaniulę na miejscu za pomocą opaski zaciskowej wysterylizowanej alkoholem.</li>
		<li>Wsuń sterylną opaskę zaciskową wokół tchawicy, włóż żeńskie złącze Luer 0,250 cala do otworu tchawicy i zaciśnij opaskę zaciskową wokół zadzioru łącznika, aby utrzymać tchawicę na miejscu wokół zadzioru.</li>
		<li>Usunąć uwięzione powietrze z płuc, wkraplając PBS zawierający 30 j./ml heparyny i 5 μg/ml nitroprusydku sodu (SNP). Pozwól, aby roztwór został wydalony przez naturalny odrzut i powtórz wkraplanie jeszcze dwa razy. Po trzecim wkropleniu nakryj kaniulę Luer tchawicy zatyczką Luer, aby utrzymać roztwór w płucach.</li>
		<li>Odetnij wierzchołek serca i przepłucz wewnętrzne komory PBS-heparyną-SNP, aby usunąć resztki krwi. Uszkadnij oba przedsionki, aby ułatwić drenaż obwodów płucnych po perfuzji.</li>
		<li>Zanurzyć blok płuco-serce w dH2O. Napełnić strzykawkę o pojemności 60 ml roztworem PBS-heparyny-SNP. Za pomocą kleszczy zanurz kaniulę tętniczą tak, aby wszystkie pęcherzyki powietrza uciekły z otworu naczyniowego. Założyć strzykawkę i ostrożnie wyjąć tłok i pozwolić, aby płyn spłynął do układu krwionośnego.</li>
		<li>Wyjmij zatyczkę z kaniuli tchawicy i pozwól, aby płyn z dróg oddechowych został wydalony przez naturalny odrzut. Kontynuuj dodawanie roztworu PBS-heparyny-SNP do strzykawki podłączonej do kaniuli naczyniowej w celu utrzymania ciśnienia ~15-20 cm H2O powyżej tętnicy. Kontynuuj perfuzję, aż jak najwięcej krwi zostanie usunięte z naczyń płucnych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Decelularyzacja
	<ol>
		<li>Dzień 1: Zanurz blok płuco-serce w dH2O. Napompuj i ukrwij płuco za pomocą dH2O za pomocą strzykawek o pojemności 60 ml przymocowanych odpowiednio do zanurzonej tchawicy i kaniuli tętniczej. Powtórz płukanie dróg oddechowych i naczyń krwionośnych z dH2O 4 razy więcej, w sumie pięć płukań.</li>
		<li>Wyjmij płuca z wody i zanurz blok w roztworze Triton. Napompuj i przelej płuca roztworem Triton, tak jak poprzednio. Powtórzyć inkrapolację po raz drugi i inkubować zanurzone narządy w roztworze Trytona przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>DZIEŃ 2: Po całonocnej inkubacji usunąć blok płuc z roztworu Triton, przemyć zewnętrzniedH2O, a następnie zanurzyć blok w świeżymdH2O. Powtórzyć płukaniedH2O, jak w kroku 1.3.1.</li>
		<li>Usunąć płuca z dH2O i zanurzyć w roztworze SDC. Napompuj i przelej roztworem SDC w taki sam sposób, jak w kroku 1.3.2. Inkubować zanurzoną w roztworze SDC przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>DZIEŃ 3: Ponownie przemyć chusteczkę dH2O, jak w 1.3.1.</li>
		<li>Usunąć tkankę z dH2O i zanurzyć w roztworze NaCl. Napompować i perfekować roztworem NaCl w taki sam sposób, jak w kroku 1.3.2. Inkubować zanurzoną w roztworze NaCl przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Przemyć płuca z roztworu NaCl za pomocądH2O, jak w kroku 1.3.1.</li>
		<li>Przygotować świeży "roztwór DNazy" (30 μg/ml DNazy, 1,3 mMMgSO4, 2,0 mM CaCl2 wdH2O) Wykąpać płuca w tym roztworze i wkroplić do dróg oddechowych i naczyń krwionośnych, jak w kroku 1.3.2. Inkubować płuca w roztworze DNazy przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Przygotuj świeży "roztwór PBS" (1x PBS + 5x antybiotyk/antybiotyk). Usunąć płuca z roztworu DNazy i przemyć zewnętrznie roztworem PBS. Zanurzyć płuca w roztworze PBS i przemyć tym roztworem pięć razy, jak w kroku 1.3.1.</li>
