Name: Metody badania zmian lipidowych w neutrofilach i późniejszego tworzenia pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: Poznaj metodę analizy składu lipidów neutrofili z krwi ludzkiej przy użyciu HPTLC i HPLC. Technika ta pozwala badać mechanizmy tworzenia pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili i rolę cholesterolu w funkcjach immunologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez stypendium Akademie für Tiergesundheit (AfT) oraz stypendium z programu doktoranckiego "Zakażenia zwierząt i chorób odzwierzęcych" Uniwersytetu Medycyny Weterynaryjnej w Hanowerze, Niemcy, zapewnione Ariane Neumann.

Pobieranie krwi obwodowej w tym protokole zostało zatwierdzone przez lokalną komisję etyki badań na ludziach. Wszyscy ludzie wyrazili pisemną świadomą zgodę.
1. Izolacja neutrofili pochodzących z ludzkiej krwi za pomocą wirowania w gradimencie gęstości
<ol>
	<li>Izolacja neutrofili pochodzenia ludzkiego
	<ol>
		<li>Warstwę ~20 ml krwi na 20 ml roztworu diatrizoinianu sodu/dekstranu w pobliżu płomienia i bez mieszania.</li>
		<li>Wirować przez 30 minut przy 470 x g bez hamulca.</li>
		<li>Usuń komórki jednojądrzaste i żółtawą warstwę plazmy. Przenieś fazę komórki wielojądrzastej (PMN) (druga faza z komórkami akumulującymi; Rysunki 1 i 2) do nowej probówki o pojemności 50 ml i napełnić ją do 50 ml solą fizjologiczną buforowaną 1x fosforanem (PBS).</li>
		<li>Wirować przez 10 minut przy 470 x g z hamulcem.</li>
		<li>Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 5 ml sterylnej wody na 5 sekund w celu lizy erytrocytów.</li>
		<li>Natychmiast napełnić do 50 ml 1x PBS i wirować przez 10 minut przy 470 x g.</li>
		<li>Usunąć supernatant. Granulka powinna być biała. Jeśli nadal świeci na czerwono, powtórz kroki 1.1.5 i 1.1.6.</li>
		<li>Zawiesić osad w 1,000 μl podłoża Roswell Park Memorial Institute (RPMI). Policz liczbę komórek za pomocą barwienia błękitem trypanowym w hemocytometrze pod mikroskopem świetlnym.</li>
		<li>Przygotować zawiesinę komórek w RPMI o stężeniu 2 x 106/ml. Około 2,5 x 107 neutrofili można pobrać z 20 ml krwi.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Leczenie farmakologiczne neutrofili w analizie lipidów
	<ol>
		<li>Użyj 5 x 107 komórek z kroku 1.1.9. Dostosuj liczbę komórek w czystym pożywce Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) w obecności lub bez 10 mM MβCD lub 25 nM PMA w całkowitej objętości 300 μl w 1,5 ml probówce reakcyjnej.</li>
		<li>Inkubować próbki w probówkach reakcyjnych przez 2 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
		<li>Wirować przez 10 minut przy 470 x g z hamulcem.</li>
		<li>Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w 300 μl HBSS.</li>
		<li>Wirować przez 10 minut przy 470 x g z hamulcem.</li>
		<li>Zawiesić osad komórkowy w 1 ml chloroformu/metanolu (1:1), homogenizować go za pomocą kaniuli 26 G, zasysając i wyprowadzając próbkę do strzykawki o pojemności 1 ml 10 razy, a następnie przechowywać próbki w temperaturze -20 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Leczenie farmakologiczne neutrofili w celu oznaczania ilościowego NET metodą immunofluorescencji
	<ol>
		<li>Przygotować 48-dołkowe płytki pokryte poli-L-lizyną ze szklanymi szkiełkami nakrywkowymi.
		<ol>
			<li>Umieść jedno 8-milimetrowe szklane szkiełko nakrywkowe w każdym dołku, dodaj 55 μl sterylnego 0,01% poli-L-lizyny i inkubuj przez ~20 minut w temperaturze pokojowej (RT).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przemyć dwukrotnie 200 μl 1x PBS. Przechowuj płytki z 200 μl 1x PBS na studzienkę w lodówce, aż będą potrzebne.</li>
		<li>Ostrożnie dodać 100 μl zawiesiny komórek (2 x 105/100 μL) z kroku 1.1.9 na studzienkę na środek każdego szkiełka nakrywkowego.</li>
		<li>Dodać 100 μl na studzienkę końcowego 10 mM MβCD lub końcowego 25 nM PMA.</li>
		<li>Wirować przez 5 minut przy 370 x g z hamulcem.</li>
		<li>Inkubować przez 2 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
		<li>Wirować przez 5 minut przy 370 x g z hamulcem.</li>
		<li>Utrwalić komórki 155 μl 4% PFA, zawinąć je w plastikową folię parafinową i przechowywać przez noc w temperaturze 4 °C lub przez 10 minut w temperaturze RT. 
		UWAGA: Aby uzyskać dane dotyczące tworzenia NET indukowanego przez MβCD, patrz Neumann et al.15.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Izolacja lipidów i analiza neutrofili pochodzących z ludzkiej krwi
<ol>
	<li>Wyizoluj lipidy z ludzkich neutrofili pochodzenia obwodowego we krwi na podstawie Bligh and Dyer22 i Brogden et al.23
	<ol>
		<li>Weź neutrofile z kroku 1.2.6 i umieść je na lodzie.</li>
		<li>Na lodzie pipetować neutrofile (obecne w roztworze metanolu i chloroformu) do szklanej probówki z zakrętką o pojemności 15 ml z uszczelką z politetrafluoroetylenu (PTFE) i homogenizować je, wstrząsając przez 1 minutę. Użyj szklanych probówek, aby zapobiec wiązaniu lipidów z powierzchniami plastikowymi. Używaj nasadek PTFE, aby zapobiec zanieczyszczeniu gumą/plastikiem.</li>
		<li>Dodać 2 ml metanolu, a 1 minutę później 1 ml chloroformu. Wstrząsaj ponownie przez 1 minutę.</li>
		<li>Obracaj szklane rurki z prędkością RT i 50 obr./min przez 30 minut.</li>
		<li>Frakcję białkową osadzać przez odwirowanie roztworu w temperaturze 7 °C i 1,952 x g przez 10 minut.</li>
		<li>Ostrożnie zdekantować supernatant do nowej szklanej probówki z nakrętką o pojemności 15 ml, pozostawiając osad zawierający białko. Przechowywać osad w temperaturze -20 °C do przyszłego oznaczania ilościowego.</li>
		<li>Dodać 1 ml chloroformu, odczekać 1 minutę, dodać 1 ml podwójnie destylowanej wody i odwrócić szklaną rurkę z nakrętką z próbką przez 30 s.</li>
		<li>Wirować w temperaturze 7 °C i 1,952 x g przez 10 minut i odrzucić górną fazę, aż do warstwy mętnej, ale nie włączając</li>.
		<li>W razie potrzeby należy wykonać opcjonalny dalszy etap oczyszczania, powtarzając krok 2.1.8.</li>
		<li>Wysuszyć próbki w koncentratorze próżniowym w temperaturze 60 °C i przechowywać je w temperaturze -20 °C do czasu, gdy będą potrzebne.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wysokosprawna chromatografia cienkowarstwowa (HPTLC) do półilościowego oznaczania ilości kilku lipidów, w tym cholesterolu, fosfolipidów i sfingomieliny
	<ol>
		<li>Przygotuj następujące cztery roztwory bieżące i roztwór do barwienia.
		<ol>
			<li>Roztwór 1: Wymieszaj octan etylu (26,6%), 1-propanol (26,6%), chloroform (26,6%), metanol (26,6%) i chlorek potasu (9,6%). Przygotować KCl, rozpuszczając 0,25 g KCl w 100 ml wody o jakości HPLC.</li>
			<li>Rozwiązanie 2: Wymieszaj n-heksan (73%), eter dietylowy (23%) i kwas cytrynowy (2%).</li>
			<li>Rozwiązanie 3: 100% n-heksanu.</li>
			<li>Przygotować roztwór barwiący, mieszając wodę destylowaną (90 ml) z 7,5 g siarczanu miedzi, a następnie dodać 10 ml kwasu fosforowego.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Napełnij do 5 mm każdego roztworu w oddzielnej szklanej komorze. Dodaj dowolny rodzaj bibuły filtracyjnej, aby zwiększyć prędkość pracy w każdej komorze.</li>
		<li>Wstępnie inkubować szklaną płytkę o wymiarach 20 x 10 cm z żelem krzemionkowym HPTLC 60 w pierwszym roztworze do biegania, aż roztwór do biegania dotrze do górnej części płytki. Następnie suszyć przez 10 minut w temperaturze 110 °C. 
		UWAGA: Płytki te można przechowywać do wykorzystania w przyszłości w folii aluminiowej i suszyć przez 10 minut w temperaturze 110 °C przed użyciem.</li>
		<li>Rozpuścić osad lipidowy otrzymany w kroku 2.1.10 w 200 μl roztworu chloroformu/metanolu (1:1) i inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 °C do rozpuszczenia.</li>
		<li>Użyj linijki i miękkiego ołówka, aby zaznaczyć miejsca załadunku dla żądanej liczby próbek oraz co najmniej jednego wzorca. Oznacz dystans biegu na około 4 cm i 6 cm odpowiednio dla pierwszego i drugiego roztworu do biegania.</li>
		<li>Aby załadować próbki, przed załadowaniem każdej nowej próbki należy umyć strzykawkę o pojemności 10 μl 3 razy w chloroformie/metanolu (1:1). Załadować kroplami 10 μl każdej próbki, starając się skoncentrować próbkę na jak najmniejszym obszarze. Próbki powinny być ładowane co najmniej w dwóch egzemplarzach.</li>
		<li>Umieścić płytkę pionowo w pierwszej komorze z roztworem bieżącym 1 (krok 2.2.1.1). Upewnij się, że płytka jest równoległa do ścianki szklanej komory, aby uzyskać równomierną prędkość migracji.</li>
		<li>Gdy linia rozpuszczalnika dotrze do pierwszego znaku, wyjmij płytkę, wysusz ją i umieść w drugim roztworze. Powtórz podobne kroki dla drugiego i trzeciego uruchomionego rozwiązania; pozostawić płytkę w roztworze do momentu, gdy czoło rozpuszczalnika dotrze do górnej części płytki, a następnie wyjąć ją i wysuszyć w temperaturze pokojowej przez 1 minutę.</li>
		<li>Umieść płytkę w roztworze siarczanu miedzi na 7 s. Wyjmij talerz, dokładnie osusz i piecz w piekarniku przez 7 minut w temperaturze 170 °C. Poczekaj, aż talerz ostygnie.</li>
		<li>Korzystając z oprogramowania do chromatografii cienkowarstwowej i analizy żelu, a także oprogramowania do przetwarzania obrazu, skanuj i analizuj zgodnie z wcześniejszym opisem Brogdena i wsp.23.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) do ilościowego oznaczania ilości cholesterolu
	<ol>
