Decelularyzacja i recelularyzacja płuc naczelnych przy użyciu specjalistycznego bioreaktora wielkonarządowego

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie matryc biologicznych całego narządu z płuc Reus Maccas i wykorzystanie tych matryc jako rusztowań do badania zastosowań inżynierii tkankowej płuc. Osiąga się to poprzez pierwszą decelularyzację całych płuc Reuss Maca za pomocą detergentów, soli i enzymów. Drugim krokiem jest zainstalowanie bezkomórkowych rusztowań płuc w bioreaktorze zdolnym zarówno do wentylacji dróg oddechowych, jak i perfuzji układu oddechowego za pomocą płynnych pożywek do hodowli komórek.

Następnie rusztowania płuc są osadzane z komórkami macierzystymi przez drogi oddechowe i komórkami śródbłonka przez naczynia płucne. Ostatnim krokiem jest hodowla komórek w rusztowaniu płuc w warunkach wentylacji i perfuzji zapewnianych przez bioreaktor przez żądany czas, a następnie analiza uzyskanej morfologii komórek i tkanek. Ostatecznie reizacja bezkomórkowych rusztowań płuc Maca z komórkami macierzystymi i komórkami śródbłonka prowadzi do powstania zmodyfikowanej tkanki, która naśladuje anatomiczne i histologiczne cechy natywnych tkanek płuc.

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie inżynierii tkanki płucnej, takie jak to, czy komórki macierzyste lub progenitorowe mogą być wykorzystywane do regeneracji tkanki płucnej samodzielnie lub w połączeniu z dojrzałymi komórkami nabłonka i śródbłonka płuc. Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku terapii schyłkowych chorób płuc, ponieważ połączenie bezkomórkowych matryc płuc z komórkami macierzystymi lub progenitorowymi pochodzącymi od pacjenta może potencjalnie zwiększyć liczbę płuc dawcy dostępnych do przeszczepu płuc. Co więcej, powstałe płuca zmodyfikowane przy użyciu własnych komórek macierzystych pacjenta mogą być odporne na odrzucenie immunologiczne.

Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy obejrzeliśmy wcześniej opublikowany film Joe autorstwa członków laboratorium dr Laury Nicholson na Uniwersytecie Yale. Poniżej przedstawiamy modyfikacje ich procedury dla gryzoni, aby dopasować ją do potrzeb naszego modelu Resus Meac dla dużych zwierząt. Należy zachować najwyższą ostrożność, aby zapobiec przypadkom zakaźnego narażenia podczas pracy z tkankami maca.

Przed przystąpieniem do kontaktu z tkankami naczelnych należy założyć środki ochrony osobistej, w tym maskę chirurgiczną, osłonę twarzy, jedną warstwę rękawiczek chirurgicznych, jednorazowy fartuch i drugą warstwę rękawic chirurgicznych z płucami leżącymi płasko na tacy sekcyjnej, kanulować tętnicę płucną za pomocą łącznika przynęty żeńskiej z zadziorem o odpowiedniej wielkości. Przymocuj kaniulę na miejscu za pomocą opaski zaciskowej sterylizowanej alkoholem. Wsuń plastikową opaskę zaciskową wokół tchawicy.

Włóż żeński łącznik przynęty do otworu tchawicy i zaciśnij opaskę zaciskową wokół zadzioru łącznika, aby utrzymać tchawicę na miejscu wokół zadzioru. Usuń uwięzione powietrze z płuc, wkraplając sól fizjologiczną buforowaną fosforanem lub PBS zawierającą 30 jednostek na mililitr heparyny i pięć mikrogramów na mililitr strony nitroprasowania sodu. Skrócone SNP pozwalają na wydalenie roztworu przez naturalny odrzut przed powtórzeniem.

Instalacja jeszcze dwa razy po trzeciej instalacji dróg oddechowych z roztworem PBS Heparyna SNP. Zakryj kaniulę przynęty tchawicy zatyczką do przynęty. Odetnij wierzchołek serca i przepłucz wewnętrzne komory PBS Heparyną SNP, aby usunąć resztki krwi, rozerwać oba przedsionki, aby ułatwić drenaż obwodów płucnych po perfuzji.

Podłączyć strzykawkę o pojemności 60 ml wypełnioną roztworem PBS Heparyny SNP do kaniuli tętnicy płucnej i ostrożnie wyjąć tłok, aby płyn mógł spłynąć do układu krwionośnego. Wyjmij zatyczkę z kaniuli tchawicy i pozwól, aby płyn z dróg oddechowych został wydalony przez naturalny odrzut. Kontynuuj perfuzję, aż jak najwięcej krwi zostanie usunięte z naczyń płucnych.

