Metody badania zmian lipidowych w neutrofilach i późniejszego tworzenia pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili

Ogólnym celem tej metody jest zbadanie zmian w składzie lipidowym neutrofili podczas uwalniania zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili za pomocą chromatografii cienkowarstwowej i HPLC. Metoda ta może być wykorzystana do uzyskania bardziej szczegółowych informacji na temat mechanizmów, które są zaangażowane w tworzenie zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili, lub w skrócie nazywanych powstawaniem NET. Główną zaletą tej procedury jest to, że dostarcza informacji na temat roli lipidów w ogólnym funkcjonowaniu neutrofili poprzez wykorzystanie łatwego do naśladowania protokołu.

Izolację komórek pochodzących z ludzkiej krwi zademonstruje była doktorantka naszego laboratorium, Ariane Neumann. A asystować jej będzie Friederike Reuner. Przygotowanie komórek do analizy lipidów zostanie zademonstrowane przez Grahama Brogdena, doktora habilitowanego w moim laboratorium, oraz Diaba Huseina, magistranta w programie biochemii.

Aby wyizolować neutrofile pochodzące z ludzkiej krwi, należy nałożyć około 20 ml krwi na 20 ml roztworu diatrizoianu/dekstranu sodu w pobliżu płomienia, bez mieszania. Wirować przez 30 minut przy 470 razy g bez hamowania. Bardzo ważne jest, aby nie mieszać fazy krwi ze stopniem gęstości w roztworze.

Po etapie wirowania należy ostrożnie usunąć komórki jednojądrzaste, aby uniknąć zanieczyszczenia lub niespecyficznej aktywacji komórek. Usuń komórki jednojądrzaste i żółtawą warstwę plazmy. Przenieś komórkę wielojądrzastą lub fazę PMN do nowej probówki o pojemności 50 ml i napełnij ją do 50 ml solą fizjologiczną buforowaną 1X.

Odwirowywać próbkę przez 10 minut w temperaturze 470 razy g z hamowaniem. Następnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 5 ml sterylnej wody na pięć sekund w celu lizy erytrocytów. Natychmiast napełnij probówkę do 50 ml 1X PBS i odwiruj próbkę.

Po usunięciu supernatantu osad powinien być biały. Jeśli nadal jest czerwony, powtórz te kroki. Następnie ponownie zawiesić granulat w 1000 mikrolitrach Roswell Park Memorial Institute lub podłoża RPMI.

Policz liczbę komórek za pomocą barwienia błękitem trypanowym i hemocytometru pod mikroskopem świetlnym. Przygotować zawiesinę komórek w RPMI o stężeniu dwóch milionów komórek na ml. Około 25 milionów neutrofili można pobrać z 20 ml krwi.

Aby farmakologicznie leczyć neutrofile do analizy lipidów, należy użyć 15 milionów przygotowanych komórek. Inkubować próbki w probówkach reakcyjnych przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Po odwirowaniu próbek należy usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 300 mikrolitrach HBSS.

Po ponownym odwirowaniu próbki przy użyciu tych samych parametrów, ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml roztworu chloroformu:metanolu w stosunku 1:1. Następnie homogenizuj ponownie zawieszony osad za pomocą kaniuli o rozmiarze 26, wciskając i wyjmując próbkę ze strzykawki o pojemności 1 ml 10 razy. Aby wyizolować lipidy z ludzkich neutrofili pochodzenia obwodowego we krwi, należy pobrać przygotowane neutrofile i umieścić je na lodzie.

Odpipetować granulofile do szklanej probówki o pojemności 15 ml z nakrętką z uszczelką z PTFE i homogenizować je, wstrząsając przez jedną minutę. Następnie dodaj 2 ml metanolu, a minutę później 1 ml chloroformu. Po wstrząsaniu przez kolejną minutę obracaj szklane rurki w temperaturze pokojowej i 50 obr./min przez 30 minut.

Następnie otocz frakcję białkową, odwirowując roztwór w temperaturze 7 stopni Celsjusza i 1,952 razy g przez 10 minut. Ostrożnie zdekantować supernatant do nowej szklanej probówki z nakrętką o pojemności 15 ml, pozostawiając osad zawierający białko. Przechowuj pelety w temperaturze 20 stopni Celsjusza do przyszłej kwantyfikacji.

Dodaj 1 ml chloroformu i odczekaj minutę. Następnie dodaj 1 ml podwójnie destylowanej wody i odwróć szklaną rurkę z nakrętką z próbką na 30 sekund. Po odwirowaniu próbki, jak poprzednio, należy usunąć i wyrzucić górną fazę do warstwy mętnej, ale nie włączając jej.

Wysuszyć próbki w koncentratorze próżniowym w temperaturze 60 stopni Celsjusza i przechowywać je w temperaturze 20 stopni Celsjusza do czasu, gdy będą potrzebne. Na początek napełnij do 5 ml każdego roztworu w odpowiedniej szklanej komorze. Dodaj dowolny rodzaj bibuły filtracyjnej, aby zwiększyć prędkość pracy w każdej komorze.