		<li>Podłączyć kolumnę o wymiarach 100 x 4,6 mm do wkładu ochronnego 5 μm/4,6 mm i podgrzać go do temperatury 32 °C. Użyj metanolu jako fazy ruchomej przy natężeniu przepływu 1 ml/min przy ciśnieniu 65 barów i detektorze UV o długości fali 202 nm, aby określić ilościowo ilość cholesterolu w każdej próbce.</li>
		<li>Przed analizą próbek należy dokładnie umyć maszynę HPLC, wykonując następujące czynności: czyszczenie pompy, mycie igły, płukanie garnka, przedmuchiwanie strzykawki i mycie przedmuchiwania pompy. Umyj wszystko wodą. Na koniec należy przeprowadzić przedmuchiwanie układu metanolem o natężeniu przepływu 5 ml/min przez 5 minut.</li>
		<li>Aby ustalić krzywą standardową cholesterolu, przygotuj co najmniej 4 stężenia w zakresie od 0,05 mg/ml do 2 mg/ml cholesterolu w chloroformie/metanolu (1:1)24.</li>
		<li>Próbki otrzymane w kroku 2.1.10 zawiesić w 500 μl chloroformu/metanolu (1:1) w bursztynowych szklanych butelkach o pojemności 1,5 ml z zakręcanymi czerwonymi pokrywkami z PTFE/białego silikonu.</li>
		<li>Określić ilościowo stężenie cholesterolu przy użyciu wzorca przygotowanego w kroku 2.3.3. 
		UWAGA: Wypełnić protokół pobierania próbek, zaczynając od co najmniej jednej kontroli wzorcowej i jednej kontroli ujemnej, a następnie próbek.</li>
		<li>Wyrazić wyniki jako pole pod krzywą i porównać odpowiednie próbki za pomocą dowolnego oprogramowania statystycznego. 
		UWAGA: Wyniki można również określić ilościowo w stosunku do krzywej standardowej i można je przedstawić jako całkowitą ilość cholesterolu na ml, g lub liczbę komórek. Równanie krzywej standardowej należy obliczyć przy użyciu wartości uzyskanych w kroku 2.3.3.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Wizualizacja i kwantyfikacja NET
<ol>
	<li>Wizualizacja sieci NETs 
	UWAGA: Wizualizacja NET opiera się na wcześniej opublikowanych pracach Neumanna i wsp.15.
	<ol>
		<li>Przemyć utrwalone próbki z kroku 1.3.8 3 razy za pomocą 200 μl 1x PBS.</li>
		<li>Blokować i przepuszczać 100 μl 2% BSA, 0,2% Triton X-100 w PBS na studzienkę przez 45 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Dodać 100 μl przeciwciał pierwszorzędowych: mysie przeciwciało monoklonalne anty DNA-histon 1 (rozcieńczyć zapas w 2,2 mg/ml 1:5 000 w PBS zawierającym 2% BSA i 0,2% Triton X-100) lub przeciwciało poliklonalne przeciwko mieloperoksydazie (MPO; królicze anty-MPO; rozcieńczyć 1:300 w PBS zawierającym 2% BSA i 0,2% Triton X-100). Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Umyć 3 razy 200 μL 1x PBS.</li>
		<li>Dodać 100 μl przeciwciała drugorzędowego (znakowane fluorescencyjnie kozie przeciwciało anty-mysie; 1:1,000 w BSA-PBS-Triton X-100 i kozie przeciwciało anty-królicze; 1:1,000 BSA-PBS-Triton X-100) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności.</li>
		<li>Umyć 3 razy 200 μL 1x PBS.</li>
		<li>Usuń szkiełka nakrywkowe za pomocą pęsety i umieść je stroną zadrukowaną do dołu z 3 μl podłoża montażowego zawierającego DAPI na szkiełkach podstawowych.</li>
		<li>Zbadaj próbki za pomocą konfokalnego mikroskopu fluorescencyjnego z odwróconą bazą, wyposażonego w HCX PL APO 40X 0,75-1,25 zanurzenie w oleju objective15.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oznaczanie ilościowe jąder uwalniających NET
	<ol>
		<li>Otwórz oprogramowanie do przetwarzania obrazów (np. ImageJ), a następnie przeciągnij i upuść interesujący Cię obraz na pasek narzędzi.</li>
		<li>Kliknij "Wtyczki", "Analizuj" i "Licznik komórek".</li>
		<li>Naciśnij przycisk "Zainicjuj" w oknie licznika i wybierz typ licznika (np. kliknij 7 na czerwono dla komórek zwalniających NET i 8 na żółto dla komórek niezwalniających, jak pokazano na rysunku 6B-i i ii). 
		UWAGA: Kryteria dla komórek NET-dodatnich: dodatnio zabarwione zielone jądro + mniej gęste jądro (utrata logulacji) lub utrata okrągłego kształtu jądra + zwiększony rozmiar jądra lub wystąpienie wyraźnego zewnątrzkomórkowego odrostu.</li>
		<li>Kliknij każdą komórkę spełniającą powyższe kryteria i zapisz zliczoną liczbę komórek w arkuszu danych oprogramowania analitycznego.</li>
		<li>Oblicz procent komórek uwalniających NET, używając zliczonych liczb komórek uwalniających i nieuwalniających NET.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Riethmuller, J., Riehle, A., Grassme, H., Gulbins, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+rafts+in+host-pathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Membrane rafts in host-pathogen interactions.</a> Biochim Biophys Acta. 1758 (12), 2139-2147 (2006).</li>
<li>Shahbazian, H., Atrian, A., Yazdanpanah, L., Lashkarara, G. R., Zafar Mohtashami, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25866715">Anti-inflammatory effect of simvastatin in hemodialysis patients.</a> Jundishapur J Nat Pharm Prod. 10, e17962(2015).</li>
<li>Bavari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+raft+microdomains%3A+A+gateway+for+compartmentalized+trafficking+of+Ebola+and+Marburg+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Lipid raft microdomains: A gateway for compartmentalized trafficking of Ebola and Marburg viruses.</a> J Exp Med. 195, 593-602 (2002).</li>
<li>Zaas, D. W., Duncan, M., Rae Wright,, J,, Abraham, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+lipid+rafts+in+the+pathogenesis+of+bacterial+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">The role of lipid rafts in the pathogenesis of bacterial infections.</a> Biochim Biophys Acta. 1746 (3), 305-313 (2005).</li>
<li>Rohde, M., Muller, E., Chhatwal, G. S., Talay, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+cell+caveolae+act+as+an+entry-port+for+group+A+streptococci%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Host cell caveolae act as an entry-port for group A streptococci.</a> Cell Microbiol. 5 (5), 323-342 (2003).</li>
<li>Grassme, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+defense+against+Pseudomonas+aeruginosa+requires+ceramide-rich+membrane+rafts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Host defense against Pseudomonas aeruginosa requires ceramide-rich membrane rafts.</a> Nat Med. 9 (3), 322-330 (2003).</li>
<li>Heung, L. J., Luberto, C., Del Poeta, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+sphingolipids+in+microbial+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Role of sphingolipids in microbial pathogenesis.</a> Infect Immun. 74 (1), 28-39 (2006).</li>
<li>Gatfield, J., Pieters, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+role+for+cholesterol+in+entry+of+mycobacteria+into+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Essential role for cholesterol in entry of mycobacteria into macrophages.</a> Science. 288 (5471), 1647-1650 (2000).</li>
<li>Rapini, R. P., Bolognia, J. L., Jorizzo, J. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRapini%2C+RP+%22Dermatology+2-Volume+Set%22">Dermatology 2-Volume Set</a>. , St. Louis: Mosby. (2007).</li>
<li>Tamilselvam, B., Daefler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Francisella+targets+cholesterol-rich+host+cell+membrane+domains+for+entry+into+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Francisella targets cholesterol-rich host cell membrane domains for entry into macrophages.</a> J Immunol. 180 (12), Baltimore, Md. 8262-8271 (2008).</li>
<li>Garner, M. J., Hayward, R. D., Koronakis, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Salmonella+pathogenicity+island+1+secretion+system+directs+cellular+cholesterol+redistribution+during+mammalian+cell+entry+and+intracellular+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The Salmonella pathogenicity island 1 secretion system directs cellular cholesterol redistribution during mammalian cell entry and intracellular trafficking.</a> Cell Microbiol. 4 (3), 153-165 (2002).</li>
<li>Gilk, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+colonization+of+host+cells+in+the+absence+of+cholesterol%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Bacterial colonization of host cells in the absence of cholesterol.</a> PLoS Pathog. 9 (1), e1003107(2013).</li>
<li>Tuong, Z. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+Ror%CE%B11+and+cholesterol+25-hydroxylase+expression+attenuates+phagocytosis+in+male+Roralphasg%2Fsg+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Disruption of Rorα1 and cholesterol 25-hydroxylase expression attenuates phagocytosis in male Roralphasg/sg mice.</a> Endocrinology. 154 (1), 140-149 (2013).</li>
<li>Bryan, A. M., Farnoud, A. M., Mor, V., Del Poeta, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+cholesterol+depletion+and+its+effect+on+the+phagocytosis+of+Cryptococcus+neoformans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Macrophage cholesterol depletion and its effect on the phagocytosis of Cryptococcus neoformans.</a> J Vis Exp. (94), (2014).</li>
<li>Neumann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+alterations+in+human+blood-derived+neutrophils+lead+to+formation+of+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Lipid alterations in human blood-derived neutrophils lead to formation of neutrophil extracellular traps.</a> Eur J Cell Biol. 93 (8-9), 347-354 (2014).</li>
<li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li>