		<li>Przechowywać płuca w roztworze PBS w szczelnie zamkniętym pojemniku przez noc w temperaturze 4 °C. Następnego dnia (DZIEŃ 4) przemyć płuca w świeżym, lodowatym roztworze PBS pięć razy, jak w kroku 1.3.1 i przechowywać w roztworze PBS w sterylnym, szczelnie zamkniętym pojemniku w temperaturze 4 °C do czasu użycia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Bioreaktor wielkonarządowy
<ol>
	<li>Montaż i instalacja tkanek
	<ol>
		<li>Z wyprzedzeniem zamontuj pętlę oddechową i struktury pętli naczyniowej, a także adaptery tchawicy i kaniul naczyniowych (ryc. 1). Z wyjątkiem sterylnie zapakowanych filtrów powietrza i portów strzykawkowych, wszystkie elementy bioreaktora należy sterylizować w autoklawie.</li>
		<li>Zamontuj elementy bioreaktora pod okapem z przepływem laminarnym zgodnie ze schematem na rysunku 2. Bezpośrednio przed użyciem w bioreaktorze napełnić główną komorę pożywką hodowlaną, która została zrównoważona z atmosferą 5% CO2 w inkubatorze do hodowli komórkowych.</li>
		<li>Zastosować adaptery kaniul tchawicy i naczyń krwionośnych do kaniul płuc i zainstalować narządy w głównej komorze bioreaktora, kąpiąc płuca w pożywce hodowlanej i podłączając adaptery kaniul do odpowiednich portów w zmodyfikowanej pokrywie. Po podłączeniu przymocuj pokrywę bezpiecznie i mocno; Komora nie zostanie ponownie otwarta na czas recelularyzacji.</li>
		<li>Napełnij zbiornik tchawicy mniej więcej do połowy pożywką hodowlaną i przymocuj zmodyfikowaną nakrętkę.</li>
		<li>Zastosuj sterylne filtry strzykawkowe 0,22 μm, zatyczki Luer i porty strzykawek do wszystkich komór, jak wskazano.</li>
		<li>Podłączyć zbiornik tchawicy do głównej komory za pomocą aparatu do pętli oddechowej. Zamocuj rurkę pętli oddechowej zgodnie z opisem.</li>
		<li>Zassać powietrze z rurki za pomocą otworów strzykawki i strzykawki o pojemności 60 ml wyposażonej w igłę 18 G; przesunąć kierunek 3-drogowych zaworów odcinających, aby skierować przepływ płynu do strzykawki.</li>
		<li>Przenieś szczelne, przylegające do siebie komory bioreaktora z zainstalowanymi narządami do inkubatora kultur tkankowych, aby zrównoważyć temperaturę i gaz. Przewietrzyć płuca za pomocą pompy strzykawkowej podłączonej do głównej komory przy ~1 pełnym "oddechu" co 2 minuty i perfekować naczynia krwionośne za pomocą pompy perystaltycznej z prędkością około 10 ml/min przez łącznie ~30 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wysiew w drogach oddechowych
	<ol>
		<li>Przygotuj zawiesiny komórek, które mają zostać wysiane do dróg oddechowych o pożądanej gęstości komórek (objętość będzie zależeć od wielkości narządu).</li>
		<li>Napompować płuca zawiesiną komórkową, delikatnie wstrzykując ją przez port strzykawki przymocowany do trójdrożnego zaworu odcinającego w pętli oddechowej.</li>
		<li>Utrzymuj płuca statycznie w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez noc bez perfuzji dróg oddechowych lub naczyń krwionośnych, aby umożliwić komórkom przyłączenie się do zdecelularizowanej macierzy płucnej.</li>
		<li>Po całonocnej inkubacji ponownie zainicjuj standardowy program wentylacji dróg oddechowych i hoduj narządy przez 3-7 dni (lub inny pożądany czas).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Siew naczyniowy
	<ol>
		<li>Przygotować zawiesiny hodowli komórek śródbłonka jak powyżej do wysiewu komórek dróg oddechowych.</li>
		<li>Przenieś zawiesinę komórkową do zbiornika wysiewu śródbłonka, który zawiera małe mieszadło magnetyczne.</li>
		<li>Zmienić kierunek drogi przepływu z komory głównej do śródbłonkowego zbiornika wysiewu, obracając zawór na kurku umieszczonym w rurce łączącej te dwie komory i stopniowo wysiewając komórki śródbłonka, delikatnie mieszając za pomocą pompy perystaltycznej.</li>