Najtrudniejszym aspektem zabiegu jest skuteczne płukanie i mycie dróg oddechowych płuc W przypadku płynów przepływ cieczy jest zahamowany w stosunku do gazów, ponieważ drogi oddechowe nie są przeznaczone do przewodzenia płynów, czas i pacjenci są niezbędni do wykonania tych kroków, zalecamy kontynuowanie protokołu, pomimo pozostałości płynu pozostającego w drogach oddechowych w miarę postępu decelularyzacji i wypłukiwania resztek komórkowych, lepkość płynu pozostanie niska, a płuca będą w stanie skutecznie wydalić płyny pierwszego dnia. Zanurz blok płuca serca w wodzie dejonizowanej, napompuj i perfuzjuj płuco wodą dejonizowaną za pomocą strzykawek o pojemności 60 cm3 przymocowanych odpowiednio do zanurzonej tchawicy i kaniuli tętniczej. Skutecznie powtórz płukanie dróg oddechowych i naczyń krwionośnych wodą dejonizowaną.

Jeszcze cztery razy, w sumie pięć płukań o objętości około 0,5 do jednego litra każde, po pięciu płukaniach wyjmij płuca z wody i zanurz blok w roztworze Triton. Napompuj i przeprowadź perfuzję płuc roztworem Triton. Tak jak poprzednio, powtórz instalację po raz drugi i inkubuj zanurzone narządy w roztworze Trytona przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Po całonocnej inkubacji wyjąć blok płuc z roztworu Triton i przemyć zewnętrznie wodą dejonizowaną. Następnie zanurz blok w świeżej wodzie dejonizowanej. Wkraplaj dejonizowaną wodę do tchawicy i tętnicy płucnej pięć razy, aby wypłukać roztwór Triton i resztki komórek.

Usuń płuca z wody dejonizowanej i zanurz w 2% roztworze deoksy sodu lub SDC. Napompuj i przelej roztworem SDC w ten sam sposób. Zanurz płuca w roztworze SDC na noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza trzeciego dnia.

Ponownie umyj tkankę wodą dejonizowaną zewnętrznie i pięciokrotnie przez drogi oddechowe i naczynia krwionośne. Tak jak poprzednio, usuń tkankę z wody dejonizowanej i zanurz w jednomolowym roztworze chlorku sodu. Napełnić i przetopić roztworem chlorku sodu jak poprzednio, a następnie zanurzyć tkankę w roztworze chlorku sodu na jedną godzinę w temperaturze pokojowej po umyciu płuc z roztworu chlorku sodu za pomocą pięciu płukań wody dejonizowanej.

Tak jak poprzednio, zanurz je w świeżym roztworze DNA i wkropl ten roztwór do dróg oddechowych i naczyń krwionośnych. Inkubować płuca w roztworze DNA przez godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie usuń płuca z roztworu DNA i przemyj zewnętrznie roztworem PBS.

Zanurz płuca w roztworze PBS i przemyj ten roztwór pięć razy przez drogi oddechowe i naczynia krwionośne. Tak jak poprzednio, czwartego dnia przechowuj płuca w roztworze PBS w szczelnie zamkniętym pojemniku w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przemyć płuca w świeżym, lodowatym roztworze PBS pięć razy przez drogi oddechowe i naczynia krwionośne.

Następnie przechowuj je w roztworze PBS w sterylnym, zamkniętym pojemniku w temperaturze czterech stopni Celsjusza do czasu użycia. Zamontuj elementy bioreaktora pod okapem z przepływem laminarnym zgodnie ze schematem. W protokole tekstowym należy napełnić główną komorę pożywką hodowlaną, która została zrównoważona z atmosferą 5% CO2 inkubatora do hodowli komórkowych bezpośrednio przed użyciem w bioreaktorze, a następnie nałożyć adaptery tchawicy i kaniuli naczyniowej do kaniuli płucnej.

Zainstaluj narządy w głównej komorze bioreaktora, kąpiąc płuca w pożywce hodowlanej i podłączając adaptery kaniuli do odpowiednich portów w zmodyfikowanej pokrywie. Po podłączeniu przymocuj pokrywę bezpiecznie i mocno. Komora nie zostanie ponownie otwarta na czas odsysania powietrza z rurki za pomocą portów strzykawki i strzykawki 60 CCC wyposażonej w igłę o rozmiarze 18, przesuwającą kierunek trójdrożnych kurków odcinających, aby skierować przepływ cieczy do strzykawki.

Przenieś szczelne, przylegające do siebie komory bioreaktora z zainstalowanymi narządami do inkubatora kultur tkankowych, aby zrównoważyć temperaturę i gaz. Przewietrzyć płuca za pomocą pompy strzykawkowej podłączonej do głównej komory przy około jednym pełnym oddechu co dwie minuty i wykonać fuzję naczyniową za pomocą pompy perystaltycznej z prędkością około 10 mililitrów na minutę Łącznie przez 30 minut w przypadku siedzenia w drogach oddechowych. Napompuj płuca zawiesiną komórkową, delikatnie wstrzykując przez port strzykawki przymocowany do trójdrożnego kurka zatrzymującego w pętli oddechowej.