<li>von Köckritz-Blickwede, M., Nizet, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immunity+turned+inside-out%3A+antimicrobial+defense+by+phagocyte+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Innate immunity turned inside-out: antimicrobial defense by phagocyte extracellular traps.</a> J Mol Med. 87 (8), 775-783 (2009).</li>
<li>Fuchs, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+cell+death+program+leads+to+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps.</a> J. Cell Biol. 176 (2), 231-241 (2007).</li>
<li>Lauth, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M1+Protein+Allows+Group+A+Streptococcal+Survival+in+Phagocyte+Extracellular+Traps+through+Cathelicidin+Inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22J+Innate+Immun%22%5BJournal%5D)">M1 Protein Allows Group A Streptococcal Survival in Phagocyte Extracellular Traps through Cathelicidin Inhibition.</a> J Innate Immun. 1 (3), 202-214 (2009).</li>
<li>Chow, O. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statins+Enhance+Formation+of+Phagocyte+Extracellular+Traps%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Statins Enhance Formation of Phagocyte Extracellular Traps.</a> Cell Host Microbe. 8 (5), 445-454 (2010).</li>
<li>Simons, K., Vaz, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model+systems%2C+lipid+rafts%2C+and+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biophys+Biomol+Struct%22%5BJournal%5D)">Model systems, lipid rafts, and cell membranes.</a> Annu Rev Biophys Biomol Struct. 33, 269-295 (2004).</li>
<li>Bligh, E. G., Dyer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+method+of+total+lipid+extraction+and+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Can+J+Biochem+Physiol%22%5BJournal%5D)">A rapid method of total lipid extraction and purification.</a> Can J Biochem Physiol. 37, 911-917 (1959).</li>
<li>Brogden, G., Propsting, M., Adamek, M., Naim, H. Y., Steinhagen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+analysis+of+membrane+lipids+and+lipid+rafts+in+common+carp+%28Cyprinus+carpio+L%29%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Biochem+Physiol+B+Biochem+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and analysis of membrane lipids and lipid rafts in common carp (Cyprinus carpio L).</a> Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 169, 9-15 (2014).</li>
<li>Saldanha, T., Sawaya, A. C., Eberlin, M. N., Bragagnolo, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HPLC+separation+and+determination+of+12+cholesterol+oxidation+products+in+fish%3A+comparative+study+of+RI%2C+UV%2C+and+APCI-MS+detectors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Agric+Food+Chem%22%5BJournal%5D)">HPLC separation and determination of 12 cholesterol oxidation products in fish: comparative study of RI, UV, and APCI-MS detectors.</a> J Agric Food Chem. 54 (12), 4107-4113 (2006).</li>
<li>Hubicka, U., Krzek, J., Woltynska, H., Stachacz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+identification+and+quantitative+determination+of+selected+aminoglycoside+antibiotics+by+thin-layer+chromatography+and+densitometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+AOAC+Int%22%5BJournal%5D)">Simultaneous identification and quantitative determination of selected aminoglycoside antibiotics by thin-layer chromatography and densitometry.</a> J AOAC Int. 92 (4), 1068-1075 (2009).</li>
<li>Maalouf, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+lipid+composition+in+Fabry+disease+leads+to+an+intracellular+block+of+the+detergent-resistant+membrane-associated+dipeptidyl+peptidase+IV%5BTitle%5D)+AND+%22J+Inherit+Metab+Dis%22%5BJournal%5D)">A modified lipid composition in Fabry disease leads to an intracellular block of the detergent-resistant membrane-associated dipeptidyl peptidase IV.</a> J Inherit Metab Dis. 33 (4), 445-449 (2010).</li>
<li>Correia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicobacter+pylori%27s+cholesterol+uptake+impacts+resistance+to+docosahexaenoic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Med+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Helicobacter pylori's cholesterol uptake impacts resistance to docosahexaenoic acid.</a> Int J Med Microbiol. 304 (3-4), 314-320 (2014).</li>
<li>Gorudko, I. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lectin-induced+activation+of+plasma+membrane+NADPH+oxidase+in+cholesterol-depleted+human+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">Lectin-induced activation of plasma membrane NADPH oxidase in cholesterol-depleted human neutrophils.</a> Arch Biochem Biophys. 516 (2), 173-181 (2011).</li>
<li>Masoud, R., Bizouarn, T., Houée-Levin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholesterol%3A+A+modulator+of+the+phagocyte+NADPH+oxidase+activity+-+A+cell-free+study%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biol%22%5BJournal%5D)">Cholesterol: A modulator of the phagocyte NADPH oxidase activity - A cell-free study.</a> Redox Biol. 3, 16-24 (2014).</li>
<li>Knight, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptidylarginine+deiminase+inhibition+is+immunomodulatory+and+vasculoprotective+in+murine+lupus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Peptidylarginine deiminase inhibition is immunomodulatory and vasculoprotective in murine lupus.</a> J Clin Invest. 123 (7), 2981-2993 (2013).</li>
<li>Reichel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harbour+seal+%28Phoca+vitulina%29+PMN+and+monocytes+release+extracellular+traps+to+capture+the+apicomplexan+parasite+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Comp+Immunol%22%5BJournal%5D)">Harbour seal (Phoca vitulina) PMN and monocytes release extracellular traps to capture the apicomplexan parasite Toxoplasma gondii.</a> Dev Comp Immunol. 50 (2), 106-115 (2015).</li>
<li>Chuammitri, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chicken+heterophil+extracellular+traps+%28HETs%29%3A+novel+defense+mechanism+of+chicken+heterophils%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Immunol+Immunopathol%22%5BJournal%5D)">Chicken heterophil extracellular traps (HETs): novel defense mechanism of chicken heterophils.</a> Vet Immunol Immunopathol. 129, 126-131 (2009).</li>
<li>Palic, D., Ostojic, J., Andreasen, C. B., Roth, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fish+cast+NETs%3A+Neutrophil+extracellular+traps+are+released+from+fish+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Comp+Immunol%22%5BJournal%5D)">Fish cast NETs: Neutrophil extracellular traps are released from fish neutrophils.</a> Dev Comp Immunol. 31 (8), 805-816 (2007).</li>
<li>Ng, T. H., Chang, S. H., Wu, M. H., Wang, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shrimp+hemocytes+release+extracellular+traps+that+kill+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Comp+Immunol%22%5BJournal%5D)">Shrimp hemocytes release extracellular traps that kill bacteria.</a> Dev Comp Immunol. 41 (4), 644-651 (2013).</li>
<li>Hawes, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+DNA%3A+the+tip+of+root+defenses%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Extracellular DNA: the tip of root defenses?</a> Plant Sci. 180 (6), 741-745 (2011).</li>
<li>Brinkmann, V., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps%3A+is+immunity+the+second+function+of+chromatin%3F%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin?</a> J Cell Biol. 198 (5), 773-783 (2012).</li>
<li>Xu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+raft-associated+%CE%B2-adducin+is+required+for+PSGL-1-mediated+neutrophil+rolling+on+P-selectin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Lipid raft-associated β-adducin is required for PSGL-1-mediated neutrophil rolling on P-selectin.</a> J Leukoc Biol. 97 (2), 297-306 (2015).</li>
<li>Ermert, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+neutrophil+extracellular+traps+in+microbial+infections%5BTitle%5D)+AND+%22J+Innate+Immun%22%5BJournal%5D)">Mouse neutrophil extracellular traps in microbial infections.</a> J Innate Immun. 1 (3), 181-193 (2009).</li>
<li>Metzler, K. D., Goosmann, C., Lubojemska, A., Zychlinsky, A., Papayannopoulos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+myeloperoxidase-containing+complex+regulates+neutrophil+elastase+release+and+actin+dynamics+during+NETosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">A myeloperoxidase-containing complex regulates neutrophil elastase release and actin dynamics during NETosis.</a> Cell Rep. 8 (3), 883-896 (2014).</li>
<li>McGee, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholesterol+enhances+Helicobacter+pylori+resistance+to+antibiotics+and+LL-37%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Cholesterol enhances Helicobacter pylori resistance to antibiotics and LL-37.</a> Antimicrob Agents Chemother. 55 (6), 2897-2904 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisane tutaj metody mogą być stosowane do analizy określonych lipidów, takich jak cholesterol, za pomocą HPTLC lub HPLC oraz do badania wpływu farmakologicznych zmian lipidowych na tworzenie NET (patrz Neumann i wsp.Rozdział 15).
HPTLC jest stosunkowo opłacalną i prostą metodą analizy szerokiego zakresu lipidów w dużej liczbie próbek. Metoda ta została wykorzystana w wielu obszarach badawczych, w tym w oznaczaniu ilościowym antybiotyków25</su...