		<li>Po zakończeniu wysiewu (tj. objętość zawiesiny komórek śródbłonka jest wyczerpana w zbiorniku wysiewu śródbłonka), należy przerwać perfuzję i inkubować statycznie przez ~ 4-6 godzin. Ponownie zainicjuj perfuzję naczyniową za pomocą pożywki z głównej komory z szybkością ~ 10 ml / min (lub pożądanym ciśnieniem, jeśli jest monitorowane).</li>
		<li>Hodowla przez 3-7 dni z ciągłą perfuzją naczyniową.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Rozwiązywanie problemów i alternatywne podejścia
<ol>
	<li>Kanegulacja tchawicy: Szwy mogą być używane zamiast opaski zaciskowej, aby utrzymać kaniulę Luer na miejscu, jeśli tchawica jest zbyt mała. Żeńskie złącze Luer 1/4 cala działa jak kaniula wystarczająca dla szerokiego zakresu średnic tchawicy.</li>
	<li>Usuwanie krwi przez perfuzję tętnicy płucnej: Ponieważ tkanki są pobierane od zwierząt ze zwłokami, mikroskrzepliny są powszechne i uniemożliwiają całkowite oczyszczenie niektórych obszarów łożyska naczynia włosowatego płuc z resztek krwi. Jednak podczas decelularyzacji te małe naczynia stają się przepuszczalne, a odczynniki do decelularyzacji skutecznie lizują i degradują te skrzepy. Perfuzję predecelularyczną należy wykonać w celu usunięcia jak największej ilości krwi, ale nie jest konieczne usuwanie wszystkich śladów krwi z miąższu.</li>
	<li>Wydalanie płynów z płuc: Płuca makaków zachowują silny naturalny odrzut ex vivo, nawet gdy są napompowane płynami. Jednak podczas decelularyzacji komórki ulegają lizie i uwalniają materiały (w tym DNA), które zwiększają lepkość wkraplanych płynów, utrudniając w ten sposób ich wydalenie. Nocna inkubacja w temperaturze 4 °C, gdy jest zanurzona w wkraplanym płynie, jest zwykle wystarczająca, aby umożliwić płucom całkowite wydalenie lepkiego płynu. Alternatywnie, pozwolić, aby jak najwięcej płynu zostało wydalone z płuc, a następnie przystąpić do wkraplania kolejnych roztworów; Dodanie detergentów i płynów do mycia wodą dejonizowaną zwykle ułatwia usuwanie lepkich płynów i umożliwia sprawny przebieg decelularyzacji.</li>
	<li>Dodawanie antybiotyków do roztworów detergentów: Antybiotyki i środki przeciwgrzybicze mogą być dodawane do roztworów do płukania wody dejonizowanej, jak również do roztworów detergentów; jednak penicylina/streptomycyna wytrąca się w obecności deoksycholanu sodu, a osady te mogą zakłócać procesy decelularyzacji i mycia. Co więcej, obecność antybiotyków/leków przeciwgrzybiczych nie jest konieczna podczas decelularyzacji, ponieważ detergenty stosowane w tych stężeniach są w stanie lizować i zabijać drobnoustroje. Po decelularizacji płukanie i przechowywanie roztworem PBS (zawierającym 5x penicylinę/streptomycynę/amfoterycynę B) jest wystarczające, aby zapobiec większości zanieczyszczeń.</li>
	<li>Usuwanie powietrza z rurki bioreaktora: Powietrze jest skutecznie zasysane z rurki bioreaktora za pomocą strzykawki z igłą włożoną do portów igieł w trójdrogowych kurkach. Alternatywnie, 1x PBS lub pożywkę hodowlaną można przepłukać przez rurkę przed zainstalowaniem narządów za pomocą strzykawki podłączonej w ten sam sposób.</li>
	<li>Wentylacja i perfuzja płuc w trakcie i po recelularyzacji: Chociaż natężenia i czasy przepływu wymienione w tym raporcie były wystarczające do przyłączenia komórek, a także wentylacji płynem w drogach oddechowych i perfuzji naczyniowej, wartości te powinny być określone empirycznie przez użytkownika. Czas hodowli można również dostosować w oparciu o tempo wzrostu wkroplonych komórek.</li>
</ol>

