Indukcja martwiczego zapalenia jelit w ludzkim nabłonkowym modelu enteroidalnym

Uzyskanie krypt pochodzących z ludzkiej tkanki jelita cienkiego — kanalików zawierających komórki macierzyste i różne typy komórek nabłonkowych.

Dodaj krypty jelitowe do schłodzonej matrycy piwnicznej.

Przenieś tę mieszaninę na płytkę wielodołkową, tworząc trójwymiarową kopułę.

Dodaj pożywkę wzrostową i inkubuj.

Komórki macierzyste samoorganizują się, namnażają i różnicują w wiele typów komórek jelitowych, tworząc enterosfery.

Z biegiem czasu enterosfery dojrzewają do enteroidów – trójwymiarowych, samoodnawiających się struktur, przypominających krypty jelitowe.

Dodaj lipopolisacharydy lub LPS, endotoksynę bakteryjną, do studzienki zawierającej enteroidy i inkubuj.

Cząsteczki LPS wiążą się z receptorem toll-podobnym w enteroidzie, inicjując odpowiedź prozapalną, w wyniku której dochodzi do akumulacji reaktywnych form tlenu. To uruchamia kaskadę zdarzeń prowadzących do apoptozy.

W konsekwencji integralność enteroidu jest zagrożona, co prowadzi do przenikania LPS do światła, co dodatkowo nasila reakcję zapalną.

Naśladuje to rozwój martwiczego zapalenia jelit, ciężkiego stanu zapalnego w jelitach wcześniaków.

W momencie pobierania na salę operacyjną należy umieścić próbkę ludzkiej tkanki jelita cienkiego w zimnym DPBS. Umyj próbkę w zimnym DPBS, aż będzie wolna od krwi i stolca.

Przechowuj próbkę w podłożu RPMI 1640 w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aż będzie gotowa do izolacji krypty. Gdy będziesz gotowy do kontynuowania, sprawdź ponownie, aby upewnić się, że próbka jest wolna od stolca i krwi. Za pomocą delikatnych nożyczek preparacyjnych usuń nadmiar tłuszczu lub klipsy chirurgiczne i zszywki. Zważ próbkę i celuj w kawałek o wadze około 0,75 do 2,5 grama.

Następnie pokrój tkankę na 0,5-centymetrowe kawałki i umieść je w probówce zawierającej 30 mililitrów buforu chelatującego #1. Wstrząsaj na niskich obrotach przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie przefiltruj tkankę przez sitko o średnicy 100 mikrometrów i odrzuć przepływ.

Dodaj przefiltrowaną tkankę do probówki zawierającej 30 mililitrów buforu chelatującego #2. Wstrząsaj na niskich obrotach przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przefiltruj tkankę przez filtr o średnicy 100 mikrometrów i odrzuć przepływ.

Następnie rozmrozić 500 mikrolitrów matrycy błony podstawnej na lodzie do późniejszego wykorzystania. Dodaj trochę tkanki do 10 mililitrów zimnego DMEM w 50-mililitrowej stożkowej tubie i energicznie potrząsaj ręcznie przez 10 sekund. Przefiltruj tę zawiesinę przez sitko o średnicy 100 mikrometrów i zbierz przepływ. Trzymaj tę rurkę na lodzie.

Dodaj trochę tkanki do kolejnych 10 mililitrów zimnego DMEM w osobnej stożkowej tubie o pojemności 50 mililitrów i energicznie wstrząsaj ręcznie przez 10 sekund. Przefiltruj tę zawiesinę przez sitko o średnicy 100 mikrometrów i zbierz przepływ.

Powtórz ten proces jeszcze dwa razy, aż pojawią się cztery stożkowe rurki zawierające przepływ, oznaczone od jednego do czterech. Następnie przefiltruj roztwór w probówce numer jeden przez 100-mikrometrowe sitko komórkowe i przenieś przepływ do 15-mililitrowej stożkowej probówki, również oznaczonej numerem jeden. Powtórz ten proces dla probówek od drugiej do czterech.

Odwirować 15-mililitrowe probówki 200 razy g i w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 15 minut. W okapie z przepływem laminarnym usuń supernatant z każdej probówki i wyrzuć go. Należy unikać rozerwania chmury tkanki znajdującej się bezpośrednio nad osadem, nawet jeśli oznacza to pozostawienie części supernatantu. W każdej probówce powoli pipetować w górę i w dół, aby wymieszać osad z pozostałym supernatantem.

Przenieś mieszaninę z każdej probówki do pojedynczej stożkowej probówki o pojemności 2 mililitrów i odwiruj w temperaturze 200 razy g i w czterech stopniach Celsjusza przez 20 minut. Następnie usuń supernatant i ponownie zawieś osad w 500 mikrolitrach wstępnie rozmrożonej matrycy membrany podstawnej.

Użyj schłodzonej końcówki pipety, aby nałożyć 50 mikrolitrów tej zawiesiny na środek dołka w 24-dołkowej płytce. Ta próbka powinna wyglądać na kopułę. Powtórz ten proces aplikacji dziewięć razy, aby wypełnić łącznie 10 studzienek.

Przenieś 24-dołkową płytkę do inkubatora z 5% dwutlenkiem węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza na 30 minut, aby umożliwić polimeryzację. Następnie dodaj 500 mikrolitrów ludzkiego mini-jelita kompletnego do każdej studzienki. Kontynuuj inkubację w tych samych warunkach, pamiętając o wymianie tej pożywki co dwa dni.