Wykazano, że lipidy odgrywają ważną rolę w homeostazie komórki, śmierci komórki, interakcjach gospodarz-patogen i uwalnianiu cytokin1. Z biegiem czasu wzrosło zainteresowanie i wiedza na temat wpływu lipidów na interakcje gospodarz-patogen lub stan zapalny, a kilka publikacji potwierdza centralną rolę niektórych lipidów, zwłaszcza cholesterolu steroidowego, w odpowiedziach komórkowych. Leczenie farmakologiczne statynami, które są stosowane jako inhibitory biosyntezy cholesterolu poprzez blokowanie 3-hydroksy-3-metyloglutarylo-koenzym-A-reduktazy (HMG-CoA-reduktazy), może działać jako środki przeciwzapalne poprzez obniżenie poziomu interleukiny 6 i białka C-reaktywnego w surowicy2. Struktury wzbogacone w cholesterol i glikosfingolipidy mogą być wykorzystywane przez kilka patogenów, takich jak bakterie i wirusy, jako brama do host3,4,5,6. Wykazano, że sfingolipidy (np. sfingomielina) są wykorzystywane przez patogeny do promowania ich chorobotwórczości7. W makrofagach prątki wykorzystują domeny wzbogacone w cholesterol do wnikania do komórek; Niedobór cholesterolu hamuje wychwyt prątków<klasa SUP="xref">8. Co więcej, zakażenie makrofagów Francisella tularensis, odzwierzęcym czynnikiem odpowiedzialnym za tularemię (znaną również jako gorączka królików)9, doprowadziło do infekcji, która została zniesiona, gdy cholesterol został usunięty z błon10. Podobnie, wykazano, że inwazja Escherichia coli na komórki gospodarza przez struktury bogate w lipidy jest zależna od cholesterolu4. Co więcej, eksperymenty z zakażeniem Salmonellą typhimurium na komórkach nabłonka wykazały, że cholesterol jest niezbędny do wnikania patogenów do komórek11. Niedobór cholesterolu hamował wychwyt Salmonella11. Co więcej, niedawne badanie przeprowadzone przez Gilk i wsp. wykazano, że cholesterol odgrywa ważną rolę w wychwytywaniu Coxiella burnetti12. Dodatkowo Tuong i wsp. stwierdzono, że 25-hydroksycholesterol odgrywa kluczową rolę w fagocytozie przez makrofagi stymulowane lipopolisacharydami (LPS)13. Fagocytoza została zmniejszona, gdy makrofagi były leczone farmakologicznie w celu obniżenia poziomu cholesterolu14. Tak więc cholesterol i inne lipidy wydają się odgrywać ważną rolę w infekcjach i stanach zapalnych, ponieważ ich wyczerpanie może zmniejszyć ryzyko inwazji kilku patogenów10,11,12.
Ostatnio udało nam się wykazać, że zmiany lipidowe, zwłaszcza niedobór cholesterolu w komórce, indukują powstawanie pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili (NET) w neutrofilach pochodzących z ludzkiej krwi15. Od czasu odkrycia NET w 2004 r. wykazano, że odgrywają one kluczową rolę w uwięzieniu bakterii, a tym samym w utrudnianiu rozprzestrzeniania się infekcji16,17. NET składają się ze szkieletu DNA związanego z histonami, proteazami i peptydami przeciwdrobnoustrojowymi16. Uwalnianie NET przez neutrofile może być indukowane przez atakujące patogeny18,19 oraz substancje chemiczne, takie jak octan forbolu (PMA) lub statyny16,20. Jednak szczegółowe mechanizmy komórkowe, a zwłaszcza rola lipidów w tym procesie, wciąż nie są do końca jasne. Analiza lipidów może prowadzić do lepszego zrozumienia mechanizmów zaangażowanych w wiele różnych procesów i interakcji komórkowych, takich jak uwalnianie NET. Cholesterol i sfingomielina są istotnymi składnikami błony komórkowej i mikrodomen lipidowych, gdzie dodają stabilności i ułatwiają grupowanie białek biorących udział w transporcie białek i zdarzeniach sygnalizacyjnych21. Aby zbadać mechanistyczną rolę niektórych lipidów, amfifilowe środki farmakologiczne, takie jak cykliczny oligosacharyd metylo-β-cyklodekstryna (MβCD), mogą być stosowane do zmiany składu lipidowego komórki i obniżenia poziomu cholesterolu in vitro15. W tym miejscu przedstawiamy metodę wykorzystania HPTLC do analizy składu lipidowego neutrofili w odpowiedzi na MβCD. HPLC wykorzystano do potwierdzenia poziomu cholesterolu w populacji neutrofili. Ponadto opisujemy metodę wizualizacji powstawania NET za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej w neutrofilach pochodzących z ludzkiej krwi w odpowiedzi na MβCD.