<ol><li>Ott, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfusion-decellularized+matrix%3A+using+nature%27s+platform+to+engineer+a+bioartificial+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart.</a> Nat. Med. 14, 213-221 (2008).</li>
<li>Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-organ+tissue+engineering%3A+decellularization+and+recellularization+of+three-dimensional+matrix+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Whole-organ tissue engineering: decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds.</a> Annu. Rev. Biomed. Eng. 13, 27-53 (2011).</li>
<li>Ott, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+and+orthotopic+transplantation+of+a+bioartificial+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung.</a> Nat. Med. 16, 927-933 (2010).</li>
<li>Price, A. P., England, K. A., Matson, A. M., Blazar, B. R., Panoskaltsis-Mortari, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+decellularized+lung+bioreactor+system+for+bioengineering+the+lung%3A+the+matrix+reloaded%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Development of a decellularized lung bioreactor system for bioengineering the lung: the matrix reloaded.</a> Tissue Eng. Part A. 16, 2581-2591 (2010).</li>
<li>Petersen, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+lungs+for+in+vivo+implantation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered lungs for in vivo implantation.</a> Science. 329, 538-541 (2010).</li>
<li>Song, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+in+vivo+function+of+bioartificial+lungs+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Thorac.+Surg%22%5BJournal%5D)">Enhanced in vivo function of bioartificial lungs in rats.</a> Ann. Thorac. Surg. 92, 998-1005 (2011).</li>
<li>Seok, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+responses+in+mouse+models+poorly+mimic+human+inflammatory+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Genomic responses in mouse models poorly mimic human inflammatory diseases.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , (2013).</li>
<li>Joag, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primate+models+of+AIDS%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+Infect%22%5BJournal%5D)">Primate models of AIDS.</a> Microbes Infect. 2, 223-229 (2000).</li>
<li>Hu, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-human+primate+models+for+AIDS+vaccine+research%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Drug.+Targets+Infect.+Disord%22%5BJournal%5D)">Non-human primate models for AIDS vaccine research.</a> Curr. Drug. Targets Infect. Disord. 5, 193-201 (2005).</li>
<li>Borda, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+and+immunopathologic+alterations+in+rhesus+macaques+affected+with+globoid+cell+leukodystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Clinical and immunopathologic alterations in rhesus macaques affected with globoid cell leukodystrophy.</a> Am. J. Pathol. 172, 98-111 (2008).</li>
<li>Fabbrini, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+response+to+high-carbohydrate+and+low-carbohydrate+meals+in+a+non-human+primate+model%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Endocrinol.+Metab%22%5BJournal%5D)">Metabolic response to high-carbohydrate and low-carbohydrate meals in a non-human primate model.</a> Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. , (2012).</li>
<li>Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+tissue+and+whole+organ+decellularization+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">An overview of tissue and whole organ decellularization processes.</a> Biomaterials. 32, 3233-3243 (2011).</li>
<li>Calle, E. A., Petersen, T. H., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Procedure+for+Lung+Engineering%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Procedure for Lung Engineering.</a> J. Vis. Exp. (49), e2651(2011).</li>
<li>Arold, S. P., Wong, J. Y., Suki, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+a+new+stretching+apparatus+and+the+effects+of+cyclic+strain+and+substratum+on+mouse+lung+epithelial-12+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Design of a new stretching apparatus and the effects of cyclic strain and substratum on mouse lung epithelial-12 cells.</a> Ann. Biomed. Eng. 35, 1156-1164 (2007).</li>
<li>Huang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+from+embryonic+stem+cells+to+vascular+wall+cells+under+in+vitro+pulsatile+flow+loading%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Artif.+Organs%22%5BJournal%5D)">Differentiation from embryonic stem cells to vascular wall cells under in vitro pulsatile flow loading.</a> J. Artif. Organs. 8, 110-118 (2005).</li>
<li>Izadpanah, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+multipotent+mesenchymal+stem+cells+from+the+bone+marrow+of+rhesus+macaques%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Characterization of multipotent mesenchymal stem cells from the bone marrow of rhesus macaques.</a> Stem Cells Dev. 14, 440-451 (2005).</li>
<li>Craig, L. E., Nealen, M. L., Strandberg, J. D., Zink, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+replication+of+ovine+lentivirus+in+endothelial+cells+cultured+from+different+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Differential replication of ovine lentivirus in endothelial cells cultured from different tissues.</a> Virology. 238, 316-326 (1006).</li>
<li>Craig, L. E., Spelman, J. P., Strandberg, J. D., Zink, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cells+from+diverse+tissues+exhibit+differences+in+growth+and+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Endothelial cells from diverse tissues exhibit differences in growth and morphology.</a> Microvasc. Res. 55, 65-76 (1998).</li>
<li>Bonvillain, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Nonhuman+Primate+Model+of+Lung+Regeneration%3A+Detergent-Mediated+Decellularization+and+Initial+In+Vitro+Recellularization+with+Mesenchymal+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">A Nonhuman Primate Model of Lung Regeneration: Detergent-Mediated Decellularization and Initial In Vitro Recellularization with Mesenchymal Stem Cells.</a> Tissue Eng. Part A. 18, 2437-2452 (2012).</li>
<li>Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-Organ+Tissue+Engineering%3A+Decellularization+and+Recellularization+of+Three-Dimensional+Matrix+Scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Whole-Organ Tissue Engineering: Decellularization and Recellularization of Three-Dimensional Matrix Scaffolds.</a> Annu. Rev. Biomed. Eng. , (2010).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Tkanki mogą być sprawnie i skutecznie decellular ized za pomocą wielu metod wykorzystujących czynniki fizyczne, chemiczne i enzymatyczne12,20. Wyzwania związane z produkcją matryc biologicznych 3D z dużych narządów obejmują wymóg stosowania dużych ilości roztworów decelularyzacyjnych, drogi sprzęt komercyjny (tj. bioreaktory) oraz zawrotną liczbę perturbacji metodologicznych wymaganych do uzyskania końcowego produktu pochodzącego z tkanki. Nasza metoda zapewnia proste podejście, które minimalizuje man...