Utrzymuj płuca statycznie w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% CO2 przez noc bez perfuzji dróg oddechowych lub naczyń krwionośnych, aby umożliwić komórkom przyczepienie się do zdecelularizowanej macierzy płucnej. Po całonocnej inkubacji ponownie zainicjuj standardowy program wentylacji dróg oddechowych i hodowlę, narządy na trzy do siedmiu dni w celu siedzenia naczyniowego. Kierunek ścieżki przepływu można zmienić z komory głównej na śródbłonkowy zbiornik osadzania, obracając zawór na kurku odcinającym umieszczonym w rurce łączącej te dwie komory, stopniowo wysiewając komórki śródbłonka za pomocą pompy perystaltycznej, delikatnie mieszając za pomocą mieszania magnetycznego po zakończeniu wysiewu.

Stupnij perfuzję i inkubuje statycznie przez około cztery do sześciu godzin. Ponownie zainicjuj perfuzję naczyniową za pomocą pożywki z komory głównej z szybkością około 10 mililitrów na minutę. Hodowla przez trzy do siedmiu dni z ciągłą perfuzją naczyniową jednocześnie z okresem posiewu wentylacji dróg oddechowych.

W trakcie procesu decelularyzacji płuca MCCA wykazywały postępujące wybielanie, którego kulminacją był półprzezroczysty wygląd pod koniec procesu. Jednak płuca zachowały swoje ogólne cechy anatomiczne i pozostały w dużej mierze elastyczne i zdolne do wytwarzania naturalnego odrzutu po napompowaniu płynem. Na poziomie mikroskopowym.

Ultrastruktura histologiczna pozostała nienaruszona po decelularyzacji. To znaczy oskrzela, oddechowe, oskrzela, pęcherzyki płucne, worki zębodołowe. Naczynia krwionośne i naczynia włosowate były nadal dość wyraźnie rozróżniane przez mikroskopię o niskiej mocy.

Mikroanatomia histologiczna wykazała jednak, że podczas gdy ogólna anatomia i ultrastruktura płuc zostały nieznacznie zaburzone przez decelularyzację, tkanka była całkowicie pozbawiona nienaruszonych komórek, jak widać tutaj. W tkankach pozbawionych komórek pozostały tylko śladowe ilości DNA. Co więcej, śladowe DNA, które zostało skoncentrowane przez wytrącanie alkoholu i uwidocznione w 0,8% żelu AROS, składało się głównie ze zdegradowanych fragmentów o niskiej masie cząsteczkowej.

Skuteczność usuwania białek komórkowych oceniano za pomocą analiz western blot zarówno natywnego, jak i pozbawionego komórek białka płuc. Lizaty wykorzystujące przeciwciało przeciwko beta-aktynie, beta aktyna była łatwo wykrywalna w natywnych lizatach płuc, ale nie w decelularyzowanych lizatach płuc, co sugeruje, że decelularyzacja dramatycznie zubożyła komórki i usunęła materiał białkowy związany z komórkami 14 dni po wysiewie dróg oddechowych za pomocą mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących ze szpiku kostnego maca lub BMC i hodowli bioreaktora z około jednym cyklem wydechu co dwie minuty. Miąższ zdecellularyzowanych płuc Maca został skutecznie zlikwidowany.

BMC wyściełały septikę zębodołową, zachowując jednocześnie czyste i otwarte światło wyrostka zębodołowego. Ogołocona matryca dużych dróg oddechowych została również zlikwidowana przez BMC za pomocą bioreaktora, powierzchnia światła głównego oskrzela łodygi została wyłożona monowarstwą płaskonabłonkowych jak BMC po 14 dniach hodowli. W pokazanym tutaj bioreaktorze znajduje się zdecelularowany płat płuca reus pięć dni po wysianiu naczyń krwionośnych mikrokomórkami śródbłonka i zapewnieniu stałej perfuzji naczyniowej za pomocą pożywki do hodowli śródbłonka w tempie pięciu mililitrów na minutę.

Analiza histologiczna ujawniła komórki wyściełające małe naczynia krwionośne w miąższu płuc. W niektórych przypadkach komórki wydawały się być przyczepione do macierzy za pomocą kilku projekcji komórkowych w poprzek światła, podczas gdy inne przekroje naczyń pokazywały komórki wyściełające powierzchnię śródbłonka przezroczystym światłem. Postępując zgodnie z tą procedurą.

Inne metody, takie jak immunohistochemia, western blot i ilościowy PCR w czasie rzeczywistym, można przeprowadzić, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak to, czy zasiane komórki macierzyste różnicują się w komórki linii płucnej po wyhodowaniu na bezkomórkowej macierzy płuc, czy też z dojrzałymi komórkami nabłonka i śródbłonka w bioreaktorze. Po obejrzeniu tego filmu powinniśmy dobrze zrozumieć, jak zdeceluaryzować płuca naczelnych innych niż ludzie, a następnie wykorzystać powstałe bezkomórkowe płuca jako rusztowania do hodowli komórek macierzystych, komórek nabłonka i komórek śródbłonka w systemie bioreaktora. Nie zapominaj, że praca z tkankami naczelnych może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak noszenie pełnego sprzętu ochrony osobistej, w tym osłony twarzy i podwójnej warstwy rękawic lateksowych lub nitrylowych.