<table><tbody><tr><td colspan="4"><silna>izolacja neutrofili, barwienie i kwantyfikacja NET</td></tr><tr><td>Alexa Mąka 633 koza anty-królicza IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A-21070</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-MPO&alfa</td><td>Dako</td><td>A0398</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3912-100G</td><td></td></tr><tr><td>Marienfeld-Neubauer ulepszona komora licząca</td><td>Celeromics</td><td>MF-0640010</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny TCS SP5 AOBS ze skanerem tandemowym</td><td>Leica</td><td>DMI6000CS</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&acute; s PBS 10x</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5493-1L</td><td>Rozcieńczyć 1:10 w wodzie dla 1x roztwór roboczy</td></tr><tr><td>Dy Light 488 sprzężony wysoce wchłaniany krzyżowo</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35503</td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td>2010</td><td></td></tr><tr><td>DNA/Histone 1</td><td>przeciwciało Millipore</td><td>MAB3864</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>1,8</td><td>http://imagej.nih.gov/ij/</td></tr><tr><td>Mikroskop świetlny</td><td>VWR</td><td>630-1554</td><td></td></tr><tr><td>Metylo-&beta;-cyklodekstryna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4555-1G</td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>Carl Roth</td><td>0335.3</td><td>rozpuszczać w wodzie, podgrzewać do 65 &stopni; C i dodać 1 N NaOH do klarownego roztworu</td></tr><tr><td>PMA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8139-1MG</td><td>Stock 16 &micro; M, rozpuszczony w 1x PBS</td></tr><tr><td>Poli-L-lizyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>Polymorphprep</td><td>AXIS-SHIELD</td><td>AN1114683</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold odczynnik zapobiegający blaknięciu z DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>P7481</td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT PicoGreen dsDNA Odczynnik</td><td>Invitrogen</td><td>P7581</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640</td><td>PAA</td><td>E 15-848</td><td></td></tr><tr><td>HBSS z CaCl oraz Mg</td><td>Sigma</td><td>H6648</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787-50ml</td><td></td></tr><tr><td>Trypanblue</td><td>Invitrogen</td><td>15250-061</td><td>0,4% roztwór</td></tr><tr><td>Woda</td><td>Carl Roth</td><td>3255.1</td><td>bez endotoksyn</td></tr><tr><td><silny>Nazwa</silny></td><td><silny>Firma</silny</td><td>><silny>Numer katalogowy&nbsp; </td><td>Komentarze</td></tr><tr><td colspan="4">Izolacja i analiza lipidów</td></tr><tr><td>1-propanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>33538</td><td></td></tr><tr><td>10 &micro; Strzykawka L</td><td>Hamilton</td><td>701 NR 10 &micro; l</td><td></td></tr><tr><td>Eter dietylowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>346136</td><td></td></tr><tr><td>Octan etylu</td><td>Carl Roth</td><td>7336.2</td><td></td></tr><tr><td>Canullla 26 G</td><td>Braun</td><td>4657683</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan miedzi(II)pentahydrat</td><td>Merck</td><td>1027805000</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Carl Roth</td><td>7331.1</td><td></td></tr><tr><td>CP ATLAS oprogramowanie</td><td>Lazarsoftware</td><td>2.0</td><td></td></tr><tr><td>Chromolith o wysokiej rozdzielczości RP-18 z końcówką 100-4,6 mm kolumna</td><td>Merck</td><td>152022</td><td></td></tr><tr><td>Wysokowydajny chromatograf cieczowy Chromaster</td><td>Hitachi</td><td>HITA 892-0080-30Y</td><td>Parametry są zależne od indywidualnej maszyny HPLC</td></tr><tr><td>Detektor UV HPLC</td><td>Hitachi</td><td>5410</td><td></td></tr><tr><td>Piec kolumnowy HPLC</td><td>Hitachi</td><td>5310</td><td></td></tr><tr><td>HPLC Auto Próbnik</td><td>Hitachi</td><td>5260</td><td></td></tr><tr><td>Pompa HPLC</td><td>Hitachi</td><td>5160</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Carl Roth</td><td>7342.1</td><td></td></tr><tr><td>n-heksan</td><td>Carl Roth</td><td>7339.1</td><td></td></tr><tr><td>Kwas fosforowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30417</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Merck</td><td>49,361,000</td><td></td></tr><tr><td>Potters</td><td>LAT Garbsen</td><td>5 ml</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Carl Roth</td><td>CN30.3</td><td></td></tr><tr><td>Żel krzemionkowy HPTLC 60</td><td>Merck</td><td>105553</td><td></td></tr><tr><td>Vacufuge plus podstawowe urządzenie</td><td>Eppendorf</td><td>22820001</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar hodowla komórkowa Płytka 48-dołkowa, płaskie dno</td><td>Sigma</td><td>CLS3548</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko nakrywkowe</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1198882</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko szkiełkowe</td><td>Carl Roth</td><td>1879</td><td></td></tr><tr><td>BD Strzykawka tuberkulinowa Tylko 1 ml</td><td>BD Bioscience</td><td>309659</td><td></td></tr></tbody></table>