Bioinżynieria tkanek i organów jest atrakcyjnym dodatkiem do dziedziny medycyny regeneracyjnej. Tworzenie "laboratoryjnych" narządów, które nadają się do przeszczepienia pacjentom w celu zastąpienia funkcjonalności chorych narządów, jest wysoce pożądane w celu zaspokojenia obecnego i przyszłego zapotrzebowania na przeszczepy. Zasady inżynierii tkankowej koncentrują się na wysiewaniu pożądanych typów komórek lub ich progenitorów do rusztowania, które podtrzymuje kształt zmodyfikowanej tkanki, dostarczając jednocześnie odpowiednich czynników wzrostu i warunków hodowli niezbędnych do naśladowania procesów rozwojowych lub regeneracyjnych. Podczas gdy syntetyczne rusztowania były używane do inżynierii tkankowej, naturalna macierz zewnątrzkomórkowa (ECM) może być najlepszym źródłem rusztowań specyficznych dla narządów do tego celu. Decelularyzacja całego narządu to proces, który umożliwia usunięcie komórek przy jednoczesnym pozostawieniu nienaruszonych chemicznych i strukturalnych aspektów natywnego ECM. Powstałe w ten sposób rusztowanie macierzy bezkomórkowej można wykorzystać jako platformę, na której można wysiewać i hodować komórki regeneracyjne in vitro1,2.
Kilka modeli decelularyzacji płuc i późniejszej recelularyzacji dla gryzoni zostało opracowanych w celu zbadania wykonalności tej technologii3-6. Chociaż modele gryzoni stanowią niezbędny dowód słuszności koncepcji, nie można ich bezpośrednio przełożyć na potrzeby kliniczne ludzi. Niedawne badanie wykazało, że reakcje genomowe na uraz (i związany z nim stan zapalny) nie korelują dobrze między myszami a ludźmi; Odkrycia te rodzą pytania o zasadność wykorzystywania myszy jako modeli dla tak złożonych procesów biochemicznych u ludzi7. Modele naczelnych innych niż ludzie (NHP) mają tę zaletę, że są bardzo podobne do biologii człowieka na poziomie genomicznym, anatomicznym i fizjologicznym oraz pozwalają na bardziej elastyczną manipulację w celu większej ekstrapolacji na zastosowanie u ludzi. Makak rezus był używany w różnych zastosowaniach przedklinicznych i jest doskonałym modelem do badań nad inżynierią tkankową8-11. Niedawno opisaliśmy udaną decelularyzację płuc makaków rezusów (Macacca mulatta) przy użyciu procedury, która ma minimalny wpływ na płuca ECM12. Decelularyzacja płuc odbywa się poprzez traktowanie tkanki kolejno czterema roztworami decelularycznymi składającymi się z detergentów, soli i enzymów z przerywanym myciem wodą dejonizowaną (dH2O) oraz PBS. Zoptymalizowaliśmy tę procedurę, modyfikując protokół pierwotnie opisany przez Price'a i wsp.4 Zastosowano różne techniki histologiczne i analizy białek w celu scharakteryzowania składników powstałych matryc bezkomórkowych w stosunku do rodzimych płuc makaków.
W tym raporcie demonstrujemy szczegółowy protokół decelularyzacji płuc naczelnych innych niż człowiek oraz recelularyzacji powstałych w ten sposób bezkomórkowych rusztowań płuc w bioreaktorze o dużym narządzie, pierwotnie zademonstrowanym przez Calle i wsp. 13 w JoVE. Modyfikując ich pierwotny protokół w celu dostosowania go do wymagań dotyczących rozmiaru, wentylacji i perfuzji płuc dużych zwierząt, technologia została pomyślnie przeniesiona z modelu gryzoni do modelu makaka rezusa. Wszystkie badania przedstawione w tym raporcie zostały przeprowadzone zgodnie z polityką Instytucjonalnego Komitetu ds. Bezpieczeństwa Biologicznego (IBC) obowiązującą w Narodowym Centrum Badań nad Naczelnymi w Tulane. Demonstracja tej techniki jest niezbędna, ponieważ identyfikacja struktur anatomicznych i fizyczna manipulacja większymi narządami jest czasami trudna bez wizualizacji kroków protokołu. Badania, które są możliwe dzięki tym metodom, stanowią podstawę do niezbędnych badań przedklinicznych nad pozbawionymi komórek płucami makaków rezusów, w których można ocenić recelularyzację komórkami macierzystymi mezenchymalnej linii rezus i komórkami śródbłonka mikronaczyniowego rezus. Nasza wersja tego bioreaktora symuluje środowisko rozwojowe i stosuje siły mechanicznego rozciągania i naprężeń w płucach dużych zwierząt oraz umożliwia badanie recelularyzacji płuc w warunkach, o których wiadomo, że ułatwiają rozwój płuc i śródbłonka13-15.

