Dlaczego polarność lipidów ma znaczenie w rozdziału metodą HPTTC?

Polarność lipidów determinuje ich migrację podczas HPTLC, przy czym lipidy bardziej polarne przemieszczają się dalej wraz z frontem rozpuszczalnika, a lipidy mniej polarne adsorbują się do fazy krzemionkowej, co umożliwia rozdział oparty na polarności, wspierający wstępną identyfikację i analizę porównawczą.

W jaki sposób wstępne równoważenie i aktywacja płytki HPTLC wpływają na rozdział lipidów?

Wstępna równowagowanie usuwa pary wodne oraz zanieczyszczenia, natomiast aktywacja w wysokiej temperaturze zapobiega degradacji płytki i zapewnia jednorodną adsorpcję, co wspólnie poprawia efektywność rozdziału i powtarzalność w procedurach analizy lipidów.

Jakie pomiary ilościowe umożliwia HPTLC w analizie lipidów?

HPTLC umożliwia pomiar wartości współczynnika retencji (Rf) oraz intensywności zabarwionych plam, co pozwala na półilościowe porównanie klas lipidów w różnych próbkach i warunkach doświadczalnych w celu wstępnego określenia ilości}.

Dlaczego wymagania dotyczące powtarzalności są ważne dla HPTLC w ramach wspólnych badań nad lipidami?

Powtarzalność zapewnia spójne wartości Rf i wzory plam u różnych użytkowników i w różnych laboratoriach, co zwiększa zaufanie do danych profilowania lipidów w różnych jednostkach funkcjonalnych oraz umożliwia wiarygodne porównania w ramach walidacji celów i prac nad opracowaniem testów.

Jaka analiza statystyczna jest zalecana przed wdrożeniem HPTLC do przesiewowego badania lipidów?

Zaleca się przeprowadzenie podstawowej analizy statystycznej, takiej jak obliczanie średniej intensywności plamek z powtórzeń oraz odchylenia standardowego, aby ocenić zmienność techniczną i zapewnić wiarygodną kwantyfikację lipidów przed przejściem do dalszych metod potwierdzających.

Wysokosprawna chromatografia cienkowarstwowa: technika wstępnego rozdzielania i oznaczania ilościowego lipidów z neutrofili

JoVE Encyclopedia of Experiments

Techniki biologiczne

0 wyświetleń • 3:59 min • July 8th, 2025

Wysokosprawna chromatografia cienkowarstwowa, HPTLC, jest zaawansowaną techniką analityczną służącą do rozdzielania różnych analitów przy użyciu drobnoziarnistych cząstek adsorbentu jako fazy stacjonarnej. Ta cecha ułatwia wydajne pakowanie, zapewniając lepszą separację.

Aby oddzielić lipidy za pomocą HPTLC, weź mieszaninę lipidów o różnej polarności uzyskaną z neutrofili. Teraz wstępnie zrównoważ płytkę w rozpuszczalniku organicznym, aby usunąć wszelkie ślady pary wodnej i brudu, a następnie aktywuj w wysokiej temperaturze, aby zapobiec zniszczeniu płytki.

Zastosuj mieszankę lipidów i wzorzec jako oddzielne miejsca w pobliżu podstawy płytki. Przenieś płytkę do szklanej komory nasyconej rozpuszczalnikiem polarnym - fazą ruchomą. Pozwól rozpuszczalnikowi przesunąć się w górę poprzez działanie kapilarne.

Podczas ruchu bardziej polarne lipidy migrują wzdłuż frontu rozpuszczalnika ze względu na ich powinowactwo do rozpuszczalnika polarnego. I odwrotnie, mniej polarne lipidy ulegają adsorpcji na cząsteczkach krzemionki i pozostają w tyle. Uruchom lipidy w rozpuszczalniku o pośredniej polarności, a następnie w rozpuszczalniku całkowicie niepolarnym, co spowoduje dalszą separację lipidów.

Gdy czoło rozpuszczalnika osiągnie żądaną odległość, wyjmij płytkę i wysusz ją. Wystawić płytkę na działanie odczynnika barwiącego, takiego jak zakwaszony siarczan miedzi, powodując zwęglenie lipidów. Pomaga to uwidocznić oddzielone plamki lipidowe w porównaniu ze standardowymi plamkami, które pomagają we wstępnej identyfikacji lipidów.

Na początek napełnij do 5 mililitrów każdego roztworu w odpowiedniej szklanej komorze. Dodaj dowolny rodzaj bibuły filtracyjnej, aby zwiększyć prędkość pracy w każdej komorze. Wstępnie inkubuj szklaną płytkę z żelem krzemionkowym HPTLC 60 x 10 centymetrów w pierwszym uruchomionym roztworze. Gdy bieżący roztwór dotrze do górnej części płytki, susz ją przez 10 minut w temperaturze 110 stopni Celsjusza.

Rozpuścić ciekły osad otrzymany wcześniej po wysuszeniu za pomocą koncentratora próżniowego, w żądanej objętości roztworu chloroformu/metanolu w stosunku 1:1 i inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza do rozpuszczenia. Następnie za pomocą linijki i miękkiego ołówka zaznacz miejsca ładowania dla żądanej liczby próbek oraz co najmniej jednego wzorca. Oznacz dystans biegu na około 4 centymetry dla pierwszego rozwiązania do biegania i około 6 centymetrów dla drugiego roztworu do biegania.

Aby załadować próbki, przed załadowaniem każdej nowej próbki umyj strzykawkę o pojemności 10 mikrolitrów w chloroformie/metanolu w proporcji 1:1. Załaduj kroplami 10 mikrolitrów każdej próbki, starając się skoncentrować próbkę na jak najmniejszym obszarze. Umieść płytkę pionowo w pierwszej komorze z roztworem do biegania #1. Upewnij się, że płytka jest równoległa do ścianki szklanej komory, aby uzyskać równomierną prędkość migracji.

Razem płytki są umieszczone równolegle do tylnej ścianki szklanych komór, a czoła rozpuszczalnika nie biegną zbyt daleko, aby zapewnić skuteczne oddzielenie lipidów.

Gdy linia rozpuszczalnika dotrze do pierwszego znaku, wyjmij płytkę, wysusz ją i umieść w drugim roztworze. Powtórz podobne kroki dla drugiego i trzeciego uruchomionego rozwiązania. Pozostawić płytkę w roztworze do momentu, gdy czoło rozpuszczalnika dotrze do górnej części płytki. Następnie wyjmij płytkę i susz ją w temperaturze pokojowej przez minutę.

Umieść płytkę w roztworze siarczanu miedzi na siedem sekund. Po dokładnym wysuszeniu talerza pieczemy go w piekarniku przez siedem minut w temperaturze 170 stopni Celsjusza. Wyjmij talerz z piekarnika i pozwól mu ostygnąć.