metody badania zmian lipidowych w neutrofilach i późniejszego tworzenia pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili

Methods to Study Lipid Alterations in Neutrophils and the Subsequent Formation of Neutrophil Extracellular Traps

Analiza lipidów wykonywana za pomocą wysokosprawnej chromatografii cienkowarstwowej (HPTLC) jest stosunkowo prostą, opłacalną metodą analizy szerokiego zakresu lipidów. Doniesiono, że funkcja lipidów (np. w interakcjach gospodarz-patogen lub wnikaniu gospodarza) odgrywa kluczową rolę w procesach komórkowych. W tym miejscu pokazujemy metodę określania składu lipidowego, ze szczególnym uwzględnieniem poziomu cholesterolu w pierwotnych neutrofilach pochodzenia we krwi, za pomocą HPTLC w porównaniu z wysokosprawną chromatografią cieczową (HPLC). Celem było zbadanie roli zmian lipidowych/cholesterolowych w tworzeniu zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofilowych (NET). Uwalnianie NET jest znane jako mechanizm obronny gospodarza, aby zapobiec rozprzestrzenianiu się patogenów w gospodarzu. Dlatego ludzkie neutrofile pochodzące z krwi traktowano metylo-β-cyklodekstryną (MβCD) w celu wywołania zmian lipidowych w komórkach. Za pomocą HPTLC i HPLC wykazaliśmy, że leczenie komórek MβCD prowadzi do zmian lipidowych związanych ze znacznym obniżeniem zawartości cholesterolu w komórce. W tym samym czasie leczenie neutrofili MβCD doprowadziło do powstania NET, co wykazano za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej. Podsumowując, przedstawiamy szczegółową metodę badania zmian lipidowych w neutrofilach i powstawania NET.

Neutrofile pochodzące z ludzkiej krwi wyizolowano metodą wirowania w gradiencie gęstości (Rysunek 2). Aby zbadać wpływ zmian w składzie lipidów na neutrofile, komórki potraktowano 10 mM MβCD, który usuwa cholesterol z komórek. Następnie lipidy wyizolowano z próbek metodą Bligha i Dyera (Rysunek 1, panel lewy), zgodnie z opisem Brogden et al.23. Przygotowane próbki lipidów naniesiono na płytki HPTLC z żelem krzemionkowym i ...

Wiadomo, że lipidy odgrywają ważną rolę w funkcjach komórkowych. W tym miejscu opisujemy metodę określania składu lipidowego neutrofili, z naciskiem na poziom cholesterolu, przy użyciu zarówno HPTLC, jak i HPLC, aby lepiej zrozumieć mechanizmy leżące u podstaw tworzenia pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili.

Metody badania zmian lipidowych w neutrofilach i późniejszego tworzenia pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of ...