<table><tbody><tr><td>Nitrofrozyd sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71778-25G</td><td></td></tr><tr><td>Sól sodowa heparyny</td><td>Fisher</td><td>BP2425</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher</td><td>BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>Deoksycholan sodu</td><td>Fisher</td><td>BP349-100</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Fisher</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>DNaza trzustki bydlęca</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN25</td><td>Przygotować bulion, porcję i zamrozić</td></tr><tr><td>Siarczan magnezu</td><td>Fisher</td><td>10034-99-8</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Fisher</td><td>C614-500</td><td></td></tr><tr><td>PBS (bez Ca/Mg)</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>10010-031</td><td></td></tr><tr><td>Antybiotykowo-Przeciwgrzybiczy</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Pożywka</td></tr> <tr>do hodowli komórkowych<td>Alpha MEM</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>12561-072</td><td></td></tr><tr><td>Medium 199</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>11150067</td><td></td></tr><tr><td>Premium Płodowa surowica bydlęca</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina 100x</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Suplement na wzrost komórek śródbłonka (EKGS)</td><td>ScienCell</td><td>1052</td><td></td></tr><tr><td>Antybiotykowo-przeciwgrzybiczy</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Zawory zwrotne do wysiewu komórek i hodowli w bioreaktorze</td></tr><tr><td></td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-98553-20</td><td></td></tr><tr><td>Łączniki Y</td><td>Cole-Parmer</td><td>ED-30614-08</td><td></td></tr><tr><td>Kran 3-drogowy</td><td>Aparatura Harvarda</td><td>721664</td><td></td></tr><tr><td>Rurka MasterFlex L/S 14</td><td>Cole-Parmer</td><td>96420-14</td><td></td></tr><tr><td>Wąż MasterFlex L/S 16</td><td>Cole-Parmer</td><td>96420-16</td><td></td></tr><tr><td>Zamek męski Luer 1/8 cala</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-45505-04</td><td></td></tr><tr><td>Żeński Luer 1/8 cala</td><td>Cole-Parmer</td><td>SI-45502-04</td><td></td></tr><tr><td>Męski wtyk Luer lock</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-45505-56</td><td></td></tr><tr><td>Porty iniekcyjne</td><td>Medi-Dose EPS</td><td>IV2004</td><td></td></tr><tr><td>Rurka lateksowa</td><td>St. Louis Medical Suppy</td><td>HN10910</td><td></td></tr><tr><td>Zacisk węża</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-06832-02</td><td></td></tr><tr><td>2 L Słoik z szerokim otworem</td><td>Fisher</td><td>05-719-276</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawki 60 ml</td><td>Fisher</td><td>NC9035364</td><td></td></tr></tbody></table>

