Metody hodowli do badania interakcji specyficznych dla wierzchołka przy użyciu modeli organoidów jelitowych

Badania te mają na celu dostarczenie solidnych i powtarzalnych systemów modelowych do przeprowadzania specyficznych dla orientacji badań nabłonka jelitowego. Organoidy wierzchołkowe mogą być generowane w dużych ilościach i dają nadzieję na przeprowadzenie badań przesiewowych o wysokiej przepustowości. Monowarstwy są łatwiejsze do manipulowania i oferują dostęp zarówno do znaków wierzchołkowych, jak i podstawnych.

Upewnij się, że rozmiar organoidów wynosi od 150 do 250 mikrometrów średnicy przed rozpoczęciem protokołu inwersji. Ostrożnie wyjąć i wyrzucić pożywkę z każdej studzienki zawierającej organoidy, nie naruszając kopuły ECM. Dodaj jeden mililitr lodowatego roztworu dysocjacyjnego do każdej studzienki i inkubuj płytkę w temperaturze pokojowej przez jedną minutę.

Ostrożnie usunąć kopułki, pipetując powoli powlekaną końcówką, uważając, aby nie naruszyć i nie rozdrobnić organoidów. Przenieść zawiesinę organoidów na płytkę potraktowaną roztworem zapobiegającym przyleganiu do zalążków i umieścić płytkę na wytrząsarce w temperaturze czterech stopni Celsjusza na 30 minut. Po 30 minutach wyjmij płytkę i delikatnie pipetuj roztwór w górę iw dół, używając jednomililitrowej końcówki pipety pokrytej roztworem zapobiegającym przywieraniu.

Umieść talerz na shakerze w temperaturze czterech stopni Celsjusza na kolejne 30 minut. Wyjąć płytkę i pozostawić organoidy grawitacyjnie osiadające przez jedną do dwóch minut w temperaturze pokojowej. Po opadnięciu organoidów usuń jak najwięcej roztworu dysocjacyjnego i umyj je, dodając 1,5 mililitra DMEM F-12.

Pozostawić organoidy do osadu i usunąć supernatant. Następnie powtórz pranie. Usuń jak najwięcej DMEM F-12 i dodaj 0,5 mililitra pożywki do ekspandowania organoidów jelitowych.

Inkubować przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Następnego dnia należy przeprowadzić częściową wymianę podłoża, przechylając płytkę pod kątem 25 do 30 stopni i usuwając podłoże wzdłuż ściany studni, uważając, aby nie usunąć zawieszonych organoidów. Dodaj 0,4 mililitra pożywki do ekspanderowania organoidów jelitowych i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez trzy dni.

Jeśli utworzyły się agregaty, użyj jednomililitrowej końcówki pipety pokrytej roztworem zapobiegającym przywieraniu, aby ścinać kruszywa, pipetując w górę iw dół 20 razy, jednocześnie dociskając koniec końcówki do dna płytki. Dodaj jeden mililitr wstępnie podgrzanej 0,05% trypsyny-EDTA, aby ponownie zawiesić organoidy. I dokładnie wymieszaj, aby zapewnić równomierną zawiesinę.

Dodaj do dodatkowego jednego mililitra trypsyny-EDTA dla dużej liczby komórek lub jeśli pozostaje znaczna ilość ECM. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć do 10 minut, a następnie dokładnie wymieszać pipetą o pojemności jednego mililitra, aby rozbić organoidy tak, aby całkowicie zdysocjowały na pojedyncze komórki lub małe fragmenty. Aby całkowicie oddzielić fragmenty lub całe organoidy, kontynuuj inkubację z trypsyną-EDTA w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez kolejne trzy do pięciu minut.

Gdy organoidy zostaną wystarczająco zdysocjowane, dodaj równą objętość DMEM F-12 i pipetuj w górę iw dół, aby dokładnie wymieszać. Dezaktywuj trypsynę-EDTA, dodając 10% FBS do komórek. Odwiruj fragmenty w temperaturze 200 razy G przez pięć minut w temperaturze od dwóch do ośmiu stopni Celsjusza.

Jeśli zdysocjowane organoidy nie zdołały się osadzić, dokładnie wymieszaj komórki, pipetując w górę iw dół, a następnie ponownie je odwiruj. Ostrożnie usunąć jak najwięcej supernatantu. pozostawiając tylko osad komórkowy.

Ponownie zawiesić komórki w 100 mikrolitrach pożywki do różnicowania organoidów jelitowych dla każdej studzienki, która ma być wysiana. Odpowiednie dostosowanie objętości do większych lub mniejszych rozmiarów studni. Usuń powlekane płytki z inkubatora i usuń nadmiar roztworu matrycy membrany podstawnej z każdej studzienki.

Dodać 100 mikrolitrów zawiesiny komórkowej do górnej studzienki każdej wkładki do hodowli komórkowej i 500 mikrolitrów pożywki do różnicowania organoidów jelitowych do dolnej studzienki. Następnie inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Wymieniaj pożywkę zarówno w górnej, jak i dolnej studzience co dwa do trzech dni.

Aby ustalić hodowlę ALI, usuń pożywkę z górnej i dolnej studzienki i dodaj świeżą pożywkę różnicującą organoidy jelitowe do dolnej studzienki, pozostawiając górną studzienkę pustą. Organoidy jelitowe hodowane z pożywką do ekspandowania organoidów jelitowych wykazywały morfologię torbielowatą. Po usunięciu ECM niektóre organoidy mają tendencję do agregacji w ciągu pierwszych trzech dni i muszą być prześwietlane, aby zwiększyć liczbę organoidów.

Organoidy jelitowe hodowane w ECM nadal się rozwijały i wykazywały spontaniczne tworzenie drugorzędowych struktur pączkujących. Organoidy utrzymywane przez pięć dni przy braku macierzy zewnątrzkomórkowej wykazywały wydłużone, torbielowate i nieregularne formy. Ekspresję nietypowych markerów, takich jak villin i ZO-1, wykryto po zewnętrznej stronie nabłonka, która została wystawiona na działanie pożywki.

Organoidy osadzone w ECM barwione pod kątem jąder, villin i ZO-1 wykazujące wierzchołkową polaryzację podstawową, w której strona wierzchołkowa była skierowana w stronę światła organoidu. Po ustaleniu monowarstwy komórki utworzyły ścisłe połączenia i warstwę zlewającą się. Warstwa zlewająca się orientuje również swoją granicę szczoteczki zawierającą kosmyki w kierunku wierzchołkowej strony nabłonka, tworząc kompleksy wielobiałkowe ZO-1 między komórkami.

Przejście do hodowli ALI wywołało dalsze różnicowanie z bardziej widocznymi komórkami kubkowymi, co zostało uwidocznione przez barwienie wydzielanego białka mucyny MUC2 Aby wywołać odwrócenie polarności, ważne jest, aby usunąć cały ECM bez zakłócania lub fragmentacji organoidów. Zmiany podłoża należy również dokonywać ostrożnie, aby uniknąć usunięcia któregokolwiek z zawieszonych organoidów. Zapewnienie wystarczającej liczby pojedynczych komórek do założenia kultury jednowarstwowej jest głównym wyznacznikiem jej jakości.

Specyficzne funkcje wierzchołkowe, takie jak wchłanianie składników odżywczych lub interakcje patogenów gospodarza, można teraz badać w odpowiednich systemach, które odpowiadają potrzebom naukowców.