Ogólnym celem tej metody jest zbadanie zmian w składzie lipidowym neutrofili podczas uwalniania zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili za pomocą chromatografii cienkowarstwowej i HPLC. Metoda ta może być wykorzystana do uzyskania bardziej szczegółowych informacji na temat mechanizmów, które są zaangażowane w tworzenie zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili, lub w skrócie nazywanych powstawaniem NET. Główną zaletą tej procedury jest to, że dostarcza informacji na temat roli lipidów w ogólnym funkcjonowaniu neutrofili poprzez wykorzystanie łatwego do naśladowania protokołu.Izolację komórek pochodzących z ludzkiej krwi zademonstruje była doktorantka naszego laboratorium, Ariane Neumann. A asystować jej będzie Friederike Reuner. Przygotowanie komórek do analizy lipidów zostanie zademonstrowane przez Grahama Brogdena, doktora habilitowanego w moim laboratorium, oraz Diaba Huseina, magistranta w programie biochemii.Aby wyizolować neutrofile pochodzące z ludzkiej krwi, należy nałożyć około 20 ml krwi na 20 ml roztworu diatrizoianu/dekstranu sodu w pobliżu płomienia, bez mieszania. Wirować przez 30 minut przy 470 razy g bez hamowania. Bardzo ważne jest, aby nie mieszać fazy krwi ze stopniem gęstości w roztworze.Po etapie wirowania należy ostrożnie usunąć komórki jednojądrzaste, aby uniknąć zanieczyszczenia lub niespecyficznej aktywacji komórek. Usuń komórki jednojądrzaste i żółtawą warstwę plazmy. Przenieś komórkę wielojądrzastą lub fazę PMN do nowej probówki o pojemności 50 ml i napełnij ją do 50 ml solą fizjologiczną buforowaną 1X.Odwirowywać próbkę przez 10 minut w temperaturze 470 razy g z hamowaniem. Następnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 5 ml sterylnej wody na pięć sekund w celu lizy erytrocytów. Natychmiast napełnij probówkę do 50 ml 1X PBS i odwiruj próbkę.Po usunięciu supernatantu osad powinien być biały. Jeśli nadal jest czerwony, powtórz te kroki. Następnie ponownie zawiesić granulat w 1000 mikrolitrach Roswell Park Memorial Institute lub podłoża RPMI.Policz liczbę komórek za pomocą barwienia błękitem trypanowym i hemocytometru pod mikroskopem świetlnym. Przygotować zawiesinę komórek w RPMI o stężeniu dwóch milionów komórek na ml. Około 25 milionów neutrofili można pobrać z 20 ml krwi.Aby farmakologicznie leczyć neutrofile do analizy lipidów, należy użyć 15 milionów przygotowanych komórek. Inkubować próbki w probówkach reakcyjnych przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Po odwirowaniu próbek należy usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 300 mikrolitrach HBSS.Po ponownym odwirowaniu próbki przy użyciu tych samych parametrów, ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml roztworu chloroformu:metanolu w stosunku 1:1. Następnie homogenizuj ponownie zawieszony osad za pomocą kaniuli o rozmiarze 26, wciskając i wyjmując próbkę ze strzykawki o pojemności 1 ml 10 razy. Aby wyizolować lipidy z ludzkich neutrofili pochodzenia obwodowego we krwi, należy pobrać przygotowane neutrofile i umieścić je na lodzie.Odpipetować granulofile do szklanej probówki o pojemności 15 ml z nakrętką z uszczelką z PTFE i homogenizować je, wstrząsając przez jedną minutę. Następnie dodaj 2 ml metanolu, a minutę później 1 ml chloroformu. Po wstrząsaniu przez kolejną minutę obracaj szklane rurki w temperaturze pokojowej i 50 obr./min przez 30 minut.Następnie otocz frakcję białkową, odwirowując roztwór w temperaturze 7 stopni Celsjusza i 1,952 razy g przez 10 minut. Ostrożnie zdekantować supernatant do nowej szklanej probówki z nakrętką o pojemności 15 ml, pozostawiając osad zawierający białko. Przechowuj pelety w temperaturze 20 stopni Celsjusza do przyszłej kwantyfikacji.Dodaj 1 ml chloroformu i odczekaj minutę. Następnie dodaj 1 ml podwójnie destylowanej wody i odwróć szklaną rurkę z nakrętką z próbką na 30 sekund. Po odwirowaniu próbki, jak poprzednio, należy usunąć i wyrzucić górną fazę do warstwy mętnej, ale nie włączając jej.Wysuszyć próbki w koncentratorze próżniowym w temperaturze 60 stopni Celsjusza i przechowywać je w temperaturze 20 stopni Celsjusza do czasu, gdy będą potrzebne. Na początek napełnij do 5 ml każdego roztworu w odpowiedniej szklanej komorze. Dodaj dowolny rodzaj bibuły filtracyjnej, aby zwiększyć prędkość pracy w każdej komorze.Wstępnie inkubuj szklaną płytkę z żelem krzemionkowym HPTLC o wymiarach 20x10 cm 60 w pierwszym roztworze. Gdy bieżący roztwór dotrze do górnej części płytki, susz go przez 10 minut w temperaturze 110 stopni Celsjusza. Rozpuścić osad lipidowy, uzyskany uprzednio po wysuszeniu za pomocą koncentratora próżniowego, w żądanej objętości roztworu chloroformu:metanolu w stosunku 1:1 i inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza do rozpuszczenia.Następnie za pomocą linijki i miękkiego ołówka zaznacz miejsca załadunku dla żądanej liczby próbek oraz co najmniej jednego wzorca. Oznaczyć długość biegu na poziomie około 4 cm dla pierwszego roztworu do biegania i na około 6 cm dla drugiego roztworu do biegania. Aby załadować próbki, przed załadowaniem każdej nowej próbki umyj strzykawkę o pojemności 10 mikrolitrów w chloroformie: metanolu w proporcji 1:1.Załaduj kroplami 10 mikrolitrów każdej próbki, starając się skoncentrować próbkę na jak najmniejszym obszarze. Umieść płytkę pionowo w pierwszej komorze z bieżącym roztworem pierwszym. Upewnij się, że płytka jest równoległa do ścianki szklanej komory, aby uzyskać równomierną prędkość migracji.Należy zwrócić uwagę, aby płytki były umieszczone równolegle do tylnej ścianki szklanych komór i aby czoła rozpuszczalnika nie sięgały zbyt daleko, aby zapewnić skuteczne oddzielenie lipidów. Gdy linia rozpuszczalnika dotrze do pierwszego znaku, wyjmij płytkę, wysusz ją i umieść w drugim roztworze. Powtórz podobne kroki dla drugiego i trzeciego uruchomionego rozwiązania.Pozostawić płytkę w roztworze do momentu, gdy czoło rozpuszczalnika dotrze do górnej części płytki. Następnie wyjmij płytkę i susz ją w temperaturze pokojowej przez minutę. Umieść płytkę w roztworze siarczanu miedzi na siedem sekund.Po dokładnym wysuszeniu talerza pieczemy go w piekarniku przez siedem minut w temperaturze 170 stopni Celsjusza. Wyjmij talerz z piekarnika i pozwól mu ostygnąć. Aby wykonać HPLC, przymocuj kolumnę do wkładu ochronnego na instrumencie i podgrzej ją do 32 stopni Celsjusza.Stosować metanol jako fazę ruchomą przy natężeniu przepływu 1 ml na minutę i ciśnieniu 65 barów. Ustaw detektor UV na pomiar przy 202 nanometrach, aby określić ilościowo ilość cholesterolu w każdej próbce. Przed analizą próbek należy dokładnie umyć maszynę HPLC i ustalić krzywą wzorcową cholesterolu zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Na koniec ponownie zawiesić próbki w 500 mikrolitrach chloroformu:metanolu w proporcji 1:1 w szklanych butelkach o pojemności 1,5 ml w kolorze bursztynowym z zakręcanymi czerwonymi pokrywkami z PTFE / białego silikonu przed załadowaniem ich do instrumentu HPLC. Pokazano tutaj profil lipidowy neutrofili na płytce HPTLC. Lipidy można zidentyfikować, porównując odległości migracji ze wzorcem.Pokazano również chromatogram HPLC pokazujący dwa duże piki. Pierwszy pik tuż przed dwiema minutami to chloroform. Drugim dużym szczytem po pięciu minutach jest cholesterol.Pokazano tutaj standardowe krzywe cholesterolu wyznaczone za pomocą HPLC i HPTLC. Krzywa wzorcowa uzyskana za pomocą HPLC jest liniowa w szerszym zakresie stężeń w porównaniu z krzywą wzorcową HPTLC. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wyizolować neutrofile pochodzące z ludzkiej krwi, a następnie przeanalizować ich skład lipidowy.Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o założeniu rękawic nitrylowych w celu ochrony rąk przed niebezpiecznym narażeniem na działanie chloroformu:metanolu, a także o pracy pod wyciągiem. Przyszłe eksperymenty dostarczą dalszych informacji na temat mechanizmów związanych z powstawaniem NET i ogólnych funkcji neutrofili, które wciąż nie są w pełni poznane. Nie zapominaj, że praca z pierwotnymi komórkami pochodzącymi z ludzkiej krwi wymaga pozwolenia etycznego, a także odpowiednich środków ostrożności, takich jak praca w odpowiednim laboratorium bezpieczeństwa biologicznego, aby uniknąć ryzyka narażenia na ludzkie patogeny.Wreszcie, celem naszego badania jest znalezienie nowych celów terapeutycznych przeciwko infekcji w oparciu o wrodzony układ odpornościowy, a zwłaszcza skład lipidów jest dla nas bardzo interesujący, ponieważ pomoże nam zrozumieć, dlaczego neutrofile działają przeciwbakteryjnie przeciwko infekcji.