decelularyzacja i recelularyzacja płuc naczelnych przy użyciu specjalistycznego bioreaktora wielkonarządowego

Nonhuman Primate Lung Decellularization and Recellularization Using a Specialized Large-organ Bioreactor

Nie ma wystarczającej liczby dostępnych płuc, aby zaspokoić obecne i przyszłe potrzeby w zakresie transplantacji narządów. Biosztuczna regeneracja tkanek jest atrakcyjną alternatywą dla klasycznego przeszczepu narządów. Technologia ta wykorzystuje naturalną biologiczną macierz zewnątrzkomórkową (ECM) narządu jako rusztowanie, na którym można wysiewać i hodować komórki autologiczne lub macierzyste/progenitorowe w sposób ułatwiający regenerację oryginalnej tkanki. Naturalny ECM jest izolowany w procesie zwanym decelularyzacją. Decelularyzacja odbywa się poprzez traktowanie tkanek szeregiem detergentów, soli i enzymów w celu skutecznego usunięcia materiału komórkowego przy jednoczesnym pozostawieniu ECM w stanie nienaruszonym. Badania przeprowadzone z wykorzystaniem decelularyzacji, a następnie recelularyzacji płuc gryzoni wykazały marginalny sukces w generowaniu tkanki płucnej, która jest zdolna do wymiany gazowej in vivo. Chociaż modele gryzoni stanowią niezbędny dowód słuszności koncepcji, nie można ich bezpośrednio przełożyć na użytkowanie przez ludzi. Zwierzęta naczelne (NHP) stanowią bardziej odpowiedni model do zbadania wykorzystania produkcji narządów biosztucznej do ewentualnego zastosowania klinicznego.
Przedstawiono protokoły osiągnięcia całkowitej decelularyzacji płuc pobranych od makaka rezusa NHP. Powstałe w ten sposób bezkomórkowe płuca mogą być obsiane różnymi komórkami, w tym mezenchymalnymi komórkami macierzystymi i komórkami śródbłonka. Manuskrypt opisuje również rozwój systemu bioreaktorów, w którym płuca makaków z nasionami komórek mogą być hodowane w warunkach mechanicznego rozciągania i naprężenia zapewnianego przez wentylację podciśnieniową, a także pulsacyjną perfuzję przez naczynia krwionośne; Wiadomo, że siły te kierują różnicowaniem odpowiednio wzdłuż linii płucnej i śródbłonka. Przedstawiono reprezentatywne wyniki decelularyzacji i wysiewu komórek.

Przedstawione poniżej wyniki pochodzą z oddzielnych eksperymentów, w których w przedziałach dróg oddechowych lub naczyniowych zasiedlono odpowiednio mezenchymalne komórki macierzyste pochodzące ze szpiku kostnego lub mikro naczyniowe komórki śródbłonka pochodzące z płuc małpy rhesus, które zostały wyizolowane i scharakteryzowane zgodnie z wcześniejszym opisem16-18.
W trakcie procesu decelularyzacji płuca makaków wykazywały postępujące bielenie, które kulminowało w przeźroczystym wyg...

Decelularyzacja całego narządu tworzy naturalne biologiczne rusztowania, które mogą być wykorzystane w medycynie regeneracyjnej. Przedstawiono opis modelu regeneracji płuc u naczelnych u zwierząt innych niż człowiek, w którym całe płuca są decelularyzowane, a następnie wysiewane dorosłymi komórkami macierzystymi i komórkami śródbłonka w bioreaktorze ułatwiającym krążenie naczyniowe i wentylację płynnych mediów.

Decelularyzacja i recelularyzacja płuc naczelnych przy użyciu specjalistycznego bioreaktora wielkonarządowego

There are an insufficient number of lungs available to meet current and future organ transplantation needs. Bioartificial tissue regeneration is an ...

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie matryc biologicznych całego narządu z płuc Reus Maccas i wykorzystanie tych matryc jako rusztowań do badania zastosowań inżynierii tkankowej płuc. Osiąga się to poprzez pierwszą decelularyzację całych płuc Reuss Maca za pomocą detergentów, soli i enzymów. Drugim krokiem jest zainstalowanie bezkomórkowych rusztowań płuc w bioreaktorze zdolnym zarówno do wentylacji dróg oddechowych, jak i perfuzji układu oddechowego za pomocą płynnych pożywek do hodowli komórek.Następnie rusztowania płuc są osadzane z komórkami macierzystymi przez drogi oddechowe i komórkami śródbłonka przez naczynia płucne. Ostatnim krokiem jest hodowla komórek w rusztowaniu płuc w warunkach wentylacji i perfuzji zapewnianych przez bioreaktor przez żądany czas, a następnie analiza uzyskanej morfologii komórek i tkanek. Ostatecznie reizacja bezkomórkowych rusztowań płuc Maca z komórkami macierzystymi i komórkami śródbłonka prowadzi do powstania zmodyfikowanej tkanki, która naśladuje anatomiczne i histologiczne cechy natywnych tkanek płuc.Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie inżynierii tkanki płucnej, takie jak to, czy komórki macierzyste lub

nonhuman-primate-lung-decellularization-recellularization-using

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Opracowaliśmy zdecelularyzowaną macierz zewnątrzkomórkową płuca oraz nowatorski bioreaktor biomimetyczny, które mogą być wykorzystywane do generowania funkcjonalnej tkanki płucnej. Poprzez zasiewanie komórek do macierzy i ich hodowlę w bioreaktorze, otrzymujemy tkankę wykazującą efektywną wymianę gazową po krótkotrwałym przeszczepieniu in vivo.