Wstępnie inkubuj szklaną płytkę z żelem krzemionkowym HPTLC o wymiarach 20x10 cm 60 w pierwszym roztworze. Gdy bieżący roztwór dotrze do górnej części płytki, susz go przez 10 minut w temperaturze 110 stopni Celsjusza. Rozpuścić osad lipidowy, uzyskany uprzednio po wysuszeniu za pomocą koncentratora próżniowego, w żądanej objętości roztworu chloroformu:metanolu w stosunku 1:1 i inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza do rozpuszczenia.

Następnie za pomocą linijki i miękkiego ołówka zaznacz miejsca załadunku dla żądanej liczby próbek oraz co najmniej jednego wzorca. Oznaczyć długość biegu na poziomie około 4 cm dla pierwszego roztworu do biegania i na około 6 cm dla drugiego roztworu do biegania. Aby załadować próbki, przed załadowaniem każdej nowej próbki umyj strzykawkę o pojemności 10 mikrolitrów w chloroformie: metanolu w proporcji 1:1.

Załaduj kroplami 10 mikrolitrów każdej próbki, starając się skoncentrować próbkę na jak najmniejszym obszarze. Umieść płytkę pionowo w pierwszej komorze z bieżącym roztworem pierwszym. Upewnij się, że płytka jest równoległa do ścianki szklanej komory, aby uzyskać równomierną prędkość migracji.

Należy zwrócić uwagę, aby płytki były umieszczone równolegle do tylnej ścianki szklanych komór i aby czoła rozpuszczalnika nie sięgały zbyt daleko, aby zapewnić skuteczne oddzielenie lipidów. Gdy linia rozpuszczalnika dotrze do pierwszego znaku, wyjmij płytkę, wysusz ją i umieść w drugim roztworze. Powtórz podobne kroki dla drugiego i trzeciego uruchomionego rozwiązania.

Pozostawić płytkę w roztworze do momentu, gdy czoło rozpuszczalnika dotrze do górnej części płytki. Następnie wyjmij płytkę i susz ją w temperaturze pokojowej przez minutę. Umieść płytkę w roztworze siarczanu miedzi na siedem sekund.

Po dokładnym wysuszeniu talerza pieczemy go w piekarniku przez siedem minut w temperaturze 170 stopni Celsjusza. Wyjmij talerz z piekarnika i pozwól mu ostygnąć. Aby wykonać HPLC, przymocuj kolumnę do wkładu ochronnego na instrumencie i podgrzej ją do 32 stopni Celsjusza.

Stosować metanol jako fazę ruchomą przy natężeniu przepływu 1 ml na minutę i ciśnieniu 65 barów. Ustaw detektor UV na pomiar przy 202 nanometrach, aby określić ilościowo ilość cholesterolu w każdej próbce. Przed analizą próbek należy dokładnie umyć maszynę HPLC i ustalić krzywą wzorcową cholesterolu zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Na koniec ponownie zawiesić próbki w 500 mikrolitrach chloroformu:metanolu w proporcji 1:1 w szklanych butelkach o pojemności 1,5 ml w kolorze bursztynowym z zakręcanymi czerwonymi pokrywkami z PTFE / białego silikonu przed załadowaniem ich do instrumentu HPLC. Pokazano tutaj profil lipidowy neutrofili na płytce HPTLC. Lipidy można zidentyfikować, porównując odległości migracji ze wzorcem.

Pokazano również chromatogram HPLC pokazujący dwa duże piki. Pierwszy pik tuż przed dwiema minutami to chloroform. Drugim dużym szczytem po pięciu minutach jest cholesterol.

Pokazano tutaj standardowe krzywe cholesterolu wyznaczone za pomocą HPLC i HPTLC. Krzywa wzorcowa uzyskana za pomocą HPLC jest liniowa w szerszym zakresie stężeń w porównaniu z krzywą wzorcową HPTLC. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wyizolować neutrofile pochodzące z ludzkiej krwi, a następnie przeanalizować ich skład lipidowy.

Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o założeniu rękawic nitrylowych w celu ochrony rąk przed niebezpiecznym narażeniem na działanie chloroformu:metanolu, a także o pracy pod wyciągiem. Przyszłe eksperymenty dostarczą dalszych informacji na temat mechanizmów związanych z powstawaniem NET i ogólnych funkcji neutrofili, które wciąż nie są w pełni poznane. Nie zapominaj, że praca z pierwotnymi komórkami pochodzącymi z ludzkiej krwi wymaga pozwolenia etycznego, a także odpowiednich środków ostrożności, takich jak praca w odpowiednim laboratorium bezpieczeństwa biologicznego, aby uniknąć ryzyka narażenia na ludzkie patogeny.

Wreszcie, celem naszego badania jest znalezienie nowych celów terapeutycznych przeciwko infekcji w oparciu o wrodzony układ odpornościowy, a zwłaszcza skład lipidów jest dla nas bardzo interesujący, ponieważ pomoże nam zrozumieć, dlaczego neutrofile działają przeciwbakteryjnie przeciwko infekcji.