methods-to-study-lipid-alterations-neutrophils-subsequent-formation

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Zewnątrzkomórkowe pułapki neutrofilowe (NETs) stanowią istotny mechanizm odporności wrodzonej służący do zwalczania patogennych bakterii, grzybów i pasożytów. W niniejszym opracowaniu opisujemy metody izolacji granulocytów neutrofilowych z krwi ludzkiej oraz ich aktywacji w celu tworzenia NETs. Przedstawiamy techniki przygotowania próbek umożliwiające wizualizację NETs w mikroskopii świetlnej i elektronowej.

Zewnątrzkomórkowe pułapki neutrofilowe: Jak je generować i wizualizować

Ten film demonstruje technikę in vitro do generowania i izolowania neutrofili w pułapkach zewnątrzkomórkowych (NET). Neutrofile są izolowane z krwi obwodowej i stymulowane octanem mirystynianu forbolu (PMA) w celu wytworzenia NET. Podczas inkubacji neutrofile przechodzą proces śmierci komórki (NETosis) w celu uwolnienia NET zawierających zdekondensowaną chromatynę zmieszaną z ziarnistymi białkami cytoplazmatycznymi.

Technika in vitro do generowania ludzkich pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofilów

Ten film demonstruje indukcję i wizualizację zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili lub NET w wstępnie oznakowanych neutrofilach przy użyciu surowicy pacjenta zawierającej przeciwciała cytoplazmatyczne anty-neutrofilowe. Co więcej, zastosowanie nieprzepuszczalnego barwnika DNA i mikroskopii fluorescencyjnej umożliwia wizualizację NET.

Indukcja i wizualizacja zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili we wstępnie znakowanych neutrofilach

Opisujemy metody izolowania neutrofili u psów z krwi pełnej i wizualizacji powstawania NET w żywych neutrofilach za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Opisano również protokoły ilościowego oznaczania powstawania NET i ekspresji cytrulinowanego histonu H3 (citH3) za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej.

In vitro Tworzenie zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili u psów: analiza dynamiczna i ilościowa za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Ten protokół opisuje wysoce czuły i wysokoprzepustowy test pułapki zewnątrzkomórkowej neutrofili (NET) do półautomatycznego oznaczania ilościowego tworzenia ex vivo NET za pomocą immunofluorescencji trójwymiarowej mikroskopii konfokalnej. Protokół ten może być wykorzystany do oceny powstawania i degradacji NET po różnych bodźcach i może być wykorzystany do badania potencjalnych terapii ukierunkowanych na NET.

Wysokoprzepustowy test do oceny i ilościowego określania tworzenia pułapek zewnątrzkomórkowych w neutrofilach

Prezentowany tutaj jest protokół do wykrywania produkcji pułapek zewnątrzkomórkowych makrofagów (MET) w hodowli żywych komórek za pomocą mikroskopii i barwienia fluorescencyjnego. Protokół ten można dalej rozszerzyć w celu zbadania specyficznych markerów białka MET za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego.

Stymulacja in vitro i wizualizacja uwalniania pułapek zewnątrzkomórkowych w zróżnicowanych ludzkich makrofagach pochodzących z monocytów

Prezentowany tutaj jest protokół do indukcji i analizy in vitro zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofilowych (NET). Kwantyfikacja DNA, katelicydyny (LL37) i aktywności enzymów dostarczyła danych, które pokazują zmienność składu i morfologii NET indukowanych przez bodźce mikrobiologiczne i chemiczne w podobnie kontrolowanych warunkach.

Analiza morfologiczna i kompozycyjna pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili indukowanych bodźcami mikrobiologicznymi i chemicznymi

Prezentujemy zautomatyzowaną, wysokoprzepustową metodę ilościowego oznaczania pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili (NET) przy użyciu systemu analizy żywych komórek, w połączeniu z zależnym od przepuszczalności błony metodą podwójnego barwnika.

Technika wysokoprzepustowa w czasie rzeczywistym do ilościowego określania tworzenia się pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili w ludzkich neutrofilach

Ten zdefiniowany protokół opisuje podejście do mikroskopii wysokoprzepustowej w czasie rzeczywistym w celu wizualizacji i ilościowego określenia uwalniania ludzkich neutrofili zewnątrzkomórkowych (NET) in vitro. Powtarzalna metoda pozwala na zbadanie charakterystyki i kinetyki uwalniania NET po stymulacji odrębnymi induktorami NETozy oraz umożliwia ocenę farmakologii antagonistów NETozy.

Wysokoprzepustowa, mikroskopowa kwantyfikacja uwalniania ludzkich neutrofili z zewnątrzkomórkowych pułapek i ocena farmakologii antagonistów w czasie rzeczywistym

Opisano szereg metod, w tym izolację lipoprotein o niskiej gęstości (LDL) z ludzkiego osocza, różnicowanie komórek HL-60 w komórki podobne do neutrofili, przygotowanie pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili (NET) w obecności LDL oraz stymulację ludzkich komórek śródbłonka aorty mieszaniną NET i LDL.

Stymulacja komórek śródbłonka naczyń krwionośnych za pomocą zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofilowych w obecności lipoprotein o niskiej gęstości

Neutrofile o niskiej gęstości (LDN) znacznie wzrastają w kilku chorobach. LDN są zwykle izolowane poprzez sortowanie komórek. Przedstawiamy praktyczną metodę uzyskania czystego i skutecznego LDN. Po wirowaniu krwi obwodowej z gradientem gęstości komórki są inkubowane za pomocą mikrogranulek magnetycznych, a następnie LDN rozdzielane przez kolumny magnetyczne.

Szybka metoda magnetyczno-mikrokulkowa do efektywnego oczyszczania neutrofilów o niskiej gęstości

Poznaj metodę analizy składu lipidów neutrofili z krwi ludzkiej przy użyciu HPTLC i HPLC. Technika ta pozwala badać mechanizmy tworzenia pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili i rolę cholesterolu w funkcjach immunologicznych.

Metody badania zmian lipidowych w neutrofilach i późniejszego tworzenia pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili

Przeglądaj więcej filmów