Procedura inżynierii płuc

Opisano metodę szybkiego i całkowitego usuwania składników komórkowych z nienaruszonego serca świni poprzez wsteczną perfuzję. Metoda ta pozwala uzyskać specyficzne dla miejsca rusztowanie macierzy zewnątrzkomórkowej serca, które może być stosowane w wielu zastosowaniach klinicznych.

Procedura decelularyzacji serca świni przez wsteczną perfuzję wieńcową

Ten protokół skutecznie kieruje endodermę pochodzącą z embrionalnych komórek macierzystych myszy do dojrzałych komórek nabłonka dróg oddechowych. Ta technika różnicowania wykorzystuje trójwymiarowe, zdecelularizowane rusztowania płuc do kierowania specyfikacją linii płuc w zdefiniowanych, wolnych od surowicy warunkach hodowli.

Generowanie komórek nabłonka dróg oddechowych myszy pochodzących z ESC przy użyciu bezkomórkowych rusztowań płuc

Recellularna macierz zewnątrzkomórkowa zdecelularizowanej wątroby szczura może być używana jako humanizowany, trójwymiarowy model ex vivo do badania dystrybucji i ekspresji transgenu wirusa lub wektora wirusowego.

Badanie wektorów wirusowych w trójwymiarowym modelu wątroby wypełnionym ludzką linią komórkową raka wątrobowokomórkowego HepG2

Tutaj prezentujemy protokół dla modelu raka płuc ex vivo, który naśladuje etapy progresji guza i pomaga wyizolować guz pierwotny, krążące komórki nowotworowe i zmiany przerzutowe.

Bezkomórkowy i komórkowy model płuc do badania przerzutów nowotworowych

Ten protokół opisuje metodę generowania powtarzalnych, małych tkanek płuc, poprzez ponowne zaludnienie decelularyzowanych, precyzyjnie wyciętych wycinków płuc komórkami nabłonka pęcherzyków płucnych typu 2, fibroblastami i komórkami śródbłonka.

Zmodyfikowane tkanki płuc przygotowane z bezkomórkowych plastrów płuc

Protokół opisuje bioreaktor z obsługą obrazowania, który pozwala na selektywne usuwanie endogennego nabłonka z tchawicy szczura i jednorodne rozmieszczenie komórek egzogennych na powierzchni światła, a następnie długoterminową hodowlę in vitro konstruktu komórka-tkanka.

Bioreaktor sterowany obrazowaniem do generowania bioinżynieryjnych tkanek dróg oddechowych

Protokół przedstawia metodę pozyskiwania ludzkich organoidów płucnych z pierwotnych tkanek płuc, rozszerzania organoidów płuc i wywoływania różnicowania proksymalnego w celu wygenerowania organoidów dróg oddechowych 3D i 2D, które wiernie kopiują nabłonek ludzkich dróg oddechowych.

Ustalanie ludzkich organoidów płuc i różnicowanie proksymalne w celu wytworzenia dojrzałych organoidów dróg oddechowych

Prezentowany tutaj jest protokół izolacji regionalnej decelularyzowanej tkanki płucnej. Protokół ten zapewnia potężne narzędzie do badania złożoności macierzy zewnątrzkomórkowej i interakcji komórka-macierz.

Rozwarstwienie i izolacja specyficznej dla regionu bezkomórkowej tkanki płucnej

Ten artykuł opisuje, jak stworzyć bioinżynieryjne płuca myszy za pomocą metod decelularyzacji i recelularyzacji. Zawiera również szczegółowe informacje na temat późniejszego ortotopowego przeszczepu płuc.

Przeszczep bioinżynieryjnego płuca przy użyciu pozbawionych komórek płuc myszy i pierwotnych ludzkich komórek śródbłonka

Poznaj metodę decelularyzacji i recelularyzacji płuc naczelnych w bioreaktorze wielkonarządowym. Technika ta wykorzystuje komórki macierzyste i śródbłonkowe do inżynierii tkankowej płuc.

Decelularyzacja i recelularyzacja płuc naczelnych przy użyciu specjalistycznego bioreaktora wielkonarządowego

Przeglądaj